黃瓜耐濕冷性苗期濕冷害指數鑒定方法的建立

Establishing of a wet-cold tolerant identification method for cucumber during seedling stage by wet-cold injury index

DING Yuanyuan，LIU Hanqiang，PAN Yupeng，MENG Huanwen， CHENG Zhihui （CollegeofHorticulture，NorthwestAamp;FUivesity，Yangling7oo，haniina）

Abstract： To establish a wet-cold tolerant identification method during seedling stage for cucumber by morphology，the seedlings intwodevelopedtrue leavesof8testcultivarsand5validationcultivars withdiferent wet-coldtolerance were treatedunder 9^°C/5^°C（day/night）+ relative humidity 95% growth chambers（taking 25^°C/18^°C +relative humidity 85% asthecontrol）.After7daysof treatment，thedegreeof wet-cold injurywascountedforeach plant，the wet-coldinjuryindexes were calculatedand the growth parameter were measured.The results showed thatthe diferent cultivars presented diferentlevelofleafyellowing，waterlosing wiltingordeath underwet-coldstressandthe wet-coldinjuryindexes could indicate the wet-cold toleranceofthecultivaraccurately.Theresultsofvalidation testwereconsistent withthoseofmethodestablishment test.Theclusteringofwet-cold toleranceofvarious varietiesbasedontherelativevaluesofplantheight， leaf lengthand leaf width etc.under wet-cold stress and controlcondition wereconsistent with theclasificationof wet-coldinjuryindex.Therefore，itisthoughtthatthewet-coldinjuryindexatseedlingstagecanbeusedtoidentifythe wet-coldtoleranceofcucumber cultivars.The wet-cold injury index greater thanObutlessthanorequal to0.250 ndicatesstrong toleranttype，greaterthanO.250butlessthanorequalto0.550indicatesmoderate toleranttype，greaterthan 0.550 butless thanorequalto0.750indicates weak tolerant type，andgreaterthan0.750butlessthanorequalto1.00 indicates sensitive type.

Keywords：Cucumber;Cultivargermplasm; Wet-coldtolerance;Wet-cold injuryindex;Identificationmethodatsedling stage

黃瓜是典型的喜溫蔬菜，生長發育適宜溫度為15～32^°C ，對低溫敏感， 10～12^°C 生長緩慢或停止，5^°C 可致冷害；也不耐高溫， 35^°C 和 40^°C 以上常分別導致生殖和生長障礙。黃瓜喜濕但也不耐高濕，適宜空氣濕度為 80%～90% ；空氣濕度與植株同化物的積累和分配顯著相關，空氣相對濕度增加，黃瓜結瓜數和總產量提高，干物質積累量增加，但濕度過高也會造成葉片膜脂過氧化，干物質積累隨之減少，引發霜霉病等侵染性病害；凈光合速率與葉面水汽壓差呈負相關3。早春和冬春設施栽培中，黃瓜常受到低溫加高濕度的濕冷環境脅迫，選育和應用耐濕冷品種是應對濕冷環境的重要措施，建立耐濕冷性鑒定方法和綜合鑒定體系對黃瓜耐濕冷性鑒定和品種選育具有重要意義。

目前，關于黃瓜耐寒冷性和耐熱性的研究比較深入[4，關于耐濕性的研究仍然很少，關于濕熱復合逆境[7和濕冷復合逆境[12-14]的研究也先后起步。抗性鑒定是植物抗逆育種和品種篩選的基本技術，也是抗逆性研究的重要內容。黃瓜耐寒性鑒定和耐熱性鑒定都已形成了系統的技術體系[15-23]，但耐濕熱性鑒定和耐濕冷性鑒定鮮有報道[24-25]，迫切需要深入系統地研究。

黃瓜幼苗期耐寒性和耐熱性都與成株期具有一致性，所以從種子發芽期、幼苗期到成株期都可以進行抗逆性鑒定。王偉平等開展黃瓜核心種質苗期耐冷性鑒定和品種篩選，在2葉1心期進行冷脅迫，根據葉片黃化癥狀將87份核心種質分為4組，篩選出不同耐冷種質，并利用重測序信息進行了GWAS分析。魏爽等在3葉1心期進行熱脅迫，以熱害指數為指標進行聚類分析把86份黃瓜核心種質劃分為四大類群。Liang等[23建立了黃瓜苗期 43^°C/38^°C 高溫處理后測定 H₂O₂ 含量和 Fq^′/Fm^′ 快速鑒定黃瓜耐熱性的方法。

黃瓜幼苗期耐濕熱性與成株期也有一致性，并已有基于苗期和成株期性狀對不同生態型黃瓜品種耐濕熱性鑒定的報道[]。筆者研究已觀察到黃瓜幼苗期耐濕冷性與成株期有密切關系，并建立了黃瓜耐濕冷性苗期綜合評價預測方程[25]。筆者采用人工氣候箱設置濕冷環境，對已知耐濕冷性不同的黃瓜品種幼苗進行濕冷脅迫處理，通過幼苗受濕冷害的形態特征分析，建立濕冷害指數鑒定法并驗證，以期為黃瓜耐濕冷性種質資源和栽培品種鑒定篩選提供新的技術支撐。

1 材料與方法

試驗于2019年9月至2021年12月在蔬菜生理生態與生物技術實驗室進行。

1.1供試材料和培養

根據前期試驗篩選結果，以耐濕冷性不同的13個黃瓜品種為試材（表1）。其中，鑒定法建立分別以耐濕冷性較強的博耐5號（BN5）和津優4號（JY4），耐濕冷性中等的中農26號（ZN26）和京研優勝（JYYS），耐濕冷性較弱的富陽F1-35（FY35）和秋勝（QS），濕冷敏感的三葉早（SYZ）和妙收313（MS）為試材；鑒定方法驗證分別以耐濕冷性較強的津優1號（JY1），耐濕冷性中等的長春密刺（CCMC），耐濕冷性較弱的雅美特2188（YMT）和荷蘭35（HL35），以及濕冷敏感的蔬研4號（SY4）為試材。

將供試種子（有種衣劑的先洗去種衣劑）室溫下浸種 ^4h ，然后放入 28^°C 恒溫箱中，黑暗環境催芽至種子露白，播入裝有育苗基質的50孔穴盤，置于人工氣候室培養。培養條件為：晝/夜溫度 25^°C1 18^°C ，空氣相對濕度 85% ，光周期 12h/12h ，白天光照強度 250μmol?m^-2?s^-1 。待子葉展開后，移栽于營養缽 （8cm×8cm） ，培養至2葉1心期。

1.2 鑒定條件和方法

濕冷處理在冷光源低溫人工氣候箱（RXD-1000D-LED型，寧波普朗特儀器有限公司）內進行。條件為：溫度 9^°C/5^°C （晝/夜） + 空氣相對濕度RH 95% ，光周期 12h ，白天光照強度250μmol?m^-2?s^-1 ，以 25^°C/18^°C （晝/夜） 1+RH85% 為對照。將各品種生長一致的2葉1心幼苗分別移入濕冷和對照條件下，每個材料3穴盤（每盤50株）作為3次重復，分別放在3個人工氣候箱中。

在濕冷處理7d時統計濕冷害指數，每個重復隨機選取5株測定形態指標。

1.3濕冷害指數計算方法

觀察幼苗生長點和相鄰展開真葉的受害情況，按如下標準逐株進行濕冷害分級。

0級：生長正常，無濕冷害癥狀；

1級：強耐濕冷，生長點沒有明顯受害，真葉受害面積小于或等于葉片的1/3；

2級：中耐濕冷，生長點受害，真葉受害面積大于1/3小于或等于2/3；

3級：弱耐濕冷，生長點受害嚴重，真葉受害面積大于2/3；

4級：濕冷敏感，植株受害死亡。

根據單株濕冷害分級結果，計算每個鑒定材料群體的濕冷害指數。

濕冷害指數 ：=Σ （濕冷害等級 × 該等級苗數）/（最高濕冷害等級 × 總苗數）。

1.4 幼苗形態指標測定方法

株高（SH）用直尺測量子葉節處至生長點距離；葉長（LL）和葉寬（LW）用直尺分別測量從上往下第2片真葉的最大葉長和葉寬。

1.5 數據處理與統計分析

采用MicrosoftOfficeExcel2010進行相關指標參數值的整理，計算形態指標相對值（處理值/對照值）并分析與耐濕冷性的關系；采用IBMSPSS21.0進行聚類分析和差異顯著性等統計分析。

2 結果與分析

2.1濕冷害指數鑒定法的建立

2.1.1濕冷處理后8個不同耐濕冷品種的形態表現濕冷處理7d后，8個耐濕冷性不同的試驗材料形態表現出不同的濕冷害癥狀（圖1）。濕冷敏感的品種三葉早（SYZ）和妙收313（MS）表現為植株嚴重失水萎蔫至死亡，基本無健康組織或部位；弱耐濕冷的品種富陽F1-35（FY35）和秋勝（QS）表現為葉片、葉柄、主莖均出現嚴重失水萎蔫，葉片未失水面積僅約1/3，主莖基部尚好；中耐濕冷的品種中農26號（ZN26）和京研優勝（JYYS）表現為幼苗生長受到嚴重抑制，葉片大面積失水萎蔫，真葉葉脈黃化嚴重，生長點萎蔫，葉片未失水凋亡面積約1/2，葉柄黃化萎蔫，但主莖尚好；強耐濕冷的品種博耐5號（BN5）和津優4號（JY4）表現為生長受到抑制，葉片呈現水漬狀，葉片邊緣萎蔫，真葉的部分葉脈黃化，但葉片仍有2/3以上面積呈正常綠色狀態，葉柄和莖稈尚好。

2.1.2濕冷處理后8個不同耐濕冷品種的濕冷害指數根據濕冷處理各品種幼苗的形態特征進行濕冷害分級，計算出各品種的濕冷害指數，結果見表2。可以看出，8個試驗品種的濕冷害指數均準確區分了不同品種的耐濕冷性。2個強耐濕冷品種的濕冷害指數在 0.204～0.246，2 個中耐濕冷品種的濕冷害指數在 0.452～0.508，2 個弱耐濕冷品種的濕冷害指數在 0.706～0.748，2 個濕冷敏感品種的濕冷害指數在0.951＼～0.987。因此，濕冷害指數能準確定量反映品種的耐濕冷特性；濕冷害指數越低，品種的耐濕冷性越強；濕冷害指數越高，品種的耐濕冷性越弱。

在定量鑒定品種濕冷性的同時，還可根據濕冷害指數對品種耐濕冷性進行定性分類，即強耐濕冷型， 0lt; 濕冷指數 ≤0.250 ；中耐濕冷型， 0.250lt; 濕冷指數 ?0.550 ；弱耐濕冷型， 0.550lt; 濕冷指數 ；濕冷敏感型， 0.750lt; 濕冷指數 。

2.2 濕冷害指數鑒定法的驗證

2.2.1濕冷處理后5個不同耐濕冷品種的形態表現驗證試驗中，濕冷處理7d后5個驗證材料形態也表現出不同的濕冷害癥狀（圖2）。濕冷敏感的品種蔬研4號（SY4）植株嚴重失水萎蔫至死亡，基本無健康組織；弱耐濕冷的品種雅美特2188（YMT）和荷蘭35（HL35）葉片、葉柄和主莖均嚴重失水萎蔫，葉片未失水面積僅約1/3，但主莖基部尚好；中耐濕冷的品種長春密刺（CCMC）生長受到嚴重抑制，葉片大面積失水萎蔫，真葉葉脈嚴重黃化，生長點萎蔫，葉片未失水凋亡面積約1/2，葉柄黃化萎蔫，但主莖尚好；強耐濕冷的品種津優1號（JY1）幼苗生長受到抑制，葉片呈現水漬狀，邊緣萎蔫，真葉的部分葉"脈黃化，但葉片仍有2/3以上面積呈正常綠色狀態， 葉柄和莖稈尚好。

2.2.2濕冷處理后5個不同耐濕冷品種的濕冷害指數根據濕冷處理5個驗證品種幼苗的形態特征進行濕冷害分級，計算濕冷害指數結果（表3）。可以看出，5個驗證品種的濕冷害指數均準確區分了不同品種的耐濕冷性。強耐濕冷性品種津優1號（JY1）濕冷害指數為0.213，在0＼～0.250之間；中耐濕冷性品種長春密刺（CCMC）濕冷害指數為0.453，在 0.250～ 0.550之間；弱耐濕冷性品種雅美特2188（YMT）和荷蘭35（HL35）的濕冷害指數分別為0.721和0.739，均在0.550＼～0.750之間；濕冷敏感性品種蔬研4號（SY4）濕冷害指數為0.955，在 0.750～1.000 之間。驗證品種的濕冷害指數均能準確定量反映品種的耐濕冷特性，濕冷害指數越低，品種耐濕冷性越強，說明濕冷害指數可用于黃瓜品種耐濕冷性鑒定。

2.2.3濕冷處理對不同耐濕冷品種幼苗生長的影響濕冷處理7d后處理與對照的13個品種幼苗生長指標相對值見表4。可以看出，各品種株高、葉長和葉寬3個指標的相對值均小于1，說明其生長受到了不同程度的抑制；相對值越小，受抑制程度越重。品種間3個指標相對值均有顯著差異，耐濕冷性強的品種，生長受抑制的程度較弱；耐濕冷性弱的品種，生長受抑制的程度較強。3個指標相比，以株高相對值最小，說明株高指標對濕冷脅迫更敏感。

2.2.4濕冷處理不同耐濕冷品種幼苗形態指標和濕冷害指數的聚類分析對形態指標相對值和濕冷害指數進行聚類分析（圖3），在歐式距離為5時把13個品種分為4類。第1類品種有津優4號（JY4）、津優1號（JY1）和博耐5號（BN5），均為強耐濕冷型；第2類品種有長春密刺（CCMC）、京研優勝（JYYS）和中農26號（ZN26），均為中耐濕冷型；第3類品種有秋勝（QS）、雅美特2188（YMT）、富陽F1-35（FY35）和荷蘭35（HL35），均為弱耐濕冷型；第4類品種有妙收313（MS）、蔬研4號（SY4）和三葉早（SYZ），均為濕冷敏感型。這與濕冷害指數定性分類結果一致。

3 討論與結論

植物抗逆性鑒定方法多種多樣，從技術手段來說，有形態學鑒定、組織細胞學鑒定、生理生化鑒定、分子生物學鑒定等。形態學鑒定具有直觀、不需要特殊儀器設備等特點；從鑒定時期來說，有發芽期鑒定、幼苗期鑒定、開花結果期鑒定、成株期鑒定等。發芽期和幼苗期鑒定屬于早期鑒定，具有時間周期短、節省試驗空間、效率高等優勢；從鑒定條件來說，有自然條件下鑒定和人工環境鑒定。人工環境鑒定具有鑒定條件穩定易控、不受自然季節影響、一年任何時間都可以連續在相同環境下重復開展鑒定工作等優勢。由于不同生育時期的抗逆性具有較高的一致性，早期鑒定常成為鑒定技術研究的重點。

葉片失水褪綠及萎蔫是植物冷害的主要形態表現，基于這些形態特征的冷害指數常作為蔬菜耐低溫鑒定的指標，并據此建立了黃瓜[1、甜瓜[2等耐寒冷性評價方法。筆者觀察濕冷處理后葉片受害面積和幼苗形態表現，建立了黃瓜耐濕冷性苗期濕冷害指數鑒定法，除了用驗證品種進行驗證外，形態指標和濕冷害指數聚類等分析結果也印證了該鑒定法的準確性和可靠性。

利用多元統計學方法建立多指標的回歸方程預測抗逆性，是植物和黃瓜抗逆性鑒定方法研究的熱點之一[18-19.24]。筆者也曾報道了在黃瓜苗期測算濕冷處理和對照條件下生長和生理生化指標的相對值，通過主成分分析簡化變量和逐步回歸尋優，建立了包含相對CAT活性、相對Pro含量和相對PPO活性3個自變量的黃瓜耐濕冷性預測方程[25]。該方法可以通過生理生化指標所承載的生物信息，綜合預測黃瓜的耐濕冷特性。苗期濕冷害指數鑒定法，屬于形態學鑒定方法，與生理生化等綜合鑒定方法相比具有易實施和操作簡便的特點，而且兩項研究中所用研究材料相同，兩種方法對各鑒定材料的定位也是一致的。因此，這兩種鑒定方法都可以用于黃瓜品種資源耐濕冷性鑒定和評價。

通過對8個試驗品種和5個驗證品種濕冷處理后幼苗生長和葉片進行形態學觀察和濕冷害分級，建立了黃瓜品種資源耐濕冷性苗期濕冷害指數定量鑒定和定性評價方法。具體方法是：將待鑒定材料育成2葉1心期苗，置于人工氣候箱溫度 9°C/ 5^°C （晝/夜） + 空氣相對濕度RH 95% 、光周期 12h 、白天光照強度 250μmol?m^-2?s^-1 條件下進行濕冷處理7d，按照下列標準進行單株濕冷害分級，0級：生長正常，無濕冷害癥狀；1級：強耐濕冷，生長點沒有明顯受害，真葉的受害面積小于葉片的1/3；2級：中耐濕冷，生長點受害，真葉的受害面積大于1/3小于2/3；3級：弱耐濕冷，生長點受害嚴重，真葉的受害面積大于2/3；4級：濕冷敏感，植株受濕冷害死亡。根據單株濕冷害分級計算每個鑒定材料群體的濕冷害指數，形成定量評價結果。根據濕冷害指數大小進行定性評價，即 0lt; 濕冷指數 ≤0.250 ，為強耐濕冷型；0.250lt; 濕冷指數 ?0.550 ，為中耐濕冷型； 0.550lt; 濕冷指數 ?0.750 ，為弱耐濕冷型； 0.750lt; 濕冷指數 ? 1.000，為濕冷敏感型。

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