基于離子液體與微波輔助的川續斷提取液抑菌作用及機制研究

中圖分類號：TS210.9 文獻標志碼：A 文章編號：1671-8755（2025）02-0025-08

Study on the Antibacterial Effect and Mechanism of Dipsacus Asper Extract Based on Ionic Liquid and Microwave-assisted Method

ZOU Jing¹ ，KANG Jianqing'， ZHOU Mengjiao2， ZHANG Yu' ，KANG Ming'，LIANG Xiaofeng1，2

（1. School of Materials and Chemistry，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010， Sichuan， China; 2. Mianyang Key Laboratory of Development and Utilization of Traditional Chinese Medicine Resources， Sichuan College of Traditional Chinese Medicine，Mianyang 621olo， Sichuan，China）

Abstract：Using Dipsacus as the raw material，the extract was obtained through ionic liquid and microwave-assisted extraction technology.Antibacterial experiments and active component analysis of the extract were conducted，and the antibacterial mechanism was discussed.The results show that the Dipsacus extract exhibits antibacterial effects against Escherichia coli（ E . coli），Staphylococcus aureus （S. aureus），and Salmonella paratyphi β （ S .paratyphi β ），with its inhibitory activity being concentration-dependent. The inhibition zone diameters for E . coli，S.aureus，and S . paratyphi β are 27 mm，39 mm，and 19mm ，respectively. The minimum inhibitory concentration （MIC）and minimum bactericidal concentration（MBC） against S. aureus are determined to be 3.1250mg/mL and 6.250 0mg/mL ， respectively. For E ： coli，the MIC and MBC values are 3.1250mg/mL and 6. 250 0mg/mL ， respectively. For S ：paratyphi β ，MICis 6.250 0mg/mL and MBC is 12.500 0mg/mL . Chromatographic analysis reveals the presence of antibacterial components in Dipsacus extract，including chlorogenic acid，caffeic acid，and asperosaponin VI. Morphological observations suggest that the antibacterial mechanism may involve disruption of bacterial cell wals and membranes.These findings provide valuable references for the development of antimicrobial agents from Dipsacus.

Keywords： Dipsacus asper extract；Antibacterial constituent； Antibacterial activity； Antibacterialmechanism

植物中的皂苷類、酚酸類成分（綠原酸、咖啡酸等）對多種革蘭陽性和革蘭陰性細菌均具有顯著的抑菌作用[1-4]，其抑菌機制可能與降解細菌細胞壁結構、破壞細胞膜完整性導致胞內物質外泄并引發細菌死亡相關[5]

川續斷（DipsacusasperWall.exHenry）是川續斷科多年生草本植物的根，富含皂苷成分，以“續折接骨\"之功效而聞名[6，是一種重要的中藥材。近年來有研究表明川續斷揮發油、三萜類化合物及復方提取物具有抗菌潛力。吳知行等[]研究發現川續斷揮發油對金黃色葡萄球菌具有顯著的抑制效果；張玉[8發現川續斷揮發油對大腸埃希菌有顯著的抑制效果; Yu 等°研究發現川續斷的三萜類化合物對金黃色葡萄球菌表現出中等的抗菌活性；王斌等[10]發現川續斷提取物（水提物與醇提物的混合物）可作為氟苯尼考的增效劑，通過復配使用可顯著提升抗生素的抗菌效果。

川續斷有效成分的提取通常采用有機溶劑提取法[1]超聲波輔助溶劑提取法[12]、超臨界 CO₂ 提取法[13]等方式。然而，有機溶劑存在毒性、易燃性和揮發性等問題，對環境不友好[14]。因此，研究者將關注點聚焦于更為安全的溶劑，如離子液體[15]水[16]超臨界流體等。離子液體（ILs）是由離子組成的低熔點鹽[17]，具有低熔點、低揮發、化學穩定性好、水溶性好等特點[18]，是替代傳統有機溶劑的理想選擇[19]。目前，離子液體多用于提取多糖類、生物堿類、黃酮類物質[20]，對于皂苷類、酚酸類的提取研究較少。胡獻躍等[12]通過超聲輔助離子液體提取體系實現了川續斷總皂苷（含皂苷VI）和酚酸類成分（咖啡酸、綠原酸及其異構體）的高效共提。然而，針對ILs-微波協同技術提取川續斷活性成分及其抑菌機制的系統研究仍屬空白。

本研究以川續斷為研究對象，利用離子液體-微波輔助提取技術獲得川續斷提取液，以抑菌圈直徑、最低抑菌濃度（MIC）及最低殺菌濃度（MBC）為考察指標，重點研究提取液對大腸埃希菌（E.coli）、金黃色葡萄球菌（S.aureus）、乙型副傷寒沙門菌（S.paratyphiβ）等3種動物致病菌的抑制作用。根據高效液相色譜進行成分檢測，推測川續斷提取液的抑菌活性成分，通過光學顯微鏡觀察細菌菌落的分布形態，探討川續斷提取液的抑菌機制。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

川續斷采自四川涼山彝族自治州，經四川中醫藥高等專科學校王化東副教授鑒定，清洗、烘干、粉碎，過80目篩，放入干燥器血備用;溴化1-辛基-3甲基咪唑（純度 98% ）、咖啡酸（純度 98% ），上海阿拉丁生化科技有限公司；綠原酸（純度 98% ）川續斷皂苷VI（純度 98% ），上海士峰生物科技有限公司;S. aureus CMCC（B）26003， E. ：coli CMCC（B）44102，S. paratyphi β CMCC（B）50094，綿陽樂濱商貿有限公司；水解酪蛋白瓊脂（MH）（BR）、營養肉湯培養基（NB）（BR），杭州濱和微生物試劑；環丙沙星藥敏紙片（ 6mm ）、頭孢克藥敏紙片（ 6mm ）空白藥敏紙片（ 6mm ），比克曼生物科技有限公司；生理鹽水（BR），上海阿拉丁生化科技有限公司；結晶紫溶液（AR），成都市科隆化學品有限公司；碘液、丙酮酸、沙黃（BR），青島海博生物科技有限公司。

1.2 實驗儀器

液相色譜儀（UltiMate3000DGLC），美國賽默飛世爾公司；電子分析天平（BSA124S），賽多利斯科學儀器有限公司；DHG鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器公司；便攜式高壓蒸汽滅菌器（YXQ-LS-18SI），上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；數顯常溫培養箱（250B），金壇精達儀器制造廠；旋轉蒸發儀（RE52CS-2），昆山禾創超聲儀器有限公司；光學顯微鏡（MSD100-9），邁時迪科技有限公司；微波化學反應器（MCR-3型），鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.3 提取液制備

稱取 川續斷樣品加入 40mL 0.5mol/L 的溴化1-辛基-3－甲基咪唑水溶液微波提取30min，功率 300‰ ，提取溫度為 60^°C ，旋轉蒸發濃縮，抽濾得到粗提液，命名為ASA1，濃度為 25mg/mL 。

1.4 抑菌實驗

以頭孢克、環丙沙星為陽性對照，通過濾紙片法[21]測定ASA1對 S_? aureus， E . coli，S. paratyphi β 的抑菌圈直徑。

取ASA1 2.0mL ，向其中加入適量生理鹽水進行稀釋，分別得到體積分數 100% ， 50% ， 25% 共3種濃度梯度的ASA1樣品。

選取上述3種供試菌種的培養懸液及固體培養基，在超凈工作臺上，精確吸取 100μL 細菌懸浮液[22]（ 10⁸CFU/mL ）滴加至培養基表面，使用一次性滅菌涂布棒將其均勻涂布。利用鑷子將滅菌的空白藥敏紙片貼于培養基表面，精確吸取 10μL 不同濃度的ASA1溶液滴加至空白藥敏紙片上，同時以無菌生理鹽水作為陰性對照[23]，于數顯恒溫細胞培養箱中培養 24h ，溫度設為 37°C ，最后使用數碼卡尺測量抑菌圈直徑。抑菌作用的強弱依據濾紙片瓊脂擴散法的判定標準進行評估，當抑菌圈直徑 （d） 超過 7mm ，判定具有抑菌作用[21]，供試菌的抑菌圈直徑越大，意味著樣品的抑菌效果越顯著[22] 。

1.5最低抑菌濃度及最低殺菌濃度測定

在微生物藥敏試驗的微量稀釋法中，以在小孔內完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為MIC，即OD值接近藥物陰性對照組的最低藥物濃度。以NB液體培養基為陰性對照，在96孔板中通過二倍稀釋法對ASA1依次稀釋，得到質量濃度為25.000，12.500，6.250，3.125，1.563，0.781，0.391，0.195mg/mL 系列濃度梯度的ASA1陽性對照組。將不同菌種加入對應96孔板中，于 37°C 數顯恒溫細胞培養箱中培養 24h ，使用酶標儀測定 0D₆₀₀ 值，通過陽性對照組與陰性對照組進行對比得到測試菌種的MIC。

殺死 99.9% 的供試菌種所需的藥物濃度為最低殺菌濃度（MBC），即培養基平板上菌落數量低于10CFU的最低濃度。選取MIC/2，MIC，2MIC，4MIC，8MIC濃度孔，接種適量菌液于瓊脂培養基平板上培養 24h ，根據培養基平板上的菌落數量情況判定菌種的MBC。

1.6 色譜實驗

本研究重點關注文獻報道中具有抑菌潛力的成分，通過HPLC對提取液中綠原酸、咖啡酸、川續斷皂昔VI成分進行定量檢測。

1.6.1 色譜條件

采用HypersilODS色譜柱（型號為 4.6mm× 250mm ， 5μm ），柱溫： 30^°C ，流動相：A（乙腈），B（水，含 0.05% 磷酸）;按照流動相濃度梯度程序進行洗脫（流動相 A，0～5min，2%;5～8min，2% 6% ： 18～22min ， 7%34% ： 22～25min ， 34% 66% ）;設定檢測波長為 220nm ，流速為 1.0mL/min 液相單次進樣體積為 10μL 。在該色譜條件下，川續斷皂苷VI、綠原酸、咖啡酸的峰形對稱，并且理論塔板數均不低于 5000 。

1.6.2 標準品溶液制備

取川續斷皂苷VI、咖啡酸、綠原酸標準品適量，置于 10mL 容量瓶中，加 20% 甲醇定容至刻度，配置成川續斷皂苷VI、咖啡酸、綠原酸濃度均為 1mg/mL 的混合對照溶液，過 0.22μm 有機系濾膜備用。

1.6.3 樣品溶液制備

使用D101型大孔樹脂柱依次用去離子水、20% 乙醇 60% 乙醇洗脫純化ASA1，得純化液，過0.22μm 有機系濾膜備用。

1.6.4 化學成分指認

按照色譜條件分別對標準品溶液及樣品溶液進樣檢測，通過與標準品色譜峰保留時間等進行比對，確認樣品溶液中是否存在川續斷皂苷VI、咖啡酸、綠原酸等成分。

1.7 細菌菌落分布形態學觀察

采用革蘭氏染色法[14]制備細菌染色標本，利用光學顯微鏡（自鏡倍數為 10× ，物鏡倍數為 100×） 觀察ASA1處理前后的細菌菌落形態變化，探討ASA1的抑菌機制。

1.8 數據統計分析

本實驗用SPSS對數據進行處理分析，測定結果以平均數表示。

2 試驗結果

2.1 川續斷提取液的抑菌作用

2.1.1ASA1與常用抗生素抑菌效果對比

首先用濾紙片法觀察了ASA1對S.aureus， E coli，S.paratyphi β 的抑菌效果，并與頭孢克肟和環丙沙星兩種常用的抗生素進行了比較，結果如圖1和表1所示。

從圖1和表1可以看出，ASA1對以上3種供試菌種都具有抑菌效果，其抑菌效果依次為：金黃色葡萄球菌（S.aureus） gt; 大腸桿菌（E.coli） gt; 乙型副傷寒沙門菌（S.paratyphi β ）。具體而言，ASA1對S.aureus的抑菌圈直徑達 39mm ，顯著優于兩種陽性對照藥物；對 E ：coli形成的抑菌圈直徑（ 27mm ）介于環丙沙星與頭孢克肟之間；而對S.paratyphi β 的抑菌圈直徑僅為 19mm ，弱于兩種對照藥物。

值得注意的是， s. paratyphi β 的抑菌圈出現“雙環”現象，外環與內環間存在零星菌落，推測此現象與ASA1的濃度梯度擴散特性相關：在ASA1由內向外擴散的過程中，藥物濃度逐漸變低，抑菌圈內環可以有效殺菌，而外環處于低濃度區，導致抑菌效果不足，且ASA1對S.paratyphi β 抑菌效果較弱，所以出現細菌在抑菌圈內生長的現象。結合ASA1對該菌株的最低抑菌濃度（MIC）為 6.250 0mg?mL^-1 可進一步驗證ASA1在低濃度區抑菌活性下降的特性，這與外環與內環間存在菌落的觀察結果相吻合。

綜上可知，ASA1對 S ：aureus的抑菌效果良好，對 E ．coli的抑菌效果較好，對S.paratyphi β 的抑菌效果較弱。

2.1.2 不同濃度ASA1的抑菌效果

從圖2和表2可以看出，ASA1對3種供試菌種的抑菌活性呈現顯著的濃度依賴性。當ASA1體積分數為 100% 時，對 E ：coli的抑菌圈直徑為 27mm ，對 S ：aureus的抑菌圈直徑為 32mm ，對S.paratyphiβ 的抑菌圈直徑為 19mm ，均超過CLSI規定的敏感閾值（ 15mm， ），且抑菌圈內無耐藥菌，屬于敏感，表明ASA1在高濃度下具有廣譜抑菌活性，其中對S.aureus的抑菌效果更明顯;當ASA1體積分數為50% 時，抑菌效果減弱，對 E .coli，S.aureus仍然具有較好的抑菌效果，對 S. paratyphi β 的抑制效果大幅度降低；當ASA1體積分數為 25% 時，抑菌效果繼續降低，此時對 E_☉ ：coli，S.aureus的抑菌效果仍然較好，對 s ：paratyphi β 的抑制效果已不顯著。以上結果表明不同濃度的ASA1對大腸埃希菌（E.co-li ）、金黃色葡萄球菌（S.aureus）、乙型副傷寒沙門菌（S. paratyphi β ）的生長繁殖有不同程度的抑制作用，且抑菌活性與濃度呈正相關。

2.1.3 ASA1的MIC和MBC

ASA1與供試菌種培養 24h 后的 0D₆₀₀ 值如表3所示，通過與對照組對比，得到 s. aureus，S.para-typhi β，E ：coli的MIC分別為 3.1250.6.2500 3.125 0mg?mL^-1 。ASA1的MIC和MBC 結果如表4所示。從表4可以看出，ASA1對3種供試菌中的E ：coli，S.aureus具有更好的抑制作用，與抑菌圈試驗結果相印證。

2.2 川續斷提取液的抑菌活性成分分析

標準品及樣品洗脫液的液相色譜如圖3所示。在標準品液相色譜圖中，綠原酸的出峰時間為15.597min ，咖啡酸的出峰時間為 17.370min ，川續斷皂苷VI的出峰時間為 26.293min 。通過比對提取液與標準品的出峰時間、峰面積及理論塔板數，指認了川續斷提取液中存在綠原酸、咖啡酸、川續斷皂苷VI3種化學成分。已有研究發現，綠原酸可以通過作用于細菌細胞壁和細胞膜使其通透性增加、影響細菌的集群能力和生物膜形成、誘導細胞內活性氧耗竭、影響特定酶活性干擾正常代謝及損傷細菌DNA等途徑來發揮抑菌作用3；咖啡酸可以通過抑制細菌生物膜形成、破壞細胞膜的完整性、調控基因表達影響蛋白功能等途徑來發揮抑菌作用4；皂苷類成分可能通過破壞菌體細胞的結構完整性、抑制生物膜的形成與生長、增強細胞膜的通透性（川續斷皂苷VI具有表面活性劑特性）等途徑來發揮抑菌作用[24]。常春藤皂苷元對大部分革蘭氏陽性菌均有抑制作用[25]，且效果強于革蘭氏陰性菌，抑菌效果不同可能是細菌細胞壁結構不同導致的[26]川續斷皂苷VI為川續斷的主要活性成分，常春藤皂苷元為川續斷皂苷類成分的結構母核[27]。結合文獻與川續斷提取液的成分檢測，川續斷提取液的抑菌作用可能源于多成分的協同效應，其抑菌活性成分可能為綠原酸、咖啡酸（酚酸類）及川續斷皂苷VI（皂苷類）。

2.3 抑菌機制分析

革蘭氏染色法利用細菌細胞壁上的生物化學性質不同將細菌分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌[28]。革蘭氏陽性菌染色后呈紫色，而革蘭氏陰性菌則呈紅色。當細胞出現老化或死亡時，革蘭氏染色結果可能為陰性，此時細胞圖像顯示為紅色[29]

S.aureus屬于革蘭氏陽性菌，其染色標本的菌體形態如圖4所示。圖4（a）顯示，未經處理的S.aureus染色后呈現均勻的紫色，菌體細胞排列緊密，分布有序，呈“葡萄狀”團聚。經過ASA1處理后菌體形態如圖4（b）所示，S.aureus的“葡萄狀”團聚現象消失，“葡萄狀”聚集體解離為分散單體，菌落分布變得無序，許多菌體出現變形或破損，顯示為紅色染色形態。羅藝晨等[30]認為，綠原酸可以破壞金黃色葡萄球菌的內膜，導致其細胞膜的通透性發生變化，從而實現抑制效果。郭麗麗等[31]發現，黃芪莖葉總皂苷會損害大腸桿菌的細胞膜形態，導致細胞內物質快速外泄，營養供應受阻，從而顯著抑制細菌的生長。因此S.aureus菌落經ASA1處理，改變了細菌細胞膜的通透性，細胞壁遭到破壞，最終導致細胞的老化或死亡[32]

E. coli 和 S. paratyphi β 均屬于革蘭氏陰性菌，其染色標本的菌體形態如圖5、圖6所示。從圖5（a）和圖6（a）可以看出，未經處理前，E.coli的菌體呈長桿狀，細胞形態完整且無相互黏連，而S.paratyphi β 則呈桿狀，通常以成對或短鏈狀排列，分布均勻。在

ASA1處理后，如圖5（b）和圖6（b）所示，E.coli和S. paratyphi β 的菌體均顯示出明顯的細胞相互黏附和堆積現象，且菌體分布變得雜亂無序，細菌細胞壁和細胞膜遭到破壞，細胞透性增加從而造成原生質外滲[33]。以上研究表明，川續斷提取液的抑菌作用是通過破壞細菌細胞壁和細胞膜從而抑制了 s aureus，E. coli和S.paratyphi β 菌體生長。

3結論

通過離子液體-微波輔助提取法獲得川續斷提取液，分析了提取液對S.aureus，E.coli，S.paratyphi β 的抑菌效果、抑菌活性成分及抑菌機制。結果表明川續斷提取液對S.aureus，E.coli，S.paratyphiβ腸道致病菌均具有一定的抑菌效果，且其抑菌效果隨著濃度的增加而增強，其抑菌機制主要是通過破壞細菌細胞壁和細胞膜影響細菌的生長和繁殖。川續斷中的綠原酸、咖啡酸及川續斷皂苷VI成分可能為川續斷提取液抑菌作用的活性成分。本研究表明川續斷有作為抗菌藥物開發的潛質。

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