香稻種質資源的分子鑒定和應用

關鍵詞香稻；香味基因；等位變異；單倍型中圖分類號S511文獻標識碼A文章編號 0517-6611（2025）13-0075-05doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.13.015開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Molecular Identification and Utilization of Aromatic Rice Germplasm Resources

[OU Gui-lin，WANG Zhi-yan，LIN Hui-hui et al （HefeiFengle Seed Co.，Ltd.，Hefei，Anhui）

AbstractOectie]Indertofectivelygudetesientifcandatioalselectioofromaticicebeedingparentsinolelarding ofhighqualityoaticcpovebdgfcydprovdeevidecefosunghaiospenlotofd andthecntentofaromacomponents.Method」6aromaticicegeplasmresouesatomeandabroadwerecolcted.4functioalarkers corespondingthemainunctioaaplotypsofbdh2wereusedtoidentifyevarationtyesoftesearomaticicematealsandautromavarietydg.sullottdinicddeitialtl counting for 80.36% . Using these 4 functional markers，a sum of 91.07% of the aromatic rice germplasm resources could be accurately identified，andthereagatealsylongtootreportedeallcraontysofd，ootainwoagsGeplasm resourceswihdE7rbd-Eaplotandcorrspoingfunctioalakersouldeeielyappedtoefragranrieti bredingandsedpuritydetecting.Conlusion]Theresultsprovidedasientificbasisforthegeneticdiversityanalysisofromaticege plasm resources and the breeding of high-quality aromatic rice varieties.

Key wordsAromatic rice;Flavor gene;Allelic variation;Haplotype

隨著經濟日益發展和生活水平不斷提高，人們對稻米的需求已從“吃飽”向“吃好”和\"吃得安全健康\"轉變[1-2]。香味是高品質稻米的重要特性，具有優良香味的稻米不僅食用價值高，還具有更高的經濟價值[3-7]。因此，培育和生產推廣香型水稻品種不僅是產業發展和市場需求的方向，也是落實我國農業結構性調整目標，實現水稻綠色、提質、增效，改善居民食用稻米品質的重要途徑。香型水稻種質資源和育種材料的準確鑒定是培育和生產推廣香型水稻品種的必要技術支撐。

隨著水稻香味性狀功能基因組學研究和DNA分子標記技術的快速發展，已發現絕大多數香稻品種的香味性狀主要受位于第8染色體上的隱性基因badh2控制，由于其功能喪失，促進了香味物質2-乙酰基-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2-AP）的積累，從而使稻米產生香味[8-9]。有研究表明，badh2在香稻種質資源中存在多種單倍型[10-11]，但以badh2-E7[第7外顯子 8bp 缺失，同時有3個單核苷酸多態性（SNPs）]最為常見，約占 80% 以上，并廣泛分布在世界各主要稻米生產國[10-12]，其他單倍型對應的香稻品種數量較少，且具有較強的地域分布特性[10]，包括badh2-E2（第2外顯子7bp的缺失，約占香稻資源 6% 左右）和 badh2-E4-5 （第4和第5外顯子之間存在 803bp 的缺失，約占香稻資源 2% 不到）[1]，以及badh2-E12（第12外顯子 3bp 缺失）[13]、badh2-E13（第13外顯子 3bp 插入）[14]、badh2-UTR（5'UTR區 3bp 缺失）[15] 、badh2-Pro （啟動子插入 8bp ）[16]等，其中badh2-E7單倍型往往同時存在 badh2-Pro （啟動子插入 8bp ）變異[16]。隨著這些變異類型功能標記的開發，香稻材料的篩選和香味基因badh2變異類型的鑒定等研究工作迅速開展，加快了香稻新品種選育[10-16] O

筆者收集了國內外56份香稻種質資源，根據香味基因badh2的主要功能單倍型，利用已報道的4個功能標記，開展香味基因badh2的變異類型檢測，鑒定香稻材料不同類型，并利用具有badh2-E7和badh2-E2單倍型的種質資源和相應功能標記開展香味水稻品種選育和種子純度檢測工作，為研究badh2單倍型與香味成分含量之間的關系，以及在優質香稻分子育種中科學合理選擇香稻育種親本以提高育種效率，改進種子純度檢測方法提供參考。

1材料與方法

1.1供試材料香味基因分子鑒定材料為合肥豐樂種業股份有限公司收集的國內外香稻種質資源和香稻育種親本，共56份，包括國內外地方品種10份（7份來源于中國水稻所國家作物種質資源水稻中期庫）、國內市場推廣品種41份，以及合肥豐樂種業股份有限公司香稻育種親本5份（恢復系1份，不育系4份），并以稻非香品種華占、9311，以及粳稻非香品種日本晴為對照（CK）（表1）。

香味育種群體供試材料是以南粳9108為供體，公司推廣品種潤稻118為受體構建的回交群體 BC₃F₂ 。種子純度檢測供試樣品為香味恢復系R2106的種子批。

1.2種質資源香味基因變異類型檢測取種子發芽7d后的幼苗，采用常規CTAB法[提取每份種質資源的DNA，濃度調整到 20～30ng/μL ，備用。PCR擴增采用 10μL 反應體系： 10×PCR Buffer（含 25mmol/L MgCl₂ ） 1.0μL ， dNTPs（ 2.5mmol/L ） 0.8μL ，左右引物（ 10μmol/L 各 0.5μL ，TaqDNA聚合酶（ 5U/μL ） 0.1μL ，基因組DNA 2.0μL ddH₂0 4.2μL 其中，引物利用badh2基因已報道的4個主要等位變異（badh2-E7、badh2-E2、badh2-E4-5和 badh2–Pro ）對應的4個功能標記[16，18-20]。所用引物均由通用生物工程有限公司合成（表2）。PCR反應程序為 95^°C 預變性 4min;95^°C 變性 30s，55°C 退火 30s，72°C 延伸 ^45s，32 個循環后， 72^°C 條件下延伸 保存。

PCR擴增產物采用 6% 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，經 0.2% 硝酸銀染色后，于膠片觀察燈上記錄條帶信息。并用 3730XL 基因測序儀毛細管電泳驗證片段大小（PCR擴增時，使用熒光引物）。

1.3育種群體香味基因型檢測采用快速法2提取單株DNA，PCR擴增和產物凝膠電泳檢測方法同\"1.2”。

1.4純度樣品基因型檢測種子發芽5＼～7d后，采用快速法[21]提取192個幼苗DNA，PCR擴增和產物凝膠電泳檢測方法同\"1.2”。

2 結果與分析

2.1種質資源香味基因變異類型檢測結果以56份香稻材料和3份非香材料（對照）的基因組DNA為模板，利用香味基因badh2已報道的4個主要等位變異（badh2-E7、badh2-E2badh2-E4-5和badh2-Pro）對應的4個功能標記檢測其單倍型。

結果表明（表3，圖1），在badh2-E7功能標記位點，3個非香品種（華占、R9311、日本晴）擴增出 206bp 的條帶，而KDML105、Basmati370、紫香糯等22份材料擴增出 198bp 的條帶，說明這22份材料為badh2第7外顯子 8bp 缺失純合變異類型；稻花香、美香占2號和農香39擴增出198和206bp2 種條帶，說明這3份材料為badh2第7外顯子8bp缺失雜合變異類型。總體而言，共有25份材料具有第7外顯子 8bp 缺失變異，占總數的 44.64% 。在badh2-E2功能標記位點，3個非香品種（華占、R9311、日本晴）擴增出 104bp 的條帶，而京粳1號、南粳9108、金香玉一號等20份材料擴增出 97bp 的條帶，說明這20份材料為badh2第2外顯子7bp 缺失純合變異類型，占總數的 35.71% 。在badh2-E4-5功能標記位點，僅香大糯這1份材料擴增出大小為 317bp 的條帶，說明香大糯為badh2第4和第5外顯子之間存在803bp 的缺失變異類型，占總數的 1.79% 。在 badh2-Pro 功能標記位點，粘稻非香品種華占和R9311擴增出 的條帶（粘型），粳稻非香品種日本晴擴增出 196bp 的條帶（粳型），另外檢測到2種香型功能變異類型： badh2–Pro（8） （啟動子插入 8bp ）和 badh2-Pro（5） （啟動子插入 5bp ）。其中，南粳5055、南粳9308、香糯、香大糯以及KDML105、Basma-ti370、紫香糯等29份材料擴增出大小為 204bp 的條帶，說明這29份材料為粳型 badh2-Pro（8） （啟動子插入 8bp ）純合變異類型。稻花香、美香占2號和農香39擴增出204 和 454bp 2種條帶，說明這3份材料為 badh2–Pro（8） （啟動子插入8bp ）雜合變異類型。總體而言，共有32份材料具有badh2-Pro（8） （啟動子插入 8bp ）等位變異，占總數的 57.14% ;而增城絲苗和一枝香2個品種擴增出大小為201bp的條帶，說明這2份材料為粳型 badh2-Pro（5） （啟動子插入 5bp ）純合變異類型，占總數的 3.57% 。然而，華夏絲苗、農香42、Della、曼谷香稻和福香1號5個香稻種質資源未在這4個功能標記位點檢測到香型功能變異，且其單倍型與非香稻對照華占和R9311一致，占總數的 8.93% 。

因此，利用以上4個功能標記能夠準確鑒定出 91.07% 的香稻種質資源。其中，badh2-E7和badh2-E22種單倍型是主要的功能變異，共占供試材料的 80.36% 。值得一提的是，25份badh2-E7單倍型和1份 badh2-E4-5 單倍型材料同時也存在 badh2–Pro（8） （啟動子插入 8bp ）等位變異，而只存在 badh2-Pro（8） 和 badh2-Pro（5） 等位變異的單倍型分別有3和2份，因此， badh2-Pro 功能標記能鑒定出30份香稻資源，占總數的 53.57% 。

2.2育種群體香味基因型檢測結果香味供體材料南粳9108為badh2-E2單倍型，利用相應功能標記檢測南粳9108和潤稻118構建的BC3F2回交群體材料的badh2基因型。結果表明，該標記能夠準確區分badh2-E2純合變異、雜合變異，以及無變異的單株（圖2），因而可有效應用于香味水稻品種分子輔助育種，提高育種的準確性和效率。

2.3純度檢測樣品香味基因型檢測結果香味恢復系R2106為badh2-E7單倍型，利用相應功能標記檢測R2106種子批的純度。結果表明，96個單株中有1株badh2-E2無突變，說明該單株混雜（圖3）。由此推測badh2功能標記可用于不同類型香稻品種的純度檢測。

圖2BC3F2回交群體材料在badh2-E2功能標記位點上的電泳圖譜

Fig.2The electrophoretic map of BC3F2 backcross population materials at badh2-E2 functional marker

3結論與討論

種質資源是育種的基礎，隨著優質香米消費需求的持續增長和經濟價值的提高，香味成為水稻品質改良的重要性狀之一，因此有必要對香味種質資源進行遺傳解析，并提供簡單準確的鑒定方法，為優質香型水稻品種的快速選育提供物質前提和技術保障。近年來，隨著基因測序技術迅猛發展和功能基因組學不斷突破，大量水稻品種包括香稻種質資源，完成了測序和功能基因分析，發現了一系列香味基因的變異位點及其單倍型，并針對不同變異位點開發出了可應用于香味種質資源篩選和品種培育的功能標記。該研究收集了國內外56份香稻種質資源，利用已報道的香味基因badh2的主要功能單倍型和對應的4個功能標記，能夠準確鑒定出91.07% 的香稻種質資源，說明這4個功能標記可用于更廣泛的香稻種質資源鑒定和品種選育。56份香稻種質資源中，badh2-E7和 badh2-E2 2 種單倍型是主要的功能變異，共占供試材料的 80.36% ，且 badh2-E7 單倍型主要存在于燦稻品種中，而 badh2-E2 單倍型主要存在于粳稻稻品種中。有趣的是 badh2-Pro 功能標記檢測到2種變異類型： badh2-Pro （8）和 badh2-Pro（5） ，且badh2-E7單倍型和 badh2-E4-5單倍型材料同時也存在 badh2–Pro（8） 等位變異，但仍檢測到少量只存在 badh2–Pro（ 8） 和 badh2-Pro（5） 等位變異的單倍型。這些結果可能說明badh2香味基因的等位變異存在粘粳分化，并持續向不同方向發生了進化，這有待于收集更多種質資源進行進一步遺傳解析。有5份材料在4個功能標記位點均未檢測到等位變異，且其單倍型與非香釉稻對照華占和R9311一致，其中Della等位基因型與前人報道不同[0]，可能種質資源收集有誤，其他材料可能屬于badh2其他已報道的或新的等位變異類型，抑或是含有新的香味基因，這有待進一步鑒定。另有3份材料存在等位基因型雜合現象，可能也是由于收集的種質資源不夠純合所致。總之，該研究鑒定出的香稻材料不同類型可有效指導優質香稻分子育種中科學合理選擇香稻育種親本，進而提高育種效率。但準確收集更多種質資源，結合功能標記分析和測序進行遺傳解析，并研究badh2單倍型與香味成分含量之間的關系將會進一步有效促進優質香稻新品種選育，從而提高我國稻米食用和經濟價值。

在香稻品種選育過程中，需要在育種群體中準確鑒定出含有香味基因（純合和雜合）的單株，由于香味基因badh2為隱性基因，只有基因型純合單株才表現出香味，傳統基于表型鑒定的感官評價法包括咀嚼法和嗅聞法等，只能鑒定出badh2基因型純合單株，且存在主觀影響大，重復性差，準確性偏低，效率不高等問題，而基于現代質譜技術的化學分析方法，仍然可以更準確鑒定出香味物質2-AP含量，但卻需要大量樣本、昂貴的設備和專業技術人員[22]，且需嚴格控制環境條件對香味物質的影響等，故以上2種方法均不適用于香稻品種選育過程。相反，基于功能基因的分子標記檢測法能夠檢測基因的顯隱性，準確性高、成本低，且適用于批量快速檢測，是目前香稻品種選育過程中最為準確有效的檢測方法。此外，隨著DNA技術的快速發展，分子標記檢測技術在種子純度檢測中的應用也越來越廣[23]，但實踐中發現，由于遺傳背景和不同混雜類型的影響，同一批次種子選擇不同的分子標記，其純度結果并非總是完全一致，因此找到品種特異性特征，應用相對應的分子標記檢測純度，可能更加準確。因此，該研究分別利用具有badh2-E7和badh2-E2單倍型的種質資源和相應功能標記，開展了香味品種選育和種子純度檢測的應用實踐工作。

結果證實，該研究鑒定的香稻種質資源和相應功能標記可以有效應用于香味水稻品種分子輔助育種和純度檢測，有助于提高育種和種子質量檢測的準確性和效率。

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