超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定禽蛋及禽蛋制品中酰胺醇類藥物及其代謝物殘留量的方法優(yōu)化

中圖分類號：TS207 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-0769（2025）03-0056-06

禽蛋及禽蛋制品因氨基酸組成與人體所需相似、易消化吸收、獲取便捷且性價比高等特點，成為城鄉(xiāng)居民餐桌上不可或缺的大宗農(nóng)產(chǎn)品[1]，對保障居民生活具有重要意義。當(dāng)前，人們不僅關(guān)注其營養(yǎng)價值，而且對質(zhì)量安全的重視程度達(dá)到空前高度。由于家禽飼養(yǎng)密度高，疾病多發(fā)，在疾病預(yù)防和治療過程中，酰胺醇類抗生素因?qū)γ舾芯l(fā)的細(xì)菌性疾病具有良好的治療效果，被廣泛應(yīng)用于動物生產(chǎn)。然而，有些養(yǎng)殖戶為預(yù)防家禽疾病，違規(guī)超量用藥或延長用藥周期，導(dǎo)致禽蛋和禽蛋制品中藥物殘留問題加劇，埋下食品安全隱患。消費者長期食用含有抗生素殘留的禽蛋或禽蛋制品，殘留物會在體內(nèi)蓄積，促使病菌產(chǎn)生耐藥性，給身體健康造成潛在或直接危害。針對酰胺醇類抗生素殘留問題的嚴(yán)重性和普遍性，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部以及其他相關(guān)部門將其列為國家食品安全抽檢及食用農(nóng)產(chǎn)品安全監(jiān)控重點，并制定了嚴(yán)格的法規(guī)。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2020年發(fā)布的《食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號），明確禁止氯霉素及其鹽、酯的使用；2022年發(fā)布的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中41種獸藥最大殘留限量》（GB 31650.1-2022） ，則對禽蛋中的部分酰胺醇類抗生素的最高殘留限量和殘留標(biāo)示物作出規(guī)定，如甲礬霉素及氟苯尼考的最高殘留限量值均為 。

目前，氯霉素類藥物殘留的檢測方法主要有微生物法[2]、酶聯(lián)免疫法[3]、氣相色譜法[4]、液相色譜法[5]、氣相色譜-質(zhì)譜法[6-7]、液相色譜-質(zhì)譜法[8-10]等。大多數(shù)方法普遍存在靈敏度不足、操作流程繁瑣以及結(jié)果可靠性欠佳等問題，本方法擬基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立一種針對禽蛋及禽蛋制品中酰胺醇類抗生素殘留量的檢測方法，實現(xiàn)對禽蛋及禽蛋制品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺等酰胺醇類抗生素殘留物的同步定性定量分析。該方法可有效解決禽蛋及禽蛋制品因脂肪含量高、基質(zhì)干擾嚴(yán)重等導(dǎo)致的分析技術(shù)問題，具有較好的科學(xué)性和適用性，旨在為禽蛋及禽蛋制品安全監(jiān)管工作提供有力的技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

1.1.1儀器

N-EVAP-24型氮吹儀（美國OrganomationAssociates公司）；多管旋渦混合儀（杭州米歐儀器有限公司）、賽多利斯BSA3202S型天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）、SIGMA3-18K高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）、Milli-QIntegral3型超純水儀（美國Millpore公司）、超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）、Aglient1290超高效液相色譜儀（美國Aglient公司）、配備電噴霧（electionspraylonization source，ESI）離子源的AB SciexTripleQuadTM 5500質(zhì)譜儀（美國ABSciex公司）。

1.1.2試劑

乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、氨水（分析純）等均購自市場。

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺和氯霉素 -D₅ 的純度均高于 90.0% （德國Dr.Ehrenstorfer公司）。

1.2樣本制備

試驗選取雞蛋和鹵蛋作為禽蛋和禽蛋制品的代表性基質(zhì)。從原始樣本中選取約500g代表性樣本，充分搗碎并混合均勻，平均分為兩份，分別放置于潔凈容器中，密封并標(biāo)注清晰，—18 ^°C 避光保存。樣本制備過程中確保無菌，避免污染，并確保殘留物含量穩(wěn)定。

1.3標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

準(zhǔn)確稱取氯霉素、甲礬霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺和氯霉素 -D₅ 標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為 1.00mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于 0～4 ^°C 避光冷凍保存，有效期12個月。取適量各標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用甲醇逐級稀釋，配制所需的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4樣本前處理

1.4.1前處理條件的優(yōu)化

本試驗擬分析禽蛋制品中酰胺醇類藥物的殘留量，對乙腈、甲醇、乙酸乙酯和氨水等多種常用提取溶劑及其組合的效能進(jìn)行評估。對比甲醇、乙腈與乙酸乙酯的提取性能時發(fā)現(xiàn)，三種溶劑均能有效溶解酰胺醇類藥物。但甲醇和乙腈水溶性較強(qiáng)，而乙酸乙酯與水不相溶，作為提取溶劑時可顯著減少樣本水分吸收，使后續(xù)氮吹濃縮步驟更高效徹底?？紤]到氟苯尼考胺在堿性條件下更易溶于有機(jī)溶劑，試驗最終選用乙酸乙酯與氨水的混合物作為提取溶劑。

在提取溶劑確定的情況下，試驗對比了正己烷脫脂凈化和固相萃取凈化兩種方法的處理效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種方法對大多數(shù)目標(biāo)化合物均表現(xiàn)出較高的回收率。然而，OasisPRiMEHLB固相萃取柱價格高昂（每支 200mg/6cc 規(guī)格售價約50元），且操作步驟繁瑣。相比之下，正己烷脫脂處理后的樣本澄清透亮，雜質(zhì)少，可有效降低上機(jī)檢測時的基質(zhì)效應(yīng)，回收率穩(wěn)定。同時，正己烷脫脂法簡化了操作步驟，減少了耗材的使用。因此，綜合考慮成本、操作簡便性和凈化效果等因素，本試驗最終選擇乙酸乙酯-氨水作為提取溶劑，選用正己烷脫脂作為凈化手段。

1.4.2前處理步驟

準(zhǔn)確稱取5.00g均質(zhì)試樣置于50mL離心管中，加入100μL氯霉素氘代內(nèi)標(biāo)（氯霉素 -D₅） 中間液。隨后，加入20mL乙酸乙酯，手搖充分震蕩混勻，再依次加入0.6mL氨水、5.00g無水硫酸鈉，渦旋5min后，9000r/min離心5min，移取5.0mL上清液至氮吹儀，40℃水浴下氮吹至近干。殘留液中加入1mL水和2mL正己烷，渦旋混勻1min，9000r/min離心5min，取下層液體過微孔濾膜后，作為待測樣本供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.5超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/ MS）條件

1.5.1超高效液相色譜條件

試驗對甲醇-水、乙腈-水、乙腈 -0.01% 甲酸溶液和乙腈-氨水溶液四種流動相在酰胺醇類藥物檢出效果上的影響進(jìn)行了評估。對比結(jié)果顯示，以甲醇-水作為流動相時，分離效果不佳。在乙腈中加入 0.01% 的甲酸，雖能在ESI正模式下提高藥物的離子化程度，但同時會降低ESI負(fù)模式下藥物的響應(yīng)值。具體而言，與乙腈-水和乙腈 -0.02% 氨水溶液相比，使用乙腈 -0.01% 甲酸溶液作為流動相時，氯霉素、甲礬霉素、氟苯尼考和氯霉素 -D₅ 的響應(yīng)值均降低了1個數(shù)量級。因此，流動相中不宜添加酸?？紤]到氟苯尼考胺含有 NH₂ 官能團(tuán)，極性強(qiáng)，且在堿性環(huán)境下響應(yīng)較好，為平衡正負(fù)離子切換模式下酰胺醇類藥物檢測結(jié)果的科學(xué)性和有效性，本方法最終選擇乙腈-氨水溶液作為流動相。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，氨水的添加量超過 0.1% ，會嚴(yán)重抑制氯霉素等三種負(fù)源物質(zhì)的靈敏度。經(jīng)過多次試驗確定，加入 0.02% 氨水可兼顧氟苯尼考胺的峰型和4種負(fù)源組分的響應(yīng)值，最終，氟苯尼考胺、氟苯尼考、甲砜霉素、氯霉素、氯霉素 -D₅ 五種組分同時分析，選用的流動相方案為 0.02% 氨水溶液+乙晴梯度洗脫程序，其分離度、靈敏度都能達(dá)到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)要求。優(yōu)化后的超高效液相色譜條件如下：

色譜柱：ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，3.0mm ×100 mm）；流動相A為 0.02% 氨水溶 液；流動相B為乙腈；柱溫40.0 ^°C ；進(jìn)樣體 積5.00μL。梯度洗脫程序見表1。

1.5.2質(zhì)譜條件

將質(zhì)量濃度為0.100 μg/mL 的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液及氯霉素 -D₅ （作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)用于定性定量分析），采用流動注射直接進(jìn)樣方式注入質(zhì)譜儀中，進(jìn)行母離子全掃描分析。結(jié)果顯示，在ESI負(fù)模式下，氯霉素、甲礬霉素、氟苯尼考及氯霉素 -D₅ 因分子結(jié)構(gòu)中含有氯、氟離子和羥基等電負(fù)性基團(tuán)，可產(chǎn)生顯著的去質(zhì)子化分子離子峰；而氟苯尼考胺因含氨根，在ESI正模式下，易形成大量的質(zhì)子化分子離子峰。

鑒于此，試驗采用正負(fù)離子切換模式對五種酰胺醇類藥物進(jìn)行同步檢測。通過質(zhì)譜分析，確定氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺及氯霉素 -D₅ 的母離子 m/z 值分別為321.0、354.0、356.0、248.0和326.0。隨后，針對每種藥物選擇兩個響應(yīng)較強(qiáng)的子離子作為定性定量的依據(jù)，并對錐孔電壓和碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，以確保各藥物的峰形和信號強(qiáng)度達(dá)到最佳狀態(tài)。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件參見表2，氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺和氯霉素 -D₅ 的色譜圖見圖1。

2 結(jié)果與討論

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別準(zhǔn)確量取適量酰胺醇類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加到5.00g均質(zhì)后的雞蛋及鹵蛋空白樣本中，按前處理的步驟操作，配制成氯霉素質(zhì)量為0.10、0.50、2.00、5.00、10.00、20.00μg/kg，以及甲礬霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺質(zhì)量為1.00、5.00、20.00、50.00、100.00、200.00μg/kg的基質(zhì)匹配系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均大于0.99，表明本方法線性關(guān)系良好，符合分析化學(xué)基本要求，結(jié)果見表3和表4。

2.2回收率和精密度驗證

以雞蛋及鹵蛋空白樣本為基質(zhì)，進(jìn)行3個濃度水平的加標(biāo)回收試驗，每個水平設(shè)6個平行樣本，陽性添加氯霉素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.100， 0. 200， 1.00；甲礬霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為 按“1.4.2樣本前處理”方法進(jìn)行處理，處理好的樣本注入超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。雞蛋及鹵蛋樣本中氯霉素、甲礬霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relativestandarddeviation，RSD）均符合相關(guān)規(guī)范要求，表明本方法重復(fù)性良好，定性定量分析準(zhǔn)確度高，且峰形受基質(zhì)干擾的程度相對較低，結(jié)果見表5和表6。

2.3檢出限和定量限確定

取雞蛋和鹵蛋空白樣本，按樣本前處理流程進(jìn)行預(yù)處理和測定，平行樣本 n=7 。根據(jù)樣本檢測值，計算出平均值 及標(biāo)準(zhǔn)偏差 （Sb），當(dāng)被分析物的回收率在 60%～120% 時，根據(jù)公式[檢出限 ，其中K為置信因子，一般取3；定量限 （LOQ）=（K×S_b×C）/ x，其中K為置信因子，一般取10］可計算實際檢出限和定量限。結(jié)果表明，當(dāng)添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.100 時，氯霉素計算的檢出限范圍為0.013 1～0.015 5 ，定量限范圍為 當(dāng)添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.00 時，甲礬霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺計算的檢出限范圍為0.087 9～0.143 0 μg/kg ，定量限范圍為 上述結(jié)果表明，本方法能夠準(zhǔn)確識別和量化極低濃度的獸藥殘留物，體現(xiàn)了方法的技術(shù)先進(jìn)性。

3結(jié)論

本方法基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了一種可以測定禽蛋及禽蛋制品中酰胺醇類抗生素殘留量的方法，可同時對禽蛋及禽蛋制品中氯霉素、甲礬霉素和氟苯尼考等酰胺醇類抗生素殘留物進(jìn)行定性定量分析，有效解決了禽蛋及禽蛋制品因脂肪含量高、基質(zhì)干擾嚴(yán)重等帶來的分析技術(shù)難題。經(jīng)過驗證，本方法具有靈敏度高、快速準(zhǔn)確及安全經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點，能夠有效應(yīng)用于禽蛋及禽蛋制品中氯霉素和氟苯尼考的快速檢測。本方法的建立可以大大提高禽蛋及禽蛋制品中酰胺醇類抗生素殘留量的檢測效率，解決了現(xiàn)行檢測方法定性定量過程繁瑣復(fù)雜、耗時長、檢測滯后等問題，可節(jié)省人力、物力和財力。

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作者簡介：何玉榆（1998一），女，本科，主要從事農(nóng)產(chǎn)品及農(nóng)業(yè)投入品監(jiān)測工作；E-mail：412948225@qq.com

*通信作者：吳雯娟（1985一），女，碩士，高級工程師，主要從事獸藥殘留檢測與風(fēng)險評估工作；E-mail：373565192@qq.com