苦參堿衍生物體外抑制白色念珠菌生長及其作用機制

Inhibition of the growth of Candida albicans in vitro by matrine derivatives and its mechanism of action

HU Xin-yu1 ，GONG Pin^1? ，FANG Wen-jingl，KE Ying-ying1 ， LONG Hui1，WU Xian-rong2，XIE Jian-wu3

（1.School of Food Science and Enginering，Shaanxi University of Scienceamp; Technology，Xi'an 710021，China；2. Xi'an Gaoxin No.1 Fengdong High School，Xi'an 710021， China; 3.Jinhua Advanced Research Institute，Jinhua 321015，China）

Abstract：Candida albicans is a common human pathogen that can cause candida vaginitis. Candida vaginitis is a common mucosal infection of the female reproductive tract. The common symptoms include vaginal itching，pain，redness，etc. At the same time，the recurrence rate is high，which causes serious distress to female patients. In the present study，a series of experiments were carried out to investigate the inhibitory effect of matrine and its derivative a～h on Candida albicans and its mechanism of action. The MIC of matrine was 5mg/mL ， and the MIC of matrine derivative c was 0.625mg/mL .After derivatization，the antibacterial activity of matrine derivatives Was significantly better than that of matrine.By monitoring the growth of Candida albicans，it can be obtained that derivative c can inhibit the growth of Candida albicans and prolong its slow growth period. The results of field emisson scanning electron microscopy showed that the Candida albicans after the treatment of derivative c had broken，deformed and depressed on its surface.By detecting the leakage of cellular proteins， the membrane permeability of Candida albicans was increased after matrine derivative c treatment.By propidium iodide staining，N-phenyl-1-naphthylamine staining and β -galactosidase assay，it was further verified that matrine derivative c could destroy the cell membrane of Candida albicans，increase the permeability of cell membrane，and cause the death of Candida albicans.Rhodamine 123 staining was used to explore the changes in the membrane potential of Candida albicans under the action of matrine derivative c，and it was found that matrine derivative c could destroy the membrane potential of Candida albicans，thereby affecting the normal physiological activities of bacteria and eventually causing the death of Candida albicans.The level of reactive oxygen species （ROS） in the cytoplasm of Candida albicans was determined using 2，7-dichlorofluorescein diacetate，and the results showed that the oxidation-reduction balance of Candida albicans was disrupted by the alkaloid derivative c of matrine，leading to a large accumulation of ROS and cell death. Through a series of experiments，it was found that matrine and its derivatives can inhibit the growth of Candida albicans by disrupting the structure of the cell membrane and increasing its permeability，providing a new idea for the mechanism of matrine inhibiting Candida albicans.It is expected to provide new ideas and strategies for the treatment of candidal vaginitis.

Key words：matrine;antibacterial activity; Candida albicans ; cell membrane permeability

0 引言

白色念珠菌是一種常見的人源性致病菌，可以引起念珠菌性陰道炎↓、口腔白色念珠菌病等.念珠菌性陰道炎是一種常見的女性生殖道黏膜感染，常見的癥狀包括陰道瘙癢、疼痛、發紅等[3]，同時復發率高，給女性患者造成嚴重困擾.隨著抗真菌藥物的耐藥性的增加，中藥對白色念珠菌的治療作用逐漸開始受到重視且更容易被患者接受，中醫臨床上多用蛇床子和苦參、黃柏、冰片等配伍外用，抑菌作用良好[4].

苦參，除青海、新疆外，國內各地均有分布.中藥苦參常用于治療婦女赤白帶下、陰腫陰癢[5]，目前已有超過400種含苦參的藥品投入臨床使用，且劑型豐富[.其中，較為常見的有栓劑、凝膠和洗劑等，如苦參堿栓、苦參凝膠、陰炎凈[7]、舒陰洗液[8]、五柏參洗液9等，都在臨床上取得了良好療效.苦參作為該類制劑的君藥，苦參堿（MT）為苦參藥材的主要成分，具有抗腫瘤[10]、抗病毒[11]、抗炎[12]、抗菌[13等多種藥理活性.但是由于苦參堿的抑菌效果有限，而將藥物衍生化往往能發現活性更佳的化合物，所以希望可以通過衍生化這一途徑，提高苦參堿類的抑菌活性.本文選用了本課題組前期研究合成得到的8個苦參堿衍生物（如圖1所示）[14]進行其體外抑菌活性的探究，以期尋找到抑菌效果更佳的化合物.

1 材料與方法

1. 1 實驗材料與儀器

1. 1. 1 實驗試劑

苦參堿（MT），含量 ≥98% ，上海麥克林生化科技股份有限公司；苦參堿衍生物 a～h 由本實驗室合成得到；伊曲康唑， 0.1g/ 粒，西安楊森制藥有限公司.

白色念珠菌，SC5314，購自中國菌種資源庫.

酵母膏、蛋白肺、瓊脂粉，北京奧博星生物技術有限公司；N-苯基-1-萘胺、羅丹明123、鄰硝基苯-β -D-吡喃半乳糖苷，均 HPLC?98% ；蛋白檢測試劑盒、碘化丙啶PI染色液，上海源葉生物科技有限公司；ROS熒光檢測試劑盒，西安奧銳精創生物科技有限公司.

二甲基亞礬、甲醇、無水乙醇、乙酸異戊酯、戊二醛 25% 溶液，分析純AR級別，國藥集團化學試劑有限公司.

1. 1. 2 實驗儀器及設備

1300 series A230% 超凈工作臺，美國Ther-mo公司；VarioskanFlash全波長掃描式多功能讀數酶標儀，賽默飛世爾科技有限公司；MQT-50恒溫振蕩培養箱，上海旻泉儀器有限公司；WH-2微型渦旋混合儀，上海滬西分析儀器廣有限公司； H- 1850R 臺式高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；LSM800激光共聚焦熒光顯微鏡，德國蔡司；Verios460場發射掃描電鏡，飛昱科技股份有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 測定苦參堿及其衍生物的最小抑菌濃度

將白色念珠菌活化并培養過夜，菌液濃度調整為 1～7×10⁵CFU/mL ，備用.將苦參堿及其衍生物溶于二甲基亞礬（DMSO）中，再用酵母浸出粉脈葡萄糖培養基（YeastExtractPeptoneDextroseMedi-um ，YPD液體培養基）采用二倍稀釋法[15]將各藥物濃度調整至 5mg/mL.2.5mg/mL.1.25mg/mL 0.625mg/mL0.3125mg/mL0.15625mg/mL （204在96孔板中，設置空白對照組、生長對照組、陽性對照組和不同濃度的待測藥物組.其中選用伊曲康唑（Itr）作為陽性藥物，其濃度為 10mg/mL. 每組設置6個重復，置于 30°，100r/min 恒溫振蕩條件下培養 8h 后，采用多功能讀數酶標儀在 600nm 測量各孔吸光度（ ΔOD₆₀₀ ）.

1.2.2 苦參堿衍生物對白色念珠菌生長的影響

參考Diao等[16]的方法并稍加調整.將白色念珠菌活化并培養過夜，菌液濃度調整為 1～3×10³ CFU/mL ，備用.設置空白對照組、陽性對照組、MIC組和2MIC組，其中MIC組和2MIC組的藥物為1.2.1中篩選出的抑菌效果最好的苦參堿衍生物c.以不添加藥物的作為空白對照組，以加入伊曲康唑（Itr）的為陽性對照組；向菌液中分別加入終濃度為MIC和2MIC的衍生物c，作為實驗組.將96孔板置于 恒溫振蕩條件下培養 24h. 分別于 0h，2h，4h，6h，8h，10h， 12h.24h 取樣，采用多功能讀數酶標儀測量各組在 600nm 下的吸光度，得到苦參堿衍生物c對白色念珠菌生長的影響.

1.2. 3 苦參堿衍生物對白色念珠菌形態的影響

參考Kang等[17的方法并稍加調整.將白色念珠菌活化并培養過夜，將菌液濃度調整至 1×10⁷ CFU/mL .組別設置參考1.2.2.將各組菌液置于 恒溫振蕩條件下培養 ⁶h 取10mL 菌液在5 000r/min 、4 ^°C 條件下離心10min ，收集菌體沉淀.將菌體沉淀用無菌磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌3次后，重懸于 4mL 無菌PBS溶液中.取 1mL 菌液于 1.5mL 離心管中，于8000r/min.4C 條件下離心 5min ，棄上清.向菌體沉淀中加入 1mL2.5% 的戊二醛溶液，于 4° 靜置過夜后，于 8000Δr/min.4C 條件下離心 5min 將菌體沉淀用PBS溶液洗滌3次后，依次通過30%.50%.70%.90%.100% 的乙醇溶液進行脫水處理，于 8000r/min.4C 條件下離心 5min 向菌體沉淀中加入 1mL 的乙酸異戊酯，于 4° 靜置 30min 后，于 8000r/min.4C 條件下離心5min ，收集菌體沉淀.將菌體進行冷凍干燥 3～ ，至菌體呈粉末狀.噴金，通過場發射掃描電鏡觀察菌體形態.

1.2.4 苦參堿衍生物對白色念珠菌蛋白質泄露的影響

將白色念珠菌活化并培養過夜，將菌液濃度調整至 1×10⁷ CFU/mL.組別設置參考1.2.2.將各組菌液置于 30°，100r/min 恒溫振蕩條件下培養⁶h 取 5mL 菌液于 4 ^°C 離心10min ，收集菌體沉淀，用蛋白定量試劑盒按照說明書方法對蛋白含量進行測定.

1.2.5 苦參堿衍生物對白色念珠菌細胞活力的影響

參考Tan等18的方法并稍加調整.將白色念珠菌活化并培養過夜，將菌液濃度調整至 1×10⁷ CFU/mL.組別設置參考1.2.2.將各組菌液置于 恒溫振蕩條件下培養 ⁶h 取10mL 菌液于 5000r/min.4C 離心 10min ，收集菌體沉淀.將菌體沉淀用無菌PBS溶液洗滌3次后，重懸于 4mL 無菌PBS溶液中.向 1mL 菌液中加入 20μL 濃度為 30μg/mL 的碘化丙啶（PI）溶液，于 37° 避光反應 30min .用PBS溶液洗滌3～5 次，確保洗去多余染料后，再將菌體沉淀重懸于PBS溶液中.樣品通過激光共聚焦熒光顯微鏡，在 488nm 的激發波長下檢測紅色熒光.

1.2.6 苦參堿衍生物對白色念珠菌細胞外膜通透性的影響

參考林鑫[19的方法并稍加調整.將白色念珠菌活化并培養過夜，將菌液濃度調整至 1×10⁷ CFU/mL.組別設置參考1.2.2.將各組菌液置于30°，100r/min 恒溫振蕩條件下培養 6h ·收集菌體沉淀，具體操作參考1.2.5.將菌體沉淀重懸于4mL 無菌PBS溶液中.熒光染料N-苯基-1-萘胺（NPN）先用DMSO溶解，再用甲醇稀釋至10μmol/L .向 1mL 菌液中加入 NPN溶液，于室溫下避光孵育 20min. 用PBS溶液洗滌3～5 次，確保洗去多余染料后，再將菌體沉淀重懸于PBS溶液中.樣品通過激光共聚焦熒光顯微鏡觀察熒光，激發波長為 350nm ，發射波長為420nm

1.2.7 苦參堿衍生物對白色念珠菌細胞內膜通透性的影響

參考辛海云[20]的方法并稍加調整.將白色念珠菌活化并培養過夜，將菌液濃度調整至 1×10⁷ CFU/mL.組別設置參考1.2.2.將各組菌液置于30 恒溫振蕩條件下培養 6h. 收集菌體沉淀，具體操作參考1.2.5.將菌體沉淀重懸于 4mL 無菌PBS溶液中.向 1mL 菌液中加入 50μL 濃度為 30mmol/L 的鄰硝基苯 ??β -D-吡喃半乳糖苷（ONPG）溶液，于室溫避光反應 30min ，采用酶標儀在 420nm 處測量各組吸光度.

1.2.8 苦參堿衍生物對白色念珠菌細胞膜電位的影響

參考Dai等[21]的方法并稍加調整.將白色念珠菌活化并培養過夜，將菌液濃度調整至 1×10⁷ CFU/mL .組別設置參考1.2.2.將各組菌液置于30°，100r/min 恒溫振蕩條件下培養 6h. 收集菌體沉淀，具體操作參考1.2.5.將菌體沉淀重懸于4mL 無菌PBS溶液中.向 1mL 菌液中加入 20μL 濃度為 30μmol/L 羅丹明123溶液，于室溫下避光反應 30min. 用PBS洗滌 3～5 次，確保洗去多余染料后，再將菌體沉淀重懸于PBS溶液中.樣品通過激光共聚焦熒光顯微鏡觀察熒光，激發波長為507nm ，發射波長為 529nm

1.2.9 苦參堿衍生物對白色念珠菌ROS的影響

參考Gong等[22]方法并稍加調整.將白色念珠菌活化并培養過夜，將菌液濃度調整至 1×10⁷ CFU/mL .組別設置參考1.2.2.將各組菌液置于 恒溫振蕩條件下培養 6h. 取 10mL 菌液于 離心 10min ，收集菌體沉淀.將菌體沉淀用無菌PBS溶液洗滌3次后，重懸于 2mL 濃度為 10μmol/L 的2，7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）溶液中.于 37° 避光反應30min.用PBS洗滌 3～5 次，確保洗去多余染料后，再將菌體沉淀重懸于PBS溶液中.樣品通過激光共聚焦熒光顯微鏡觀察熒光，激發波長為 488nm ，發射波長為 525nm

1.2.10 數據處理

實驗數據使用GraphPadPrism8.O.O版Windows（GraphPad Software，San Diego，Califor-niaUSA）進行分析并繪制圖片.單因素方差分析（ANOVA）用來檢驗分析顯著性水平，當 Δplt;0. 05 時，差異被視為有統計學意義.

2 結果與討論

2.1最小抑菌濃度（MIC）的測定

最小抑菌濃度是指能夠抑制細菌生長的藥物最低濃度，采用二倍稀釋法考察苦參堿衍生物對白色念球菌的抗菌活性，苦參堿及其衍生物的MIC值如表1所示.苦參堿的MIC值為 5mg/mL ，苦參堿衍生物 a～h 的MIC值均得到大幅降低，其中，衍生物c的MIC值最低，為 0.625mg/mL ，這表明衍生物c的抑菌活性最好，且明顯優于苦參堿.在后續的實驗中，選用衍生物c作為待測藥物進行實驗.

2.2苦參堿衍生物c對白色念珠菌生長情況的 影響

在衍生物c的作用下，白色念珠菌在 24h 內600nm 下吸光度的變化如圖2所示.空白對照組中的白色念珠菌在 24h 內經歷緩慢生長期和對數生長期.陽性對照組中，經伊曲康唑作用的白色念珠菌的緩慢生長期得到延長，在 12h 后才進人對數生長期.經MIC濃度苦參堿衍生物c處理的白色念珠菌的生長受到了小幅度抑制；經2MIC濃度苦參堿衍生物c處理的白色念珠菌的生長受到了明顯的抑制，其緩慢生長期得到延長， 24h 后也未達到對數生長期.這一結果表明，低濃度的苦參堿衍生物c可以延緩白色念珠菌的生長速度，而高濃度的苦參堿衍生物c能夠基本完全抑制白色念珠菌的生長，其抑菌效果甚至更優于陽性藥物伊曲康唑.

通過掃描電鏡觀察苦參堿衍生物c對白色念珠菌微觀上的影響.如圖3所示，空白模型組的白色念珠菌，菌體大多表面光滑，形態完整，呈橢圓狀或球狀（如圖3（a）所示）.經過MIC濃度的苦參堿衍生物c處理的白色念珠菌，可以明顯觀察到其菌體已經破裂，并且表面出現變形、凹陷等情況（如圖3（b）所示）.苦參堿衍生物c可能通過破壞白色念珠菌的表面結構及細胞膜的完整性，達到抑制其生長的作用.

圖4是白色念珠菌胞內蛋白質的含量的變化.由圖中可以看出，對照組中的白色念珠菌的蛋白質含量較高，為 85.28±0.31μg/mL ;經伊曲康唑和MIC濃度的苦參堿衍生物c處理后的白色念珠菌的蛋白含量降低（ ，分別為 67.83± 0.75μg/mL 和 62.21±1.77μg/mL ;經2MIC濃度的苦參堿衍生物c處理后的白色念珠菌的蛋白含量大幅降低 （plt;0. 001） ，為 14.98±2.14μg/ mL.結果表明苦參堿衍生物c破壞了白色念珠菌的細胞膜，導致大量蛋白質泄露.

2.5苦參堿衍生物c對白色念珠菌細胞活力的影響

在圖5（a）中，空白對照組細胞照片中沒有紅色熒光.在圖5（b）中，陽性對照組細胞照片中可見大量紅色熒光.圖5（c）和圖5（d）分別為經MIC和2MIC濃度苦參堿衍生物c處理的白色念珠菌，在圖5（c中，可見少量紅色熒光，在圖5（d）中，可見大量明顯的紅色熒光.

在正常活細胞中，碘化丙啶不能透過細胞膜，當細菌發生死亡，細胞膜遭到破壞，碘化丙啶也就能透過細胞膜進入到細胞內，與遺傳物質結合，便可以激發出紅色熒光[23].這表明在苦參堿衍生物c的作用下，白色念珠菌出現大量死亡，細胞膜的通透性得到提高，細胞膜的完整性遭到破壞，且呈現濃度依賴性.這些結果都表明苦參堿衍生物c可以損傷白色念珠菌的細胞膜，增加細胞膜的滲透性，造成白色念珠菌的死亡

2.6苦參堿衍生物c對白色念珠菌外膜通透性的影響

在圖6（a）中，空白對照組細胞照片中沒有藍色熒光，說明NPN無法穿過細胞外膜，表明了細胞外膜的完整性.在圖6（b）中，陽性對照組照片中可見大量藍色熒光.圖6（c）和6（d）分別為經MIC和2MIC濃度苦參堿衍生物c處理的白色念珠菌.在圖6（c）中，可見少量藍色熒光，圖6（d）中可見大量明顯的藍色熒光.

NPN是一種疏水性熒光探針，在細胞膜完整的時候，它不能穿過細菌細胞的外膜，如果外膜受到破壞，NPN將接觸到細胞質膜中的磷脂，發出強烈藍色熒光[24].這表明經過苦參堿衍生物c處理的白色念珠菌的細胞外膜遭到嚴重破壞，且呈現濃度依賴性，大量NPN可以與細胞質膜中的磷脂發生結合，發出藍色熒光.這些結果都表明苦參堿衍生物c可以損傷白色念珠菌的細胞外膜.

2.7苦參堿衍生物c對白色念珠菌內膜通透性的影響

如圖7所示，空白對照組的白色念珠菌在420nm 處的吸光度較低，為 0.24±0.02 .陽性藥物組的白色念珠菌在 420nm 處的吸光度顯著增大（ ），數值為 0.54±0.02 .在苦參堿衍生物c作用后的組別中，MIC組和2MIC組的 OD₄₂₀ 均出現明顯升高（ ），數值分別為 0. 40± 0.01和 0.58±0.01

β-半乳糖苷酶（β一Galactosidase）是定位于細胞膜上的一種酶，它能降解乳糖[25]，其中鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）能被 β 半乳糖苷酶降解為乳糖-O-硝基酚（ONPG），其最大吸收峰為 420nm 這一結果表明白色念珠菌經過苦參堿衍生物c作用后，其內膜的通透性增加，使得ONPG能夠進入細胞內部發生反應，從而能夠在 420nm 有吸收.

2.8苦參堿衍生物c對白色念珠菌膜電位的影響

在圖8（a）中，空白對照組的細胞照片中可見明顯綠色熒光，說明空白對照組的白色念珠菌具有正常的膜電位及線粒體.在圖8（b）中，陽性對照組的熒光強度顯著下降，說明白色念珠菌的膜電位失衡.圖8（c和圖8（d）分別為經MIC和2MIC濃度苦參堿衍生物c處理的白色念珠菌，可以觀察到圖8（c）中的綠色熒光明顯下降，圖8（d）的熒光強度與陽性組相比，沒有明顯差異，只能看到少量微弱熒光.

羅丹明123是一類能通過細胞膜對線粒體進行特異性標記的陽離子型黃綠型熒光染料，在細胞凋亡/程序性壞死過程中，線粒體膜電位下降，線粒體跨膜電位失衡，線粒體被大量釋放到胞漿中，導致其產生的黃綠色熒光強度顯著下降.這表明苦參堿衍生物c能夠破壞白色念珠菌的膜電位，導致線粒體跨膜電位失衡，線粒體被大量釋放到胞漿中，進而影響細菌的正常生理活動，最終造成細菌的死亡.

2.9苦參堿衍生物c對白色念珠菌ROS的影響

在圖9（a）中，空白對照組的圖中沒有綠色熒光.在圖9（b）中，陽性對照組細胞照片中可見大量綠色熒光，說明該組細胞中有大量ROS的積累.圖9（c）和圖9（d）分別為經MIC和2MIC濃度苦參堿衍生物c處理的白色念珠菌，在圖9（c）中，可見少量綠色熒光，在圖9（d）中，可見大量明顯的綠色熒光，且熒光的強度與苦參堿衍生物c的濃度呈正相關.

DCFH-DA可以通過細胞膜向細胞內部擴散，并在胞內ROS的氧化作用下轉化為綠色熒光物質?2^′，7^′ -二氯熒光素（DCF），DCF與胞內活性氧的水平呈正相關.這些結果表明在苦參堿衍生物c的作用下，白色念珠菌細胞內的氧化還原失衡，造成ROS的大量積累，導致細胞功能和膜系統受到損傷，進而導致細胞的死亡.

3結論

本文研究了苦參堿及其衍生物對白色念珠菌的抑菌活性和細胞膜通透性的影響.其中苦參堿MT的 MIC=5mg/mL ，苦參堿衍生物c的MIC=0.625mg/mL ，通過衍生化后，苦參堿衍生物的抑菌活性都明顯優于苦參堿.通過對白色念珠菌生長情況的監測，可以得到化合物c可以抑制白色念珠菌的生長，延長其生長緩慢期.通過掃描電鏡發現，經過苦參堿衍生物c處理的白色念珠菌，其菌體已經破裂，可以觀察到細胞表面出現變形、凹陷等情況.

通過檢測細胞內蛋白質的泄露，以及PI染色，NPN染色和 β 半乳糖苷酶含量的測定，驗證了苦參堿衍生物c對白色念珠菌的細胞膜有破壞作用，改變白色念珠菌細胞膜的通透性，進而造成白色念珠菌的死亡.通過羅丹明123染色，發現苦參堿衍生物c能夠破壞白色念珠菌的膜電位，進而影響細菌的正常生理活動，最終造成白色念珠菌的死亡.最后，采用DCFH-DA熒光探針，表明苦參堿衍生物c可以導致白色念珠菌的氧化還原失衡，造成ROS的大量積累，導致菌體死亡.

通過一系列實驗，探究了苦參堿衍生物體外抑制白色念珠菌生長的活性及其對細胞通透性的影響，為苦參堿抑制白色念珠菌的機制提供思路.苦參堿經過衍生化后，其抑制白色念珠菌的活性得到了提高，但其構效關系需要進一步探究.

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【責任編輯：陳 佳】