響應面法優化黃芩水提物的提取工藝及其抑菌活性研究

中圖分類號：TS201.2文獻標識碼：A文章編號：1008-0457（2025）03-0001-09

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2025.03.001

黃芩（ScutellariabaicalensisGeorgi）為唇形科多年生草本植物的干燥根，作為我國傳統的中藥材之一，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌等多種藥理作用，被廣泛應用于臨床治療和養殖業[1-3]。現代研究表明，黃芩主要作為綠色飼料添加劑應用于動物養殖，對畜禽的各種炎癥和細菌性感染均有較好的治療作用[45]。有文獻報道，黃芩根中含有大量的黃酮類成分[，有“天然抗生素”的美譽，主要含有黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和白楊素等黃酮類化合物[7]，具有抗病毒、抗菌、清熱解毒、泄火清心等功效[8

隨著傳統中藥資源的深度開發利用以及抗生素的濫用，黃芩作為“替代抗生素”藥物已成為研究熱點。前期研究表明，黃芩素具有廣譜抗菌作用，可有效抑制蛋雞輸卵管炎常見的致病菌，如大腸桿菌、沙門氏菌等[9-10]。此外，黃芩提取物還具有顯著的抗炎作用]，能夠減輕炎癥反應和組織損傷[12-13]。目前，黃芩常見的提取方法主要有水煎煮法[14]、超聲提取法[15]、乙酸乙酯萃取法[16]醇提法[7]等。有研究對黃芩的多種提取方法進行了藥效評估，發現其水提物具有較好體外抑菌和抗炎效果[18-9]。近年來，生物技術的快速發展為從植物中提取黃酮類化合物提供了更簡單高效的提取技術，提高了提取效率和純度[20]。對提取工藝的研究多采用正交試驗設計法，且大多的工藝評價僅以黃芩苷為評價指標，具有一定的局限性。因此，本研究采用響應面法，以黃芩中黃芩苷和總黃酮作為提取工藝的評價指標具有一定參考價值。

響應面法能最大限度地減少試驗次數并考慮試驗變量間的相互作用而被廣泛應用于提取參數的優化[21]。Box-Behnken 設計（Box-Behnken Designs，BBD）是最常用的響應面模型之—[22]，該法可通過預測提取條件和提取因素之間的交互作用關系來優化試驗條件。本研究采用總評歸一結合響應面法優化黃芩水提物的提取方法，并通過與體外抗菌試驗相結合的方法探究黃芩提取物在最佳提取工藝下的潛在“替代抗生素”活性，在充分挖掘黃芩抗菌活性的同時，為黃芩資源的開發應用提供試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗所用黃芩購自江西臻藥堂藥業股份有限公司；黃芩苷標準品（中國獸醫藥品監察所）；蘆丁標準品（上海源葉生物科技有限公司）；大腸桿菌（ATCC25922）、沙門氏菌（ATCC13314）和金黃色葡萄球菌（ATCC25923）標準菌購自中國微生物菌種保藏中心；36株大腸桿菌、26株沙門氏菌及20株金黃色葡萄球菌由眾樂中藥功能成分工程技術研究中心（濰坊）有限公司贈送；LB培養基（索萊寶生物科技有限公司）；甲醇、乙腈、磷酸（美國TEDIA有限公司，色譜級）；亞硝酸鈉、硝酸鋁（上海麥克林生化科技股份有限公司）；氫氧化鈉（山東科源生化有限公司）；無水乙醇（成都金山化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

真空冷凍干燥機（寧波新藝超聲設備有限公司）；ZNHW數顯電熱套（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；LHS-100-A恒溫培養箱（鞏義市宏華儀器設備工貿有限公司）；高效液相色譜儀（Waters公司）；紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）。

1.3 色譜條件

色譜柱采用Hypersil ODS（ 150mm×4.6mm ，5mm ），流動相A相為乙腈，B相為 0.05% 磷酸水溶液，以體積 30%：70% （A：B）的比例進行洗脫，流速 1.00mL/min ，柱溫 30% ，進樣量 10μL

1.4 試驗方法

1.4.1黃芩水提物的制備

取黃芩藥材，按照一定的料液比加入蒸餾水充分浸泡，煎煮一定時間和次數后過濾，合并濾液濃縮至 1mg/mL （按生藥量計算），得到黃芩水提物濃縮液（ C=m/V ，其中 c 代表黃芩水提物濃縮液濃度， m 代表黃芩藥材生藥質量， V 代表濃縮后的體積），冷凍干燥 ^48h 后得到黃芩水提物[23]

1.4.2黃芩苷和總黃酮含量的測定

黃芩苷含量的測定采用《中國藥典》（2020版）中規定的黃芩苷測定方法（HPLC法）[24]，精密稱取黃芩苷標準品適量，配制質量濃度為20、40、80、

160Ω.320μg/mL 的溶液，按照1.3中色譜條件進行測定，重復進樣3針。以黃芩昔的濃度為橫坐標，色譜峰峰面積為縱坐標繪制標準曲線，并計算相關系數 （R²） 。

總黃酮含量采用紫外分光光度法進行測定[25]。配制 0.1mg/mL 的蘆丁標準溶液，取不同體積的標準溶液置于容量瓶中，依次加入 5% NaNO₂ 、 10% Al （ NO₃）₃.1.0 mol/LNaOH 溶液，用60% 乙醇定容，在 510nm 波長處測定吸光度。總黃酮的標準曲線以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制。將適量的提取液加入一定的蒸餾水于容量瓶中定容，按上述方法測得樣品吸光度，代入回歸方程，計算黃芩中黃芩昔含量和總黃酮含量。

1.4.3單因素試驗設計

本研究設置不同的料液比 $（ 1 ＼colon 1 3 ＼ 、 1 ＼colon 1 5 ＼ 、 1 ＼colon 1 7$ ）、提取次數（1、2、3、4、5次）和提取時間 （1.5，2.0，2.5，3.0，3.5h） 作為影響提取過程的因素，以黃芩昔和總黃酮的含量為檢測指標，試驗設計見表1。

1.4.4總評歸一法結合響應面法優化提取工藝參數

本試驗參考文獻方法[22]，采用總評歸一法優化提取參數，因提取效果僅使用總黃酮含量作為評價的指標不足以代表效果的優劣，故對黃芩昔和總黃酮含量2個指標的總評歸一值（Overall Desirability，O_p ）作為響應值進行綜合評分，選用Hassan法對這2個指標進行歸一化處理，2個指標的取值越大表明黃芩水提物的活性越高。計算公式為 d_i=（Y_i- ，其中 d_i 為各指標的 O_p 值， Y 為指標測量值， Y_min 為指標中最小值， Y_max 為指標中最大值； O_D=（d₁+d₂+d₃+…d_k）/k ，其中 k 為指標數[26-27]。以單因素試驗結果作為基礎，選取料液比、提取次數和提取時間中影響較大的因素作為考察因素，采用三因素三水平的響應面分析法設計響應面試驗，優化黃芩中黃芩苷和總黃酮的提取工藝參數，確定最佳提取工藝。

1.4.5黃芩水提物的抗菌活性評估

體外抑菌試驗通過采用微量二倍稀釋法（即96孔板法）[28]對黃芩水提物的抑菌活性進行測定。取黃芩水提液經微孔濾膜 （0.22μm） ）濾過，用LB培養基成倍稀釋8個濃度梯度后，依次加入微量最低抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration， P_MIC ）測定板中，每孔 0.1mL ，分別加入3種菌懸液（大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌），每孔 0.1mL 陽性對照各加入菌懸液和液體培養基 0.1mL ，陰性對照加入液體培養基 0.2mL 。將微量 P_MC 測定板置于 37^°C 恒溫培養箱中培養 24h 后觀察，在陰性對照完全沒有細菌生長時檢測得到的最低藥物濃度即為 P_MIC ，并參考文獻方法[29]繪制曲線計算黃芩水提物 P_MIC50 和 P_MICS0 （即在一批試驗中能抑制50% 和 90% 受試菌生長所需的 P_MC ）。

1.4.6 數據處理

采用MicrosoftExcel2O1O和IBMSPSSStatistics26.0進行數據處理與分析。應用Design-Expert軟件建立響應面模型擬合對響應面的考察因素和評價指標進行處理，單因素方差分析對模型進行驗證，檢驗各處理組之間的差異顯著性（ 。

2 結果與分析

2.1單因素試驗結果分析

2.1.1料液比對黃芩中黃芩苷和總黃酮含量的影響

基于1.4.2試驗方法得到黃芩昔標準曲線方程為： Y=194 643x+854.2 1 R²=0.9997 ），總黃酮標準曲線方程為： Y=0.340 5x+0.123 9 （ R²= 0.9994）。由表2可知，料液比為 時 O_p 值最大，料液比小于 1：17g/mL 時， O_p 值隨著料液比的增加而增加。當料液比大于 1：17g/mL 時， O_p 值則開始下降，初步推測可能是由于溶劑含量的增加，其他易溶于水的成分也被提取出來，導致 O_p 值降低。因此，選擇 1：15g/mL 、 1：17‰ 、1：19g/mL 作為響應面的優化水平更合理。

2.1.2提取次數對黃芩中黃芩苷和總黃酮含量的 影響

由表3可知，當提取次數為3次時， O_p 值最大，提取次數少于3次時， O_p 值隨著提取次數的增加而增加。然而當提取次數大于3次時， O_p 值則開始降低。可能是由于提取次數的增加，導致某些黃酮類化合物的結構被破壞，使 O_p 值降低。因此，選擇提取2、3、4次作為響應面的優化水平更為合理。

2.1.3提取時間對黃芩中黃芩苷和總黃酮含量的影響

由表4可知，當提取時間為 2.5h 時， O_p 值最大，提取時間小于 2.5h 時， O_p 值隨提取時間的增加而增加。當提取時間大于 2.5h 時， O_p 值則開始降低。可能是由于提取時間的延長，黃酮類成分的結構發生變化，或其他類物質大量溶出，最終導致 O_p 值降低。因此，選擇提取 2.0，2.5，3.0h 作為響應面的優化水平更為合理。

2.2總評歸一結合響應面法優化提取工藝參數的結果

2.2.1試驗設計及結果

根據單因素試驗結果，本試驗將料液比（A）、提取次數 （B） 和提取時間 （C） 作為考察因素，篩選出3水平作為考察水平（表5），以黃芩水提物中黃芩昔和總黃酮含量為評價指標，采用三因素三水平Box-Behnken響應面法對試驗進行設計，試驗設計及結果見表6。

2.2.2建立響應面模型擬合及方差分析

采用Design-Expert軟件，以料液比（A）、提取次數 （B） 和提取時間 （C） 作為變量，評價指標選取黃芩水提物中黃芩苷和總黃酮含量， O_p 值評分為響應值，依據響應面結果回歸方程為： O_D=0.99+ 0.041A-0.019B-0.34C+0.070AB+0.00675AC+ 0.015BC-0.21A²-0.24B²-0.39C² 。響應面模型方差分析及顯著性檢驗結果見表7。由表7可知，此模型差異具有統計學意義（ Plt;0.01 ），且模型對該試驗的擬合度較好（失擬項 F=6.17，P=0.0555gt; 0.05）。由矯正系數 （R_Adj²=0.9957 ）、預測復相關系數（ R²=0.9981 ），預測相關系數（ R_Pred²=0.9747 可知，偏差在合理范圍內，實際值和預測值擬合度較好。

2.2.3響應面優化分析

響應面3D圖及等高線分析圖如圖1所示。結合表7的 P 值可知 A、C、AB、A²、B²、C² 因素對 O_p 值均具有顯著性（ Plt;0.01 ）。由圖1可知，料液比和提取時間對響應面弧面影響較大，料液比和提取次數的交互作用對 O_p 值影響較大。故最終確定最佳提取工藝參數為料液比 1：172 3g/mL 、提取次數3次、提取時間 2.38h ，此條件下 O_p 值為0.98。

2.2.4 工藝驗證

將2.2.3優化后的工藝參數進行3次平行試驗，考慮到實際操作的可行性，將試驗參數進行取整處理，確定為料液比 、提取次數3次、

提取時間 2.5h ，得到的 O_p 均值為0.99，與預測值0.98相比偏差為 1.02% ，說明本試驗所建模型預測性較好且相對穩定。

2.3黃芩水提物的抗菌活性評估結果

2.3.1 對大腸桿菌的抑菌作用

黃芩水提物對大腸桿菌的抑制作用見表8和表9。由表8可知，36株大腸桿菌中有2株菌株在藥液濃度為 10mg/mL 時停止生長，有20 株大腸桿菌菌株在藥液濃度為 20mg/mL 時停止生長，有14 株大腸桿菌菌株在藥液濃度為 40mg/mL 時停止生長，其余藥液濃度無明顯抑菌作用。由表9可知，黃芩水提物的藥液濃度在 20mg/mL 和40mg/mL 時，被抑制生長的大腸桿菌菌株數分別達到了 61.11% 與 100% ，可見黃芩水提物對36株大腸桿菌均有不同程度的抑菌作用，且 P_MC50 為18.00mg/mL P_MIC90 為 34.86mg/mL 。

2.3.2 對沙門氏菌的抑菌作用

黃芩水提物對沙門氏菌的抑制作用見表10和表11。由表可知，26株沙門氏菌中有1株菌株（ 3.85% ）在藥液濃度為 2.5mg/mL 時可見停止生長，有4株菌株 （15.38% ）在藥液濃度為 5mg/mL 時停止生長，有9株菌株 34.62% ）在藥液濃度為10mg/mL 時停止生長，有11株菌株 （42.31% ）在藥液濃度為 20mg/mL 時停止生長，有1株菌株（ 3.85% ）在藥液濃度為 40mg/mL 時停止生長，其余藥液濃度無明顯抑菌作用。可見黃芩水提物對26株沙門氏菌均有不同程度的抑菌作用，其中對沙門氏菌菌株 A₂ 的抑菌效果最好，且 P_MIC50 為9.47mg/mL P_MIC90 為 18.26mg/mL 。

2.3.3對金黃色葡萄球菌的抑菌作用

黃芩水提物對金黃色葡萄球菌的抑制作用見表12和表13。由表12可知，20株金黃色葡萄球菌均在藥液濃度為 10mg/mL 時可見停止生長，其余藥液濃度無明顯抑菌作用。由表13可知，黃芩水提物的藥液濃度在 10mg/mL 時，被抑制生長的金黃色葡萄球菌菌株數達到 100% ，可見黃芩水提物對20株金黃色葡萄球菌均有一定程度的抑菌作用，且 P_MC50 與 P_MC90 均為 10mg/mL 。

3 討論與結論

黃芩中黃酮類化合物的提取方法較多，林玉萍等[30]與劉潔等[31]采用乙醇加熱回流提取黃酮，經萃取、濃縮后的提取率分別為 5.8% 和 1% 。郭振庫等[32]和程存歸等[33]采用微波法提取黃芩苷，發現其提取率分別為 13.12% 和 14.51% 。于千等[34]采用水煎法提取黃芩，在最佳條件下提取率為 10.56% 。李杰等[35]采用超聲輔助提取法對黃芩中黃芩苷、漢黃芩苷和黃芩素進行提取，3種黃酮類成分的總得率為 230mg/g 。從這些提取方法來看，盡管水提取法沒有最佳的提取率，但根據具體情況，在應用到臨床和畜牧業上時，有機溶劑提取法存在較大的安全隱患；微波提取法和超聲提取法能耗高，容易破壞活性物質；唯有水提取法安全性高、成本較低、提取率較好，可實現工業化生產。故本試驗選擇水提取法最佳的工藝條件及參數，可提高黃芩中黃酮類成分的提取率，以便充分發揮其功效。

大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌等是常見的食品污染菌、飼料添加劑污染菌和致病菌，對人類及牲畜的健康構成嚴重威脅[36]。近年來，中醫藥治療細菌性感染的研究日益增多。特別是在運用抗生素治療時加入中藥，或直接用中藥替代抗生素治療可以有效提高抗菌活性，并降低抗生素的不良反應，其中黃芩在大多中藥中表現出較高的應用潛力。黃芩具有廣譜抗菌作用，與青霉素、頭孢菌素、喹諾酮類等抗菌藥物都可協同發揮抗菌的作用[37]。崔一喆等[38]通過測定黃芩提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌的體外抑菌活性，發現其對3種病原菌均具有一定的抑制作用，其中對金黃色葡萄球菌的抑制活性最強。劉柏杉等[39]表示黃芩提取物對金黃色葡萄球菌具有明顯的體外抗菌活性（ P_MIC 為 1.25g/L ），劉俊俊等[40]也指出黃芩水提物能使金黃色葡萄球菌生長速度降低，作用明顯。此外何湘蓉等[4通過比較發現黃芩水提取物對已經產生耐藥性的金黃色葡萄球菌的抑菌作用強于其醇提取物。任明星等[42研究發現黃芩苷可顯著降低小鼠體內的細菌數，有效抑制其增殖。這些研究表明，黃芩提取物可以通過抑制病原菌的生長和繁殖發揮其防治細菌性疾病的作用，且對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等菌株均表現出十分良好的抗菌和殺菌作用。本研究結果與以上研究相符，采用響應面法優化黃芩提取物水提取法的工藝參數，并在最佳提取工藝參數下探究黃芩水提物的抑菌活性，以此揭示黃芩的“替代抗生素”作用。

本試驗通過總評歸一響應面法，以黃芩水提物中黃芩苷和總黃酮含量為評價指標，料液比、提取次數和提取時間作為考察因素，對黃芩的提取工藝參數進行優化，得到最佳提取工藝：液料比 1：17 、提取次數3次、提取時間 2.5h.O_p 值0.99、黃芩苷含量 12.26% 、總黃酮含量 32.08% ，該條件下黃芩水提物對大腸桿菌的 P_MC50 為 18.00mg/mL?P_MIC90 為 34.86mg/mL ，對沙門氏菌的 P_MCS0 為 9.47mg/mL 、P_MIC90 為 18.26mg/mL ，對金黃色葡萄球菌的 P_MC50 和 P_MC90 均為 10mg/mL 。黃芩水提物因富含黃芩昔和總黃酮等活性成分具有明顯的廣譜抑菌效果，通過對其進行工藝參數的優化得到一種高效提取方法，使黃芩作為“替代抗生素”產品在畜牧業領域中具有較好的應用前景，為黃芩資源價值的開發應用提供試驗基礎。

（責任編輯：嚴秀芳 胡吉鳳）

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Optimization of the Extraction Process and Antibacterial Activity of Aqueous Extract of Scutellaria baicalensis by Response Surface Method

Cao Jiangsong，Wei Qing，Zhan Jun，Gao Depan， Jian Bingbing，Zhang Jing*（Experimental Animal Institute， Guizhou Universityof Traditional Chinese Medicine，Guiyang 55oO25，Guizhou，China）

Abstract：Todetermine theoptimal extractionconditionsandantibacterialactivityfortheaqueousextractof Scutelaria baicalensis，which were used asevaluation material and extracted by aqueous extraction.The contents of baicalin and totalflavonoids were usedasevaluation indicators for processoptimization.The processparameters were optimized by the total evaluation normalized-response surface method.The antibacterial activityof theoptimized extract was evaluated using the broth microdilution method，and the Minimum Inhibitory Concentration （ P_MC"）against different bacterial strains was determined.The resultsindicated that theoptimal extraction conditions for theaqueousextractof S baicalensis wereamaterial-to-liquid ratioof1：17，three extractioncycles，andan extractiontimeof2.5h.Under these conditions，the contents of baicalein and total flavonoids reached 11.97% and 27.03% ，respectively.Additionally，in vitro bacteriostatic tests showed that the P_MC50"and P_MIC90"of the extract against Escherichia were 20 mg/mL and 40 mg/mL， against Salmonella with P_MCS0"of 10 mg/mL and P_MIC90"of 20mg/mL ， and against Staphylococcus aureus with P_MICS0"and （20 P_MC90"of 10 mg/mL，respectively. These results demonstrate that S . baicalensis aqueous extract possesses significant antibacterial activity. In conclusion，under its optimal extraction conditions，the aqueous extract of S .baicalensis could effctivelyinhibitthegrowthandreproductionof variouspathogenic bacteria，suggestingits high antimicrobial activity and itspotential asan‘alternative antibiotic’in thetreatmentof bacterial infections.Thisstudy shows thatasan ‘alternative antibiotic’product，S.baicalensis has a beter application prospect in animal husbandry.This study provides a new experimental basis for the development and application of traditional Chinese medicine.

Keywords;Scutellaria baicalensis Georgi；baicalin；totalflavonoids；responsesurface method；antimicrobial activity