合肥市市售嬰幼兒食品中克羅諾桿菌的分離鑒定及耐受性、藥敏性分析

Isolation， Identification， Tolerance， and Drug Sensitivity Analysis of Cronobacter fromInfant and Toddler Food SoldinHefei

XUYafei （The School of Bioengineering，Hefei Technology College，Hefei 23o011， China）

Abstract： This study focuses on 126 commerciallyavailable infant and toddler food samples collected in Hefei， Anhui province from 2021 to 2024. Biochemical and molecular biology methods wereused to isolate and dentify Cronobacter，and tolerance and drug sensitivity analysis were conducted on the isolated Cronobacter strains.The results showed that Cronobacter was detected in 12 samples， the detection rate was 9.5% ，of which the detection rates of infant rice noodles，infant snacksand infant milk powder were 13.8% 9.2% and 4.8% respectively;the increase in temperature has a stepwise inhibitory efect on the survival of Cronobacter.When the temperature rises to 70% ， the survival rate of all isolated strains is less than 0.03% ； the sensitivity rate of 12 isolated strains to four antibiotics， namely ceftazidime， cefotaxime，cefoxitin， and gentamicin， was 100% ，while the resistance rate to two antibiotics， clindamycin and vancomycin， was 100% .Multiple drug resistance hasnot yet been observed in the isolated strains. This study aims to provide scientific basis and improvement suggestions for the safety monitoring of infant and toddler food sold in various markets in Hefei city.

Keywords： Cronobacter;separation and identification; tolerance; drug sensitivity

克羅諾桿菌（Cronobacter）是一種革蘭氏陰性菌，具有較強(qiáng)的致病性，尤其容易使新生兒、老年人及免疫缺陷患者等人群患上損害性較強(qiáng)的一系列疾病，如腦膜炎、敗血癥等，危害極大[1-3]。根據(jù)微生物分類(lèi)學(xué)研究，克羅諾桿菌屬包含7個(gè)明確的物種類(lèi)型，其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系已通過(guò)基因組學(xué)及表型特征分析得以界定，其中阪崎克羅諾桿菌（C.sakazakii）、丙二酸鹽克羅諾桿菌（C.malonaticus）在食品及其生產(chǎn)環(huán)境中最為常見(jiàn)，并易引發(fā)感染性疾病[4。作為一種致病劑量較低的食源性致病菌，克羅諾桿菌分布較為廣泛，尤其是在嬰幼兒食品中常被檢出，對(duì)嬰幼兒健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[5-]

近年來(lái)，有關(guān)克羅諾桿菌食源性感染引發(fā)的重大疾病事件時(shí)有發(fā)生，相關(guān)研究的重要性日益凸顯。克羅諾桿菌可以從各種環(huán)境、食品加工場(chǎng)所以及臨床樣本中分離獲得，甚至在家庭環(huán)境和土壤樣本中也有發(fā)現(xiàn)[7-8]。目前研究表明，克羅諾桿菌的毒力機(jī)制主要與其突破血腦屏障的能力相關(guān)[]。盡管不同克羅諾桿菌的致病性存在差異，但其對(duì)新生兒的致病機(jī)理總體一致。抗生素是目前治療克羅諾桿菌感染最常見(jiàn)的手段，但是長(zhǎng)期使用會(huì)明顯提升克羅諾桿菌對(duì)抗生素的耐受能力，因此提高對(duì)嬰幼兒食品中克羅諾桿菌的鑒定和耐藥性監(jiān)測(cè)顯得尤為重要[10-12]

本研究以安徽省合肥市2021—2024年采集的126份市售嬰幼兒食品樣品為研究對(duì)象，采用生物化學(xué)及分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行克羅諾桿菌的分離鑒定，并對(duì)分離得到的克羅諾桿菌菌株進(jìn)行耐受性和藥敏性分析，旨在為合肥市市場(chǎng)銷(xiāo)售的嬰幼兒食品安全提供科學(xué)依據(jù)，尤其是為克羅諾桿菌的監(jiān)測(cè)工作提供支持。

1材料與方法

1.1材料與試劑

126份食品樣品，采自合肥市市售嬰幼兒常見(jiàn)食品，包括嬰幼兒奶粉、嬰幼兒米粉、嬰幼兒零食3個(gè)類(lèi)別，采集地點(diǎn)包括超市、零售店、攤販等多種場(chǎng)景。

克羅諾桿菌標(biāo)準(zhǔn)株，保藏于合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院；改良月桂基硫酸鹽胰蛋白肺肉湯-萬(wàn)古霉素（ModifiedLauryl SulfateTryptoseBroth，mLST-Vm）、胰蛋白陳大豆瓊脂（TrypticSoyAgar，TSA）、緩沖蛋白脈水（BufferedPeptoneWater，BPW）、結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VioletRedBileGlucoseAgar，VRBGA）和克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基（DFI瓊脂），均購(gòu)自江蘇普樂(lè)司生物科技有限公司；藥敏試驗(yàn)所用抗生素，均購(gòu)自北京沃凱生物科技有限公司；藥敏試紙，湖南比克曼生物科技有限公司；WG1101DNA提取試劑盒，廣州翔博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HPC-1000恒溫培養(yǎng)箱，海爾生物醫(yī)療;SCILOGEX型臺(tái)式離心機(jī)，美國(guó)賽洛捷克公司；MicroflexLRF質(zhì)譜儀，德國(guó)bruker公司；LDZX-30KBS型高壓滅菌鍋，上海申安公司；VS-840K-U潔凈工作臺(tái)，蘇凈安泰公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株分離鑒定

依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗(yàn)》（GB4789.40—2016），所有采集樣品均在無(wú)菌條件下進(jìn)行預(yù)處理[13]。使用電子天平準(zhǔn)確稱取 10g 樣品，加入含有 90mL BPW的錐形瓶中。將錐形瓶置于 37°C 恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng) 18h 。隨后，使用移液槍移取 1mL 培養(yǎng)液，接種至 10mL mLST- ?v_m 肉湯，在 44^°C 環(huán)境中培養(yǎng)24h 后，取 1mL 懸液通過(guò)梯度稀釋，采用四區(qū)劃線法接種至克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基，并于 37°C 恒溫培養(yǎng) 24h 。依據(jù)顯色平板上藍(lán)綠色、邊緣光滑的典型菌落形態(tài)學(xué)特征，挑取 1～3 個(gè)單菌落轉(zhuǎn)接至TSA平板，利用分區(qū)劃線法在 25°C 下靜置培養(yǎng) ^48h ，最終獲得遺傳背景均一的純化菌株作為克羅諾桿菌分離株疑似株，進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

1.3.2 菌株16SrDNA分析

將分離得到的克羅諾桿菌菌株進(jìn)行16SrDNA測(cè)序。采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取試驗(yàn)菌株的基因組DNA，并依據(jù)文獻(xiàn)方法及條件[14對(duì)提取出的分離菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。隨后，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行16SrDNA一代測(cè)序。將所獲得的序列提交至NCBI網(wǎng)站（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）的BLAST程序界面，利用比對(duì)功能，搜索并獲取與試驗(yàn)菌株16SrDNA具有同源性的序列，從而確定克羅諾桿菌種屬鑒定結(jié)果。

1.3.3 耐受性試驗(yàn)

在乳粉日常沖調(diào)的實(shí)際應(yīng)用場(chǎng)景中，基于人們普遍采用的水溫條件，本研究聚焦于50、 60°C 和70% 這3個(gè)關(guān)鍵溫度點(diǎn)開(kāi)展研究。從分離得到的克羅諾桿菌菌株 mLST-Vm 肉湯培養(yǎng)物中分別準(zhǔn)確量取 1mL 樣品，并將其加入 10mL 沖調(diào)好的奶粉中均勻混合，隨后將上述混合液分別置于設(shè)定溫度為50、 60^°C 和 70% 的水浴裝置內(nèi)進(jìn)行保溫處理，保溫時(shí)長(zhǎng)固定為 20min ，在保溫期間持續(xù)不斷地進(jìn)行振蕩操作，以此確保菌體能夠均勻受熱。處理結(jié)束后，立即取樣測(cè)定終末濃度并進(jìn)行存活率計(jì)算，根據(jù)存活率結(jié)果判定菌株對(duì)不同溫度的耐受性。

1.3.4 藥敏性試驗(yàn)

選取12種常用抗生素，包括頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢西丁、氨芐西林、阿莫西林、克林霉素、慶大霉素、萬(wàn)古霉素、阿奇霉素、多黏菌素、四環(huán)素和氯霉素，采用Kirby-Bauer法評(píng)估克羅諾桿菌的抗生素耐藥性。試驗(yàn)以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株EscherichiacoliATCC25922作為對(duì)照。將待測(cè)菌懸液濃度校準(zhǔn)至0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝唬∕cFarland標(biāo)準(zhǔn)），依據(jù)藥敏紙片操作規(guī)范進(jìn)行擴(kuò)散試驗(yàn)。抑菌圈直徑的測(cè)定參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)發(fā)布的CLSI-M100-S19指南進(jìn)行耐藥性判定，確保試驗(yàn)結(jié)果符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化要求。

2結(jié)果與分析

2.1克羅諾桿菌檢出情況

對(duì)126份樣品進(jìn)行克羅諾桿菌的分離與鑒定。通過(guò)顯色平板篩選出呈現(xiàn)藍(lán)綠色菌落的菌株，并在TSA平板上培養(yǎng) 48h 后觀察到典型黃色素的產(chǎn)生，結(jié)合克羅諾桿菌特異性生化鑒定管的檢測(cè)結(jié)果，其生理生化特征完全符合GB4789.40—2016中關(guān)于克羅諾桿菌的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，因此可以初步判定這些分離菌株為克羅諾桿菌菌株。最終檢測(cè)結(jié)果顯示，本次共有12份樣品檢測(cè)出了克羅諾桿菌，檢出率為 9.5% 其中檢出率最高的是嬰幼兒米粉，檢出4份樣品，檢出率為 13.8% ；其次是嬰幼兒零食，檢出7份樣品，檢出率為 9.2% ，檢出數(shù)量最多；嬰幼兒奶粉檢出1份樣品，檢出率為 4.8% （見(jiàn)表1）。

利用BLAST在線比對(duì)分析12株克羅諾桿菌分離株的16SrDNA基因序列。結(jié)果顯示，12株可疑分離株均為克羅諾桿菌屬（Cronobacterspp.），其中9株分離株的16SrDNA基因序列與阪崎克羅諾桿菌（C.sakazakii）的相似性較高，序列相似性在 99% 以上；2株分離株的16SrDNA基因序列與丙二酸鹽克羅諾桿菌（C.malonaticus）的相似性最高，序列相似性在 99% 以上；1株分離株的16SrDNA基因序列與蘇黎世克羅諾桿菌（C.turicensis）的相似性在 99% 以上（見(jiàn)表2）。上述結(jié)果表明，阪崎克羅諾桿菌對(duì)嬰幼兒食品的污染率最高，這和現(xiàn)有研究結(jié)論一致。

2.2克羅諾桿菌分離菌株的耐受性結(jié)果

基于耐受性試驗(yàn)數(shù)據(jù)（表3），克羅諾桿菌的存活率呈現(xiàn)顯著溫度依賴性。在 50^qC 條件下，除MF01 和LS02菌株存活率較低外，其余菌株未出現(xiàn)明顯失活現(xiàn)象，部分菌株甚至出現(xiàn)適應(yīng)性增殖（存活率 gt;100% ）；當(dāng)溫度升至 60°C 時(shí)，全部菌株均進(jìn)入負(fù)增長(zhǎng)狀態(tài)，部分菌株接近全部死亡；而在 70% 處理組中，所有菌株存活率均 ?0.03% 。通過(guò)方差分析及多重比較驗(yàn)證，50、 60^°C 與 70% 處理組間菌濃度對(duì)數(shù)值差異達(dá)極顯著水平，表明溫度升高對(duì)克羅諾桿菌的存活具有階梯式抑制作用。

2.3克羅諾桿菌分離菌株的藥敏檢測(cè)結(jié)果

由表4可知，12株克羅諾桿菌分離菌株對(duì)頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢西丁和慶大霉素4種抗生素的敏感率均為 100% ；對(duì)多黏菌素、四環(huán)素的敏感率也較高，均為 84% ；對(duì)氨芐西林和阿莫西林的敏感率較低，分別為 25% 和 8% 。分離菌株對(duì)氨芐西林和阿莫西林的中介率較高，分別為 58% 和 67% 。對(duì)克林霉素和萬(wàn)古霉素2種抗生素的耐藥率為 100% ，即表現(xiàn)為完全耐藥性；對(duì)氨芐西林、阿莫西林、阿奇霉素、四環(huán)素均出現(xiàn)耐藥性情況，但未發(fā)現(xiàn)任何菌株對(duì)頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢西丁、慶大霉素、多黏菌素和氯霉素產(chǎn)生耐藥性，且分離菌株中尚未出現(xiàn)多重耐藥性情況。

3討論與結(jié)論

對(duì)合肥市市售嬰幼兒食品中克羅諾桿菌進(jìn)行準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)至關(guān)重要。目前，常用的兩種鑒定方法包括通過(guò)微生物培養(yǎng)觀察顯色平板以及使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)菌株DNA進(jìn)行擴(kuò)增和比對(duì)。然而，僅依賴這兩種方法可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性。本研究根據(jù)GB4789.40—2016標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)采集樣品進(jìn)行了精確的分離與鑒定操作，同時(shí)結(jié)合16SrDNA基因序列分析方法對(duì)分離菌株進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證，從而使鑒定結(jié)果更為可靠[15-16]。最終研究結(jié)果顯示，在采集的126份樣品中分離出12株目標(biāo)菌株，包括9株阪崎克羅諾桿菌（C.sakazakii），2株丙二酸鹽克羅諾桿菌（C.malonaticus）和1株蘇黎世克羅諾桿菌（C.turicensis）。其中，阪崎克羅諾桿菌在嬰幼兒食品克羅諾桿菌污染中占據(jù)主導(dǎo)地位，這與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)論一致，為后續(xù)研究的重點(diǎn)方向提供了明確指引。

克羅諾桿菌對(duì)溫度的耐受性表現(xiàn)出一定的范圍特性，且不同菌株間的耐熱性存在差異。在 50^qC 條件下，絕大多數(shù)克羅諾桿菌均可以有效存活，但當(dāng)溫度升高到 60°C 時(shí)，除極少數(shù)菌株外，其余菌株存活率大幅下降，部分菌株存活率降為 3% 以下。隨著溫度繼續(xù)升高至 70% ，幾乎所有菌株均完全失活。陳彬等[17]在乳源克羅諾桿菌的熱滅活特性研究中發(fā)現(xiàn)，該菌在熱處理中呈現(xiàn)明顯的閾值效應(yīng)：當(dāng)奶粉復(fù)溶溫度達(dá) 70^cC 時(shí)，克羅諾桿菌的存活量可被顯著抑制；而在低于此溫度閾值時(shí)，多數(shù)菌株仍能維持代謝活性。這一現(xiàn)象與菌株的耐熱蛋白表達(dá)及膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性密切相關(guān)，表明在乳制品加工中， 70%是控制克羅諾桿菌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵溫度節(jié)點(diǎn)。HUERTAS等[8]在乳制品復(fù)溶工藝的熱穩(wěn)定性研究中進(jìn)一步證實(shí)，克羅諾桿菌在 50～65°C 調(diào)制溫度下具有顯著的環(huán)境適應(yīng)性，僅當(dāng)復(fù)溶溫度在 70% 以上時(shí)，其活性才能被完全抑制至檢測(cè)限以下。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高溫處理的配方奶粉在室溫貯存期間，殘留菌株仍可復(fù)蘇并呈現(xiàn)指數(shù)級(jí)增殖，且冷卻速率顯著影響菌體的復(fù)蘇潛能及后續(xù)增殖動(dòng)力學(xué)。因此，建議采用梯度降溫策略替代快速冷卻，以阻斷克羅諾桿菌的二次污染風(fēng)險(xiǎn)。

本研究未發(fā)現(xiàn)多重耐藥菌株，但藥敏性試驗(yàn)結(jié)果表明部分分離株對(duì)克林霉素、萬(wàn)古霉素、氨芐西林、阿莫西林、阿奇霉素和四環(huán)素均出現(xiàn)耐藥性情況，其中對(duì)克林霉素和萬(wàn)古霉素2種抗生素的耐藥率為100% 。早期食品源克羅諾桿菌因未暴露于臨床抗生素的選擇性壓力，其基因組攜帶的耐藥基因簇較少，故對(duì)常規(guī) β- 內(nèi)酰胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)等廣譜抗生素表現(xiàn)出高度敏感性。基于此特性，在治療克羅諾桿菌相關(guān)感染時(shí)，結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果選用廣譜抗生素療法已成為常規(guī)干預(yù)手段，這與該菌在非醫(yī)療環(huán)境中未被誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著耐藥表型的特性密切相關(guān)[19]。但是隨著抗生素使用的愈發(fā)頻繁，克羅諾桿菌對(duì)于抗生素的耐藥性越來(lái)越強(qiáng)。CUI等[2%在其研究中報(bào)道了兩例新生兒克羅諾桿菌感染病例中分離的菌株呈現(xiàn)顯著多重耐藥特征，其中腦脊液來(lái)源的丙二酸鹽陽(yáng)性克羅諾桿菌對(duì)包括 β_- 丙酰胺類(lèi)（氨芐西林）、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)（阿奇霉素）、三代頭孢菌素（頭孢曲松）、氯霉素、四環(huán)素類(lèi)（脫氧土霉素）、氨基糖苷類(lèi)（慶大霉素）及磺胺類(lèi)復(fù)方制劑（磺胺甲噁唑/甲氧芐啶）在內(nèi)的9類(lèi)抗生素耐藥；而血液來(lái)源的阪崎克羅諾桿菌則對(duì) β- 丙酰胺類(lèi)（氨芐西林、頭孢西丁、頭孢曲松和頭孢吡肟）、氯霉素及磺胺類(lèi)等6種藥物產(chǎn)生交叉耐藥，揭示了不同來(lái)源菌株的耐藥譜存在顯著異質(zhì)性。耐藥性問(wèn)題是一個(gè)復(fù)雜綜合的問(wèn)題，目前已經(jīng)逐漸成為公共衛(wèi)生醫(yī)療領(lǐng)域備受關(guān)注的研究方向，但是耐藥性的形成機(jī)制受多種因素影響，深入解析其機(jī)制仍需進(jìn)一步加強(qiáng)研究。

綜上所述，本研究對(duì)合肥市市售嬰幼兒食品進(jìn)行采樣調(diào)查，發(fā)現(xiàn)部分樣品中存在一定程度的克羅諾桿菌污染。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分離獲得的菌株存在一定耐受性和耐藥性。這一現(xiàn)象提示，嬰幼兒食品安全監(jiān)測(cè)與防控工作急需進(jìn)一步加強(qiáng)，需要社會(huì)各界予以高度關(guān)注，以保證嬰幼兒群體的健康成長(zhǎng)。

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