延安煙區連作土壤的真菌群落研究

中圖分類號S154文獻標識碼A

文章編號 0517-6611（2025）12-0113-08

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.12.026

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on the Diference of Fungi Community in Continuous Cropping Soil in Yan'an Tobacco Production Area LI Gui-tong'，YUNLong，GONGPeng-feietal（1.QingdaoAgriculturalUniversity，Qingdao，Shandong266109;2.an’anTobacc （Group）Co.，Ltd.，Yan'an，Shaanxi 716000）

AbstractTostudythephsicochmicalpropetisandfungalommunityctureofontinuoustobacoplantingsol，diferentotious croppingareasinYan’aereselectedtoetecttheysicohemicalpropertisofsoilsamplesi3growthstagsiudingefortrasplan tingrooting，ndousngofuecudtobacondigthroughutsequencngtechologwassedtonalyethediferecsffungal communityintobaccoplantigsoilTeultsshowdthatintgowthsags，thevalablerognganicaterlablepo phorus，and available potassum incontinuous cropping soil were higher than those in non-continuous croppng soil; α diversity analysis showed that continuous cropping reduced the species richness of fungi; β diversity analysis revealed significant differences in fungal communitiesamongdiferntoousopgas；inhmuitompositoootasidotandrtilootae dominantphum；nvirontalfactooelatoaalseveaedsigifntposiicoelaionweenasidoadcoous croping years；TusonawastefirstdmnantgusinBasidiomota，andhadasignifcantpositivecoelationwithcontiuousoing years，asdoesFusruinAscoota.Teichentofsoilnutrients，hangsinthstructureoftobaccozosperefungalois， andanincreaseinterelativeabundanceofharfulfungiabesoeofthimportanteasosfrteoccencofcotiuousoingo stacles in tobacco.

KeywordsFueuredbaccoCotiuosoing;Silpyichicalproprtis;ungalomuitystructure;asidioeesTus nia;Fusarium

連作是指在同一片土壤中年復一年種植相同或類似作物的耕種方式[1]。受耕地面積限制，我國烤煙普遍采用連作方式種植[2]。長期連作通常會導致土傳植物病原體累積，土壤養分失衡，微生物群落組成變化以及根系分泌物自毒，最終影響作物產質量[3-4]。研究表明，甘薯連作可導致減產20%～30% ，嚴重時甚至導致植株死亡[5]；馬鈴薯連作會導致土壤肥力下降，并加劇根系分泌物的毒性效應；辣椒連作會使病原微生物增殖；番茄連作會降低土壤酶活性、微生物生物量和微生物代謝活性，導致微生物群落組成和結構發生變化[8]；煙草連作會影響煙草的品質和抗病能力[9]。真菌在土壤養分循環，作物的健康與生長和有機物質分解方面有重要作用[10]。目前關于連作對西北煙區土壤理化性質和真菌群落結構的影響鮮見報道。因此，該研究選取延安煙區為研究地點，在煙株生長的3個時期（移栽前期、生根期和旺長期），收集7種不同連作年限種植區域的根際土壤樣本，分析連作對土壤理化性質及真菌群落的豐度、多樣性和結構組成的影響，并進一步解析煙草根際土壤真菌群落結構與土壤理化性質的相關性，以期為煙草連作障礙的治理，開發有價值的煙草根際微生物資源，提升植煙土壤質量，合理預防病害等提供理論支持和應用依據。

1材料與方法

1.1試驗地情況根際土壤樣品采集于陜西省延安市主要煙區（ 109^°32^′E，36^°07^′N） 。該地海拔 1080m ，年平均降雨量約 500mm ，年平均溫度 8.1^qC ，無霜期約 130d 。土壤類型基本為黃壤土，呈灰黃棕色或濁黃棕色，結構為疏松多孔的塊狀或團粒狀。烤煙品種均為中煙100。7個煙田地塊的農藝管理和施肥制度相似，年施用量分別為雞糞 15 000kg/hm² ，煙草專用肥（ N-P-K20-15-10）750kg/hm²， 磷酸二胺150kg/hm² 、磷肥 375kg/hm² 和硫酸鉀 150kg/hm² 。

1.2土樣采集于2021年在7個不同連作年限的煙田收集樣本，包括連續種植煙草3年（CC3）、5年（CC5）、8年（CC8）10年（CC10）15年（CC15）和30年（CC30），以及首次種植煙草的煙田（CK）。分別在移栽前（P）按照“S”型5點取樣法從每個地塊土壤中仔細挖掘煙草根系，輕輕搖晃去除可見顆粒，再將每株煙草的新鮮根部收集到塑料袋中，將附著在根部的土壤輕輕地抖到袋中，然后將每個取樣點根部王壤以相等的比例充分混合并儲存。于生根期（R）和旺長期（F）采集根際土樣，充分混勻后為1個樣本，每個農田每個時期收集3個樣本，一共收集63個樣本。將收集到的樣本分為2份，一份樣品風干后用于土壤理化性質測定，另一份樣品在液氮速凍后保存于 -80% 冰箱，由上海美吉生物醫藥科技有限公司進行微生物多樣性高通量測序。

1.3土壤理化性質測定土壤理化性質的測定參考鮑士旦的測定方法[]。 ΔpH 使用美國 SPECTRUM公司 IQ150pH 儀測量；有效磷使用 0.5mol/L 碳酸氫鈉提取，并用鉬藍比色法測定；速效鉀通過乙酸銨提取并通過火焰光度法測定；有機質采用重鉻酸鉀氧化-硫酸亞鐵銨滴定法測定；堿解氮使用自動凱氏定氮儀（FOSS）測定。

1.4土壤真菌群落多樣性測定使用Fast DNA^°ledast 土壤旋轉試劑盒（MPBiomedicals，SantaAna，CA）從 0.5g 新鮮樣品中提取基因組DNA，利用 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。使用真菌ITS基因特異性引物ITS1和ITS4R進行PCR 擴增。通過 Illumina MiSeq PE300 平臺進行測序。

1.5數據處理使用UNITE 8.0ITS 數據庫為真菌參考數據庫，以 97% 的相似度進行聚類，并對可操作分類單元（OTUs）代表性序列進行注釋[12]。使用Mothur1.30.2進行 ∝ 多樣性分析，使用Rversion3.3.1vegan包進行物種組成分析，使用R3.3.1進行 β 多樣性分析，使用R3.3.1的stats包和Python的scipy包進行組間差異顯著性分析，使用Rversion3.3.1pheatmap包進行環境因子關聯分析，使用Office2019和SPSS軟件對研究數據進行統計分析。高通量測序原始數據已上傳至NCBI SequenceReadArchive（SRA）數據庫，ID號為PRJNA982702，網 址 為 https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/bio-project/PRJNA982702。

2結果

2.1不同發育時期不同連作年限間植煙土壤理化性質的比

較煙草根際土壤的理化性質在同一生長期的不同連作年限處理間存在顯著差異（表1），將煙草連作年限劃分為4個階段，包括短期連作（1＼～3年），中期連作（4＼～5年），長期連作（6＼～10年）和超高年限連作（ gt;10 年）。其中同一生長時期的樣本間連作年限與 ΔpH 變化沒有明顯關系；堿解氮含量在長期和超高年限連作樣本中的含量顯著高于中期和短期連作樣本；速效磷含量在移栽前超高年限連作樣本中顯著高于短期連作年限樣本，生根期和旺長期中除連作8年和連作15年樣本的含量相對較高，其他樣本中短期連作顯著高于長期連作樣本；速效鉀含量中長期連作樣本含量較高，CK樣本顯著低于連作樣本，超高年限連作樣本含量處于中游水平；有機質含量在移栽前連作8年樣本中含量最高，長期及超高年限連作年限樣本含量顯著高于中短期連作年限樣本，生根期中連作5年樣本中含量最高，長期及超高年限連作年限樣本含量顯著高于短期連作年限樣本，旺長期中連作30年樣本中含量最高。綜合以上結果，連作在3個生長時期均會一定程度上導致植煙根際土壤營養成分富集。

2.2不同發育時期不同連作年限間植煙土壤真菌

多樣性的比較分析不同連作年限處理的根際土壤樣本間存在顯著差異（表2），其中ITS擴增子測序每個樣本的Coverage值均在 99% 以上，說明測序結果符合所取土壤樣本中微生物的實際情況。不同連作年限樣本的物種豐度之間存在顯著性差異，Sobs指數在移栽前和生根期均為CC8最高，CC5最低，旺長期短期連作顯著高于長期連作樣本；Ace指數在移栽前和生根期短期連作樣本低于CC8和CC15樣本，在旺長期短期連作樣本顯著高于長期連作樣本;Chao指數與Ace指數趨勢相似，在移栽前和生根期短期連作樣本較CC8和CC15樣本更低，在旺長期短期連作樣本顯著高于長期連作樣本；Shannon和Simpson指數的差異不顯著。綜合以上結果，連作在旺長期會導致植煙土壤真菌群落的豐度和多樣性顯著降低。

2.3不同發育時期不同連作年限下煙草根際土壤真菌群落

結構煙草生長不同時期和不同連作年限的根際土壤樣本中共計檢測出 15門真菌。其中Ascomyeota，Basidiomycota 和Mortierellomycota為優勢門，且不同樣本間門水平下真菌的構成比例差異明顯（圖1A）。其中移栽前CK樣本中Ascomyco-ta為最優勢菌門，占 49.59% ，Basidiomyceota僅占 4.23% ，連作樣本中的Ascomycota占比較CK減少 （36.08%～36.49% ），Basidiomyceota的占比較CK增加 26.35%～41.97% ；生根期CK樣本中 Ascomycota和Basidiomyceota 占比為 71.09% 和10.80% ，高連作年限（10＼～30年）樣本中Ascomycota占比僅為33.06%～50.61% ，Basidiomycota占比為 25.20%～49.55% ；旺長期CK中 Ascomyeota 和Basidiomycota占比為 52.13% 和14.10% ，連作樣本中Ascomycota占比為 47.39%～71.22% ，Ba-sidiomycota占比為 6.07%～42.41% ，可以看出Basidiomycota豐度在3個生長時期連作樣本中均高于 CK 。移栽前除CC30 52.40% ）外，Mortierellomycota在連作樣本中占比（ 20.72%～ 36.08% ）均低于 CK（41.56%） ，但生根期呈相反趨勢，在高連作年限（10＼～30年）中的占比（ 21.33%～24.87%） 高于CK（ 14.53%） ，旺長期趨勢與移栽前相似，在連作樣本中占比（9.46%～20.93% ）低于CK（ 21.23% ），但整體差別不大。Ol-pidiomycota在旺長期占比增加，在CK和CC8中占 10.96% 和5.89% 。屬水平下不同樣本間有明顯差異（圖1B），在所有樣本中相對豐度排名前10的真菌屬為Mortierella、Tausonia、Solicoccozyma、ChaetomiumPlectosphaerellaMicroascaceaeGib-berella、Pseudombrophila、Cephaliophora和Schizothecium，占比分別為 22.52%15.27%.4.40%3.85%2.80%2.60%1.87% 、1.73% ） 1.72% 和 1.63% 。其中Tausonia在3個時期的CK中相對豐度均較高連作樣本（10＼～30年）更低（ 0.02%～5.31% ）。

2.4不同發育時期不同連作年限煙草根際土壤真菌 β_β 多樣性的分析主坐標分析（PCoA）結果表明（圖2），在3個生長時期，對照組均與高連作年限的真菌群落有很好的區分度。其中在移栽前，PCoA的橫坐標和縱坐標對土壤真菌群落結構門水平下差異影響貢獻率分別為 65.15% 和 20.76% ，且差異非常顯著（ R=0.4618，P=0.001） ;PCoA的橫坐標和縱坐標對屬水平下差異影響貢獻率分別為 36.68% 和 13.8% ，且差異非常顯著 R=0.7755，P=0.001） 。在生根期，PCoA的橫坐標和縱坐標對土壤真菌群落結構門水平下差異影響貢獻率分別為 70.12% 和 15.64% ，且差異非常顯著（ R=0.513 7 P=0.001 ）；屬水平下橫坐標和縱坐標對屬水平下差異影響貢獻率分別為 26.37% 和 15.44% ，且差異非常顯著（ R=0.757 6 P=0.001 ）。在旺長期，土壤真菌群落結構門水平和屬水平下的差異均非常顯著（門水平下 R=0.4553，P=0.002 ；屬水平下 R=0.8151，P=0.001） ，其中PCoA的橫坐標和縱坐標對門水平下差異影響貢獻率分別為 57.07% 和 20.41% ；橫坐標和縱坐標對屬水平下差異影響貢獻率分別為 29.9% 和 13.69% 。以上結果表明CK樣本與不同連作年限樣本間具有顯著差異，連作對群落結構具有顯著影響。

2.5不同發育時期不同連作年限煙草根際土壤真菌組間差異顯著性檢驗分析組間差異顯著性檢驗分析結果表明（圖3），移栽前期Mortierellomycota、Basidiomycota 和 Olpidiomyco-ta的豐度具有顯著性差異，其中Mortierellomycota和Olpidio-mycota豐度隨連作年限增加而下降，Basidiomycota隨連作年限增加而升高;生根期Ascomycota、Basidiomycota和Mortierel-lomycota的豐度具有顯著性差異，Ascomycota豐度隨連作年限增加而下降，Basidiomycota豐度與移栽前相同，隨連作年限增加而升高，Mortierellomycota豐度與移栽前相反，隨連作年限增加而升高;旺長期Basidiomycota、Mortierellomycota和Olpidiomycota的豐度具有顯著性差異，Basidiomycota豐度與前2個生長時期趨勢相同，隨連作年限增加而升高，Mor-tierellomycota豐度與生根期相反，與移栽前相同，隨連作年限增加而降低，Olpidiomycota豐度與移栽前相似，隨連作年限增加而降低。

由于Basidiomycota在不同生長時期不同連作年限間都具有顯著性差異且豐度隨連作年限增加而增加，將Basidio-mycota優勢菌屬進行組間差異顯著性檢驗，結果表明（圖4），Tausonia屬在3個生長時期均為Basidiomycota中的第一優勢屬，其豐度均隨連作年限增加而升高，且差異顯著。

2.6煙草根際土壤真菌群落與環境因子關聯分析由圖5可知，在門水平下，前10個優勢門中只有Basidiomycota與連作年限呈極顯著正相關（ R=0.55211，P=0.00000） ，有5個門與連作年限呈顯著負相關，分別為Ascomycota（ R= -0.257 07，P=0.041 96 ）、Olpidiomycota（ R=-0.51765，P= 0.00001）、Rozellomycota（ R=- 0. 387 55， P=0.001 70）、Chytridiomycota（ R=-0.26495，P=0.03586） 和unclassified_k_Fungi（ R=-0.33325，P=0.00761） 。同時Basidiomycota與速效磷呈顯著負相關，Ascomycota、Olpidiomycota、Rozellomycota和Chytridiomycota則與速效磷呈顯著正相關，Ascomycota與堿解氮和有機質呈極顯著正相關，Olpidiomycota與 pH 呈顯著正相關，Chytridiomycota與速效鉀呈顯著正相關，與 pH 呈顯著負相關，Rozellomycota與pH呈極顯著負相關。在不于連作年限呈顯著相關性的菌門中，Mortierellomycota與速效磷、堿解氮和有機質均呈現極顯著負相關，Glomeromycota與pH呈極顯著正相關，與堿解氮和有機質呈顯著正相關，Zoopagomycota與速效鉀呈極顯著正相關，與速效磷呈顯著正相關，Aphelidiomycota與速效鉀呈顯著正相關。

在屬水平下，前20個優勢屬中有4個屬與連作年限呈顯著正相關，分別為Tausonia（ R=0.572 63 P=0.000 00 ）Solicoc-cozyma （ R= 0. 523 96， P=0. 00001）、Pseudombrophila0 R=0.30540，P=0.01494， ）和Fusarium（ R=0. 29832， P= 0.01756），有5個屬與連作年限呈顯著負相關，分別為Olpidi-um（R=-0.523 08，P=0.000 01） Cephaliophora（ R=-0.56462 P=0.000 00 ）、Cercophora（ R=-0.389 46， P=0.001 61）、unclassi-fied_o_Sordariales（ R=-0.35946，P=0.00381， 和unclassified_k_Fungi （ R=-0.33325，P=0.00761） 。

同時Tausonia與速效磷顯著負相關，Solicoccozyma與速效磷和堿解氮顯著負相關，Fusarium與有機質顯著正相關，Olpidi-um與pH和速效磷顯著正相關。在不與連作年限呈顯著相關性的菌屬中，Mortierella與堿解氮、速效磷和有機質均呈極顯著負相關，Schizothecium與有機質呈極顯著正相關，與速效磷和速效鉀呈顯著正相關，Plectosphaerella與堿解氮和有機質呈極顯著正相關，與 ΔpH 和速效磷還曾顯著正相關，Alter-naria與速效磷和堿解氮呈顯著正相關，Gibberella與有機質呈顯著正相關。

3討論

煙草不耐連作，連作障礙的產生與土壤肥力的變化和根際微生物種類和數量的變化密不可分。通常情況下，連作會導致根際土中微生物生態失調[13]。土壤理化性質是反應土壤肥力的重要指標之一，對作物產量和品質有重要影響[14]在該研究中，3個生長時期連作土壤的堿解氮、速效鉀、速效磷和有機質等指標含量要普遍高于對照土壤樣品，這與之前的研究一致[15-16]，主要原因可能是連作導致與土壤物質循環有關的微生物數量增加[17]，也可能是連作年限的增加和長期的施肥使部分養分在土壤中呈現一定程度的積累[18]。然而，在以往的研究中，僅通過糾正土壤中不平衡的理化因素并不能預防連作帶來的土壤病害[9]。

根際是圍繞植物根系并受其影響的狹窄土壤區域，是大量微生物的定植區域[20]。植物根系分泌的代謝物能夠為微生物的生長和繁殖提供有利條件[21]，根際微生物對植物營養吸收、生長和發育具有重要影響[22]。該研究中的根際真菌 ∝ 多樣性中，Ace、Chao、Sobs指數在3個生長時期均隨連作年限增加而降低，這與之前的研究結果一致[23.24]，同時主坐標分析發現在不同生長時期，未連作土壤樣本與不同連作年限樣本間均具有顯著差異，與先前的研究一致[25]。這些結果表明，長期連作下種植單一作物和長期固定的施肥方式對真菌群落進行了一定的篩選作用。植物根系通過代謝物分泌、養分及水分吸收等生理過程與土壤真菌群落相互作用，在生長的過程中選擇性地招募微生物。長期連作會導致相同類型的根系分泌物被反復釋放到土壤中，這將刺激某些微生物物種在根際定殖，影響根際微生物群落結構[2]，導致真菌物種數目、物種豐富度和群落結構均勻度下降，進一步降低根際真菌群落對連作脅迫的修復能力。

研究報道，土壤微生物群落能夠顯著影響土壤的生產力和可持續性，進而影響作物的生長狀態、產量和質量等[27]。另外，由于能夠對其所在環境的變化進行快速響應，微生物群落結構的特征已被證明能夠作為反映土壤條件的有效生物指標[28]，和反映土壤微生物群落對于環境變化響應的直觀表現[29]。該研究中 Ascomycota，Basidiomycota 和 Mortierel-lomycota在3個生長時期均為優勢門，相對豐度在不同連作年限間存在明顯差異，與之前的研究一致[30]。Ascomycota 是腐生土壤真菌，在自然界中作為分解者發揮主要生態作用，并受植物種類和種植方式的影響。Mortierellomycota能通過合成和分泌草酸[31，32]溶解土壤中的礦質磷，增加土壤養分含量，Mortierellomycota還可以在富鐵土壤中快速生長，并利用其菌絲為芽孢桿菌等有益菌的生長提供便利[33]。該研究中Ascomycota和Mortierellomycota與土壤養分之間存在部分顯著聯系但并未與連作年限之間展現顯著聯系，這與之前的研究存在差別[34]。環境因子關聯分析發現Olpidiomycota、Chytridiomycota和Rozellomycota與連作年限顯著負相關。其中 Olpidiomycota 曾被報道在非連作甜菜中顯著富集[35]，與該研究一致;Chytridiomycota則被報道在連作紅薯中顯著增加[5]，與該研究結果相反。同時Basidiomycota與連作年限呈顯著正相關，說明連作使Basidiomycota 顯著富集，Basidiomy-cota的真菌種類繁多，是真菌中最高等的一門，分布極廣且功能復雜。因此，將Basidiomycota中的菌屬進行組間差異顯著性分析發現，Tausonia在3個不同的生長時期均為Basidio-mycota中的第一優勢屬，豐度均隨連作年限增加而升高，且差異顯著，屬水平的環境因子關聯分析表明，Basidiomycota下的Tausonia和Solicoccozyma均與連作年限呈顯著正相關，與之前的研究中Tausonia與甜菜連作關系一致[35]。之前的研究表明在煙草減少氮肥環境下，Tausonia的豐度會顯著增加[36]。Tausonia還可能參與調節煙草含糖量[37]，或在植物耐受低溫和發酵過程中發揮作用[38]。Tausonia下的T.pullu-lans可以延緩番茄根部有益真菌的菌根定殖[39]，同為茄科作物下的煙草也可能會由于Tausonia的聚集而影響有益真菌的定殖，這可能是造成連作障礙的原因之一。同時Ascomy-cota下的Fusarium和Pseudombrophila也表現出了與連作年限顯著正相關，Fusarium屬下有多種致病菌，其中F.oxysporum可直接引發如根腐病[40-41]，Fusarium 豐度的增加大大提高了連作煙草發生病害的可能性。

該研究發現Tausonia屬在煙草中存在與連作年限間的顯著正相關性，Tausonia屬豐度的提高可能是影響煙草根際真菌群落結構因素之一，這也是未來深入解析植煙土壤真菌群落結構與煙株相互作用的可能切入點之一。

近年來，研究者們嘗試通過各種方式緩解連作對于作物種植的影響： ① 選擇更加科學合理的施肥方式。楊敏等[42]通過施加生物炭來改善根際微生物環境，緩解植物自毒，以牛糞有機肥等綠色肥料來代替傳統化肥，不僅可以改善土壤理化，提高產量，還能減少農業污染[43]。 ② 建立更合理的耕作制度。LuigiOrru等[44研究表明，輪作相較于連作具有更高的真菌多樣性和更好的抗逆性，合理的耕作制度能更加均衡的利用土壤養分，減少病害。 ③ 施加具有特定功能的微生物菌劑定向的修復土壤，從而減輕連作障礙。姜永雷等[45]通過施加微生物菌劑來提高根際微生物胞外酶活性，進而緩解連作影響；戴啟杰4篩選出兩株可以降解自毒成分，還具有明顯的促生長作用的原磷谷氨酸桿菌和特基拉芽孢桿菌，可以用于生產針對連作的菌劑。當然，考慮到植物與微生物間相互作用的復雜性，優化土壤微生物伙伴關系以改善土壤質量極具挑戰[47-49]，單種微生物的變化也可能導致整個群落改變[50]。該研究中發現的連作所導致的真菌群落結構變化以及其與土壤理化性質的相關性，從真菌群落結構調整的角度為煙草連作障礙的治理提供了新的科學依據。

4結論

該研究對煙草種植3個生長時期不同連作年限的根際土壤理化性質和真菌群落結構進行研究，發現土壤養分的積累、真菌群落多樣性顯著降低和真菌群落結構的變化可能是導致連作障礙的部分原因。對真菌群落結構進行進一步分析發現高連作土壤中Basidiomycota富集，并首次在煙草中發現可能影響煙草有益真菌菌根定殖的Tausonia與連作年限顯著正相關;Ascomycota下的Fusarium豐度同樣與連作年限顯著正相關，連作提高了發生根腐病的風險。這為進一步研究其在真菌群落與煙株相互作用中的角色和未來連作障礙治理提供了新的思路，

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