工程納米氧化鋅暴露下的土壤微生物生態(tài)彈性評價

Study on the ecological resilience of soil microbiota under exposure to zinc oxide engineered nanoparticles

ZHU Chao1，DING Ze¹ ，TAO Kun² ，MENG Zhi-qian1， HE Miao，ZHAO Yi¹ ， NAN Kang-kang

（1.School of Environmental Science and Engineering，Shaanxi University of Science amp;. Technology，Xi'an 710021，China；2.Xi'an Eureka Environmental Protection Technology Co.，Ltd.， Xi^′ an 710016，China; 3.School of Art and Design，Shaanxi University of Science amp; Technology，Xi'an 710o21，China；4.Sch Environm，Hangzhou Institute for Advanced Study，UCAS，Hangzhou 31o024，China）

Abstract：Nano zinc oxide （ Z_nO. ），an essential nanomaterial，is extensively used in industrial and consumer products. This widespread application has significantly increased its environmental exposure and accumulation，necessitating a comprehensive evaluation of its ecological risks.This study evaluated the mid-term and long-term effects of Z_nO engineered nanomaterials（ Z_nO-ENs ） on soil microorganisms and their ecological resilience through acute 0 Ω₂₀₀mg/L，7 days） and chronic exposures at different levels （0，10，100，500mg/kg for 30， 90，and 12O days）.Results indicated that under acute exposure，total protein content，total antioxidant capacity （T-AOC），and superoxide dismutase （SOD） activity of mixed cultures were significantly higher than those of pure cultures （ plt;0. 05） ，suggesting that microbial community diversity is fundamental to their ecological resilience. Carbon metabolic fingerprint analysis revealed that the effects of Z_nO-ENs were concentration-and time-dependent， with 10mg/kg exposure showing no significant impact on microbial metabolic activity. Shortterm exposure at 100mg/kg significantly inhibited metabolic activity but exhibited some recovery in long-term exposure，indicating partial ecological resilience. High concentration exposure （500mg/kg ） caused more significant and sustained effects.16S rDNA sequencing results showed that short-term exposure to ZnO-ENs increased the abundance of Firmicutes， Actinobacteria，and Proteobacteria，while long-term exposure inhibited their growth and led to the emergence of new taxons including Ignavibacteriae，Elusimicrobia，and Chlorobi. Overall，soil microbial communities exposed to low concentrations of Z_nO -ENs demonstrated good ecological resilience under mid-term and long-term exposure. Medium concentration exposure showed partial functional recovery，whereas high concentration long-term exposure resulted in sustained significant effects on microbial metabolic functions and community structure，lacking ecological resilience characteristics.

Key words： zinc oxide engineered nanoparticles； soil microbiota；carbon metabolic fingerprinting；ecological resilience

0 引言

氧化鋅工程納米顆粒（ Z_nO Engineered Nano-particles， Z_nO-ENs） 通常指通過工程學方法人為設計和制造的納米氧化鋅顆粒，具有可控的尺寸、形貌和表面特性.因其獨特小尺寸效應和表面效應，而被廣泛應用于工業(yè)產品（如電子產業(yè)、生物醫(yī)藥、制藥業(yè)、環(huán)境修復、環(huán)境分析、催化劑、材料科學）及日常消費品（如服裝、防曬霜、化妝品）中[1-4].

隨著ZnO-ENs生產、利用與廢棄量增加的同時也增大了其在環(huán)境中的暴露幾率，尤其是陸地生態(tài)系統(tǒng)[5.6].與自然生成或普通合成的氧化鋅納米顆粒相比， Z_nO-ENs 通常具有更均一的粒徑分布、特定的形貌和表面修飾，這些特性可能導致其在環(huán)境中的遷移轉化和生物效應存在差異.大量研究表明ZnO-ENs可以通過空氣、水體和土壤等多途徑進人環(huán)境，并對細胞及微生物產生毒性效應，對生態(tài)系統(tǒng)造成潛在威脅[7-10].土壤作為陸地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在物質循環(huán)、能量流動和污染物遷移轉化中發(fā)揮著關鍵作用.土壤微生物是土壤最活躍的組分之一，與土壤理化性質密不可分，在維持土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡、改善土壤結構等過程中發(fā)揮著至關重要的作用.外源污染物一旦進人土壤環(huán)境，會干擾土壤微生物的生長，破環(huán)微生物群落結構和代謝功能，從而進一步影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的平衡[11].因此，評估納米氧化鋅（nano- ΔZ_nO n-Zn（Σ） ）等工程納米材料（Engineered Nano Materials，ENMs）對土壤微生物的生態(tài)風險，對ENMs的綠色設計及安全使用具有重要指導意義.

已有研究表明， n-ZnO 可以在納米材料生產、產品使用及廢棄物管理過程中釋放到生態(tài)系統(tǒng)，并在水體沉積物 （1300ta^-1 ）和土壤 （300ta^-1 ）中積累，可通過直接與細胞膜接觸、跨膜擴散導致細胞損傷或釋放 Zn²⁺ 離子導致金屬毒性等途徑對土壤微生物造成影響[12.13].然而已有報道多為 ZnO- ENs急性暴露下的微生物毒性效應，且供試微生物多為純培養(yǎng)模式，毒性評價指標也多為微生物生理生化指標，不能客觀反應實際暴露環(huán)境和模式下Z_nO-ENs 的生態(tài)效應[14-16].生態(tài)彈性是指生態(tài)系統(tǒng)在遭受干擾或壓力后，恢復到其原始狀態(tài)或功能的能力[17].這種彈性可以幫助生態(tài)系統(tǒng)抵御外界的變化和干擾，包括自然災害和人為因素的影響.生態(tài)系統(tǒng)的彈性能力越強，其恢復原有生態(tài)平衡的能力就越強.

因此，在評估外源脅迫，如污染物對土壤環(huán)境的影響時，考察微生物的生態(tài)彈性可以提供重要的見解.通過評估 Z_nO-ENs 長期暴露下土壤環(huán)境中微生物的生態(tài)彈性，可以更全面地反映土壤生態(tài)系統(tǒng)對ZnO-ENs的響應、適應和恢復能力.這比單純評估ZnO-ENs的濃度或是土壤理化性質的變化更能反映出土壤環(huán)境的生態(tài)效應和健康狀況.

本研究擬對黃土區(qū)土壤環(huán)境下不同ZnO-ENs暴露水平（濃度和時間）對土壤微生物的群落的影響開展系統(tǒng)評估，聚焦微生物的生理生化響應、代謝功能和群落結構的動態(tài)變化，驗證土壤微生物對于ZnO-ENs干擾下的生態(tài)彈性并揭示其機制，這可以為科學認識納米材料的生態(tài)環(huán)境風險提供理論參考，有助于指導相關污染土壤生態(tài)修復.

1實驗部分

1. 1 實驗材料

1. 1.1 土壤及采樣方法

實驗用土屬于黃土，是多孔性具柱狀節(jié)理的黃色粉性土采自陜西延長縣蘭街村果園 ?^′′110^°15^′ 54.08^′′E，36^°33^′59.26^′′N） .采用棋盤式布點法多點取樣，取樣深度 0～40cm 混合土樣，剔除土樣中的石塊及動植物殘體并過篩（16目，約 1mm .待土樣自然風干后裝入3個直徑 6cm 高 20cm 的柱形容器中，土重 500g ，加水至土壤達到田間持水量的 40% （約 100mL） ），靜置一天使水分均勻分布.

1.1.2 ZnO-ENs分散液的制備

本實驗使用的 Z_nO-ENs 為商業(yè)購買的工程納來顆粒（上海邁坤化工有限公司），形貌為球形，平均粒徑為 30±5nm ，粒徑分布范圍為 20～40nm ，無表面修飾，純度 99.9% ，在 pH 7. 0 的去離子水中Zeta電位為 -15±2mV. 稱取 1g 分散劑（檸檬酸鈉）于干凈燒杯中，加入 ¹L 去離子水將其置于磁力攪拌器上加速溶解，使用精密稱量設備稱取所需量 Z_nO-ENs 慢慢加入溶解好的分散劑水中，邊加邊攪拌防止顆粒團聚，再將混合液置于超聲波清洗器下進行超聲波處理 ¹h 以形成穩(wěn)定的納米顆粒分散液，調節(jié)pH值到7.0.將制備好的分散液存儲于干凈的玻璃瓶中，使用前再進行短時間超聲波處理.

1. 1. 3 實驗藥品及儀器

本實驗使用的 Z_nO-ENs 購自上海邁坤化工有限公司.使用藥品有氯化鈉、冰乙酸和 95% 乙醇購自天津市耀華化學試劑有限責任公司，均為分析純；LB肉湯購自杭州百思生物技術有限公司.蛋白定量測定試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒、過氧化氫 （H₂O₂ ）測定試劑盒、總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）試劑盒、總超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒和土壤

DNA提取試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；使用的ECO板為96孔，購自美國BIOLOG公司.使用儀器有電子天平（賽多利斯儀器有限公司，北京），立式壓力蒸汽滅菌器（申安醫(yī)療器械廠，上海），渦旋混合器（白塔新寶儀器廠，江蘇），高速冷凍離心機（中科中佳科學儀器有限公司，安徽），電熱恒溫水浴鍋（泰斯特儀器有限公司，天津），可見光分光光度計（上海精科實業(yè)有限公司，上海），酶標儀（Thermo公司，美國），大型恒溫振蕩器（恒科學儀器有限公司，上海），低溫超聲波萃取器（上海喬躍電子科技有限公司，上海），可見光分光光度計（尤尼柯儀器有限公司，上海）.

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設置

（1）土壤微生物培養(yǎng)物急性暴露實驗

在LB固體培養(yǎng)基涂布土壤浸提液進行土壤微生物群落的培養(yǎng)，從平板中挑取單獨菌落至LB液體培養(yǎng)基，于恒溫振蕩器中以 進行擴培，得到土壤微生物純培養(yǎng)物；挑取多個不同菌落進行相同方式擴培得到混合培養(yǎng)物，以上兩類培養(yǎng)物用作后續(xù)急性暴露實驗.在 Z_nO-ENs 濃度分別為 0mg/L （對照）和 200mg/L 下進行土壤微生物純培養(yǎng)物和混合培養(yǎng)物的急性暴露，暴露體系為 50mL ，通過培養(yǎng)物稀釋確保體系中初始微生物濃度為 1.2～1.5×10⁵ CFU/mL，室溫條件下培養(yǎng)7天，取樣用于蛋白定量及抗氧化能力測試.

土壤浸提液的制備：將 10g 土樣和 100mL 0.9% 滅菌生理鹽水共同加入 150mL 三角瓶中，再將三角瓶置于旋渦振蕩器上，在室溫條件下以100rpm/min 振蕩 ¹h ，靜置待其自然沉降后取上清液即為土壤浸提液.

（2）土壤直接慢性暴露實驗

Z_nO-ENs 暴露濃度分別設置為 0.10mg/kg 、100mg/kg?500mg/kg ，培養(yǎng)時間分別設置為30天、90天、120天.按照各暴露濃度配置ZnO-ENs溶液，利用超聲波萃取器設置功率 30%，300W ；超聲2s、間隔 2s ，超聲分散 3min ，使其均勻分散成懸濁液狀態(tài).模擬關中地區(qū)月降水量 （50mL） ，用超細噴嘴噴灑進行慢性毒性暴露，室溫下培養(yǎng)，同時向對照組加人等量純水，暴露期間保持土壤田間持水量的 20% ，到培養(yǎng)時間取樣進行測定.實驗以容量為 20g 的棕色小瓶為容器，每次取樣為破壞性取樣，因每個培養(yǎng)時間有三組暴露濃度，每個濃度設三組平行，設置三組空白對照，故合計棕色小瓶共39個，樣本分別用于熒光素二乙酸酯酶、16SrDNA、ECO板的測定.

1.2.2 微生物總蛋白含量及抗氧化能力測定

向培養(yǎng)好的菌液中加入粒徑 0.5mm 的玻璃珠，利用渦旋混合器渦旋振動破碎菌液，共振動三次，每次 1min ，再將破碎好的菌液稀釋10倍進行測定.測定原理及方法詳見測試盒說明，抗氧化能力測試包括MDA、 H₂O₂ 、T-AOC、T-SOD、GSH-PX的測定.

1.2.3土壤菌群碳源代謝檢測

（1）ECO板測定

本研究使用Biolog-ECO孔板測定土壤微生物碳源代謝能力[18].各暴露設置下設3組平行，取各棕色小瓶中 1g 土樣添加 0.9% 生理鹽水 10mL 160rap/min 震蕩 20min ，取懸濁液 150μL 加人ECO板， 25C 連續(xù)恒溫培養(yǎng)7天，每 24h 于波長590nm 和 750nm 下讀取一次吸光度.

（2）群落功能多樣性指數計算

群落代謝功能多樣性計算考察Shannon多樣性指數和McIntosh多樣性指數，它們是研究群落物種豐富度和分布均勻程度的綜合指標[19].計算方法詳見文獻[20].

1.2.4 熒光素二乙酸酯酶的活性檢測

熒光素二乙酸酯酶（FDAH的水解受脂肪酶、蛋白酶、酯酶等土壤中酶的影響，因此FDAH活性可以用來表征土壤中微生物的總酶活性[21]，測定原理及方法詳見文獻[22].

1.2.5 16S rDNA 測序

（1）序列提取測序

使用土壤DNA提取試劑盒提取樣品總DNA，通過特異性引物對原核生物16SrDNA的V3、V4高變區(qū)進行PCR擴增[23]，再使用乙醇沉淀法純化總DNA，完成后將樣品外送至IluminaMiSeq測序平臺對16SrDNA進行測序分析.

（2）數據分析

對原始序列數據進行去接頭和低質量過濾處理得到純序列，再去除嵌合體序列得到有效序列進行物種操作單元（Oper-ational TaxonomicUnits，OTU）聚類分析[24].基于OTU分析結果，可以對樣本進行 α 多樣性指數分析，得到樣本物種豐富度和均勻度信息等，還可以在各分類水平上進行群落結構的統(tǒng)計分析；通過繪制PCoA（PrincipalCo-ordinatesAnalysis）等圖，直觀展示不同樣本或分組之間群落結構差異.

1.2.6 數據處理和分析

蛋白質含量、抗氧化系統(tǒng)相關數據、碳源代謝分析、多樣性指數和物種相對豐度利用Origin2021作圖，代謝指紋圖譜利用HeatCraft軟件繪制.

1.2.7 生態(tài)彈性評估

基于微生物多樣性指數、代謝活性和群落結構等指標的變化，我們對不同暴露條件下土壤微生物群落的生態(tài)彈性進行了綜合評估.生態(tài)彈性指數計算參考了Orwin和Wardle[25]提出的方法，結合了恢復率和穩(wěn)定性兩個方面.

2 結果與討論

2.1ZnO-ENs暴露對土壤微生物抗氧化系統(tǒng)的影響

抗氧化能力是指機體抵御自由基損傷的能力，MDA、 H₂O₂ 、T-AOC、T-SOD、GSH-PX是反映抗氧化能力的重要指標[26].本研究通過測定這些指標來觀察 Z_nO-ENs 短期高濃度暴露對土壤微生物的生物學效應.圖1（a）顯示混合培養(yǎng)體系的蛋白濃度比純培養(yǎng)體系高約 15% ;圖1（b）顯示純培養(yǎng)體系的 H₂O₂ 含量高于混合培養(yǎng)體系；圖1（c）顯示混合培養(yǎng)體系的MDA含量高于純培養(yǎng)體系；圖1（d）、圖1（e）和圖1（f）顯示混合培養(yǎng)體系的T-AOC、T-SOD和GSH-PX活性均高于純培養(yǎng)體系，且在 Z_nO-ENs 暴露后分別增加了 10%.28% 和 11% ：

綜上可知， Z_nO-ENs 急性暴露對土壤微生物產生了顯著的毒性作用，導致抗氧化系統(tǒng)應激性失調.混合培養(yǎng)物通過產生大量抗性蛋白來降低過氧化程度，相比對照組和純培養(yǎng)物，對 Z_nO-ENs 急性暴露表現(xiàn)出更高的耐受性，這說明微生物多樣性是其生態(tài)彈性的基礎.而實際土壤中的微生物多樣性顯著高于實驗中的混合培養(yǎng)物，微生物間的相互作用也更加復雜，這意味著土壤微生物對外源脅迫干擾的抗性會更強，預示著更好的生態(tài)彈性，

2.2ZnO-ENs暴露對土壤微生物代謝的影響

2.2.1 ZnO-ENs暴露對土壤微生物代謝活性的影響

為探究實際土壤中微生物在ZnO-ENs暴露下的生態(tài)彈性情況，本研究進一步開展不同ZnO-ENs濃度水平的中長期暴露實驗.FDAH活性圖2（a）顯示 Z_nO-ENs 對微生物的總酶活性產生了抑制作用，其中培養(yǎng)30天的酶活最低，說明Z_nO-ENs 對微生物的總酶活性短期內抑制作用最大，而相同培養(yǎng)時間下暴露濃度與酶活高低無明顯關聯(lián)，各暴露濃度下的酶活均隨培養(yǎng)時間的延長有所恢復，顯示出酶活性的彈性作用； 500mg/kg 暴露濃度下培養(yǎng)至第120天酶活明顯低于前期酶活，推測高濃度 Z_nO-ENs 對土壤微生物總酶活造成了不可逆的抑制作用.

圖2（b）為基于ECO板測試數據的不同暴露模式下的微生物主要碳源代謝活性分布特征圖，圖2（c）為細化分析的碳代謝指紋圖譜.由圖可知10mg/kg 組碳代謝特性與對照組接近，總碳源代謝活性及各類碳源的代謝都基本不變； 100mg/kg 組在暴露30天時除酯類以外的五類碳源代謝都被抑制，在暴露90天時各碳源代謝活性顯著提升，總碳源代謝水平恢復至高于對照組，但在暴露120天時各類碳源的代謝水平波動導致了整體代謝活性降低至弱于對照組，說明該暴露情景對土壤微生物群落的碳代謝平衡產生了不可逆的破壞； 500mg/kg 組在暴露30天時除酯類以外其余碳源代謝都受到抑制，90天時酯類代謝活性也減弱，但在120天時胺類及醇類的代謝活性維持穩(wěn)定，其余四類碳源代謝均有所增強，總碳代謝活性水平恢復至高于對照組.

綜上所述， Z_nO-ENs 對土壤微生物的碳源代謝活性影響顯著.短期暴露導致總碳代謝活性明顯抑制，而隨著暴露時間的延長，各類碳源代謝的差異性變化使總碳源代謝活性逐漸恢復，表現(xiàn)出一定的碳代謝功能彈性.

（30代表 10mg/kg 暴露30天， 30^′ 代表100mg/kg 暴露30天， 30^′′ 代表 500mg/kg 暴露30天，90代表 10mg/kg 暴露90天， 90^′ 代表100mg/kg 暴露90天， 90^′′ 代表 500mg/kg 暴露90天，120代表 10mg/kg 暴露120天， 120^′ 代表100mg/kg 暴露120天， 120^′′ 代表 500mg/kg 暴露120 天）

2.2.2ZnO-ENs暴露對土壤微生物群落代謝功能多樣性的影響

Shannon多樣性指數用于評估種群豐富度和均勻度.圖3（a）顯示ZnO-ENs暴露對土壤微生物種群的豐富度和均勻度影響較小.McIntosh多樣性指數反映群落物種在多維空間上的歐幾里得距離多樣性；圖3（b）顯示ZnO-ENs暴露對土壤微生物的Mc-Intosh多樣性影響顯著，且其變化趨勢與總代謝活性變化情況基本一致，對均勻度影響較小.

綜上所述，ZnO-ENs暴露對土壤微生物種群的影響較小，但對物種多樣性影響較大.結合代謝活性分析結果， Z_nO-ENs 暴露會影響土壤微生物群落中的主要物種（核心物種和優(yōu)勢物種），導致土壤微生物代謝活性波動，長期暴露則會促使土攘微生物產生抗性，表現(xiàn)出代謝彈性，

2.3 ZnO-ENs暴露對土壤微生物物種的影響

2.3.1 物種OTU分析

為進一步探究ZnO-ENs暴露對土壤微生物群落結構的影響，本研究又對不同暴露水平下的土壤微生物樣本進行了16SrDNA測序分析.OTU是通過對一個樣本測序結果中的菌所在種、屬等的數目信息進行歸類操作，以便于分析物種分類單元的統(tǒng)一標志.稀釋曲線（rarefactioncurve）是用于判斷樣本量是否充分以及估計物種豐富度的方法，在生物多樣性和群落調查中被廣泛應用.

圖4（a）顯示各樣本OTU稀釋曲線隨序列數增加而增加，當測序數增加到約15000時曲線的增長趨于平緩，之后OTU數目不再增加，說明此時測序數據量充足且合理，本實驗測序有效序列數均≥45000，OTU數目覆蓋了環(huán)境樣本中的絕大多數菌群信息，因此能夠充分反映不同 Z_nO-ENs 暴露濃度下在培養(yǎng)過程中的細菌群落變化情況.熱圖可以直觀反映OTU/樣本數據間的相似性和差異性，從圖4（b）可知短期暴露組（30天）與對照組相似度最高，與長期暴露（90天及往后）時樣本OTU豐度差異明顯.

圖4不同暴露模式對微生物豐度和多樣性影響根據OTU聚類分析結果分別以暴露濃度和培養(yǎng)時間為基準繪制韋恩圖，由圖4（c）可知對照組含 OTU 643 種、 10mg/kg 組含686種、 100mg/kg 組含685種、 500mg/kg 組含684種，所有組共有OTU640 種；由圖4（d）可知對照組含OTU 643種、培養(yǎng)30天組含652種、培養(yǎng)90天組含686種、培養(yǎng)120天組含685種，所有組共有 OTU636 種.

綜上說明， Z_nO-ENs 暴露會促使土壤微生物物種多樣性提升，但在短期內改變不明顯，到90天之后群落結構基本維持穩(wěn)定.結合前面碳代謝指紋圖譜數據，說明演替中新出現(xiàn)的微生物物種能夠補償受抑制物種的代謝功能從而體現(xiàn)出代謝功能的生態(tài)彈性，

2.3.2 核心種群分析

核心種群是指在特定系統(tǒng)中能夠影響其發(fā)展和維持的種群.在對照組中，厚壁菌門（Firmi-cutes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（ teobacteria）相對豐度均高于 20% ，定義為核心種群；綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemma-timonadetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）相對豐度之和高于 20% ，定義為優(yōu)勢種群.圖5（a）顯示，在 Z_nO-ENs 各暴露濃度下，主要種群的比例在短期內均有所增長，但隨培養(yǎng)時間的延長受到抑制，導致主要種群比例低于對照組.核心種群的豐度變化與主要種群相同，在短期及中長期暴露時與暴露濃度呈正相關，長期暴露則呈負相關；優(yōu)勢種群的豐度變化則與主要種群相反.兩大種群的激活和抑制作用相互抵消，導致主要種群在暴露時間上的恢復情況，但結果不可逆，主要種群無法恢復到初始狀態(tài).核心種群受影響明顯且有規(guī)律，相對而言優(yōu)勢種群受影響不明確，因此需要在綱分類水平上對核心種群進行深入研究.

圖5（b）的結果顯示，在所有暴露設置下，梭菌綱（Clostridia）相對豐度都占厚壁菌門 95% 以上，放線菌綱（Actinobacteria）與放線菌門完全一致.

ZnO-ENs短期暴露會促使 β 一變形菌綱（Betaproteobacteria）豐度升高，但隨著暴露時間延長，豐度有所下降且無法恢復到暴露前水平. a^- 變形菌綱（Alphaproteobacteria）在ZnO-ENs的抑制作用下豐度低于對照組.低濃度暴露促進δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria）菌群的擴大，而中高濃度暴露則使該綱菌群呈現(xiàn)先減后增再減的波動規(guī)律.這種動態(tài)變化揭示了 Z_nO-ENs 暴露對微生物群落結構的復雜影響，不同微生物綱對ZnO-ENs的響應存在顯著差異.這可能與其生理特性、代謝途徑及生態(tài)位競爭有關，進一步研究這些機制將有助于理解納米材料對環(huán)境微生物的潛在風險和生態(tài)效應.

2.3.3 暴露周期內微生物種群演替特征分析

將各樣本在門分類水平上的前30種物種分布繪制為聚類熱圖，可以更直觀地觀察各物種的相似性與差異性.圖6（a）顯示，不同濃度的 Z_nO-ENs 暴露會改變土壤微生物種類組成及豐度，暴露后出現(xiàn)了Ignavibacteriae門、迷蹤菌門（Elusimicro-bia）和綠菌門（Chlorobi）三種新物種，同時纖維桿菌門（Fibrobacteres）豐度隨暴露濃度的增加而降低.圖6（b）顯示， Z_nO-ENs 暴露30天的實驗組與對照組的物種組成及豐度最相似，而暴露90天與120天的實驗組相似.圖6（c）顯示， Z_nO-ENs 暴露下主要種群以裝甲菌門（Armatimonadetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、疣微菌門（Verrucomicro-bia）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、奇古菌門（Thaumarchaeota）和纖維桿菌門（Fibrobacteres）的相對豐度變化較小，而Ignauibacteriae門、綠菌門（Chlorobi）、迷蹤菌門（Elusimicrobia）和藍藻菌門（Cyanobacteria）的豐度隨著培養(yǎng)時間的延長而增加.提示這些微生物可能具有較強的環(huán)境適應能力，能夠在ZnO-ENs壓力下迅速占據生態(tài)位，這可能與其特定的代謝路徑有關，如對重金屬的耐受性和相關的抗氧化機制.

主坐標分析（PCoA）直觀反映了樣本間的相似性，兩個坐標軸分別代表主坐標，主坐標對樣本差異的貢獻度通過百分比表示，距離越近表示樣本間微生物群落的相似度越高.圖6（d）顯示，ZnO-ENs暴露30天的實驗組與對照組的物種組成和豐度最相似，而暴露90天和120天的實驗組則相似度較高.這表明，短期暴露對土壤微生物群落影響顯著，但隨著時間延長，微生物群落逐漸適應并重新建立新的平衡狀態(tài).長期暴露下，微生物群落的高度相似性提示了生態(tài)系統(tǒng)的恢復能力和彈性.PCoA分析進一步驗證了不同濃度ZnO-ENs暴露下王壤微生物群落的差異性.與對照組相比，高濃度暴露組的群落相似度顯著降低，表明高濃度Z_nO-ENs 對微生物群落的干擾更強，生態(tài)彈性下降，這一結果與OTU及物種多樣性分析一致.

圖6（e）展示了土壤微生物生態(tài)彈性隨時間的動態(tài)變化.這一動態(tài)曲線是基于我們在不同時間點（30天、90天、120天）測得的微生物多樣性指數、代謝活性和群落結構變化等數據綜合繪制而成，反映了不同 Z_nO-ENs 暴露濃度下微生物群落生態(tài)彈性的變化趨勢.低濃度暴露 （10mg/kg） 下，微生物群落表現(xiàn)出較強的生態(tài)彈性，能夠在短期內恢復并保持穩(wěn)定.中等濃度暴露 （100mg/kg） 下，微生物群落經歷了一個先降低后緩慢恢復的過程，但未能完全恢復到初始狀態(tài).高濃度暴露 （500mg/kg） （2下，微生物群落的生態(tài)彈性受到嚴重影響，難以恢復到初始狀態(tài).綜上可知，在環(huán)境中使用納米材料時，必須考慮其對生態(tài)系統(tǒng)的長期影響.特別是應制定嚴格的環(huán)境風險評估和管理策略，以控制納米材料的釋放濃度，避免對土壤微生物群落及其生態(tài)功能造成不可逆的損害.

3結論

本研究系統(tǒng)評估了工程納米氧化鋅（ZnOENs）長期暴露對土壤微生物的毒性效應及其生態(tài)彈性響應.結果表明， Z_nO-ENs 暴露對土壤微生物的抗氧化系統(tǒng)、代謝功能和群落結構產生了顯著影響.ZnO-ENs暴露會損害微生物的抗氧化能力，但微生物能夠通過自身調節(jié)逐步恢復.短期內暴露會顯著抑制微生物的總代謝活性，長期暴露則會逐步恢復，但仍與初始狀態(tài)存在差異.慢性暴露會導致優(yōu)勢種群豐度下降并出現(xiàn)新物種門類，導致群落結構發(fā)生不可逆改變.盡管微生物在生理和群落水平上體現(xiàn)出部分生態(tài)彈性，但ZnO-ENs暴露對土壤微生物的影響具有不可逆性.本研究結果為評估金屬納米材料的長期環(huán)境風險和相關生態(tài)修復提供了理論依據.

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【責任編輯：蔣亞儒】