太白貝母鱗莖腐爛病對其根際土壤特性及細菌群落結構的影響

太白貝母（FritillariataipaiensisP.Y.Li）為百合科貝母屬多年生植物，是2020年版《中國藥典》收載中藥川貝母藥材的6個基源品種之一，以干燥鱗莖入藥。鱗莖主要含有生物堿類、萜類、甾體類等多種活性成分2]，具有鎮咳、平喘、化痰、降壓、抗潰瘍、鎮痛、抑菌、抗腫瘤等藥理作用[3]。太白貝母主要分布在湖北、重慶、陜西、寧夏、甘肅、四川等地。近年來，隨著市場需求不斷增大，人工種植是解決太白貝母野生資源匱乏和資源可持續利用的有效途徑，因其經濟價值高，適宜渝東南山區發展，太白貝母在促進藥農增收、助推鄉村振興中發揮獨特的優勢。隨著人工大面積栽培，加上太白貝母生長周期長，生產中病害時常發生，尤其是鱗莖腐爛病的發生，不但影響植株地上部分的生長，使其葉片變黃、萎蔫，整株枯死，還造成鱗莖盤基腐爛，呈褐色，表面常見白色霉層，從而導致減產，也嚴重影響其品質，給藥農造成嚴重的經濟損失。目前尚無有效地根治措施，已成為限制太白貝母種植的一大障礙。

土壤微生物是土壤生態系統的重要組成部分，而微生物群落結構和多樣性與土壤健康密切相關，可作為土壤質量好壞評價的重要指標[4-6]，在維持根際微生態的穩定上起著重要作用，其種群數量變化、群落結構組成與有益菌受到越來越多的關注[7]。藥用植物土壤微生物群落結構平衡與否，對藥材的生長、產量和品質有著重要影響[]，大量研究表明，藥用植物感染根腐病、青枯病、枯萎病、炭疽病和赤星病等土傳病害后根際土壤理化性質、酶活性和微生物群落都發生了變化[9-13]，因此，研究藥用植物和根際微生物的相互作用對中藥產業發展具有重要的實踐和指導意義。目前，有關太白貝母植株鱗莖腐爛病根際土壤細菌的多樣性鮮見報道。因此，本研究以3a生太白貝母健株、病株根際土壤和未種植太白貝母土壤為研究對象，測定鱗莖腐爛病對根際土壤理化性質的影響，同時采用高通量測序技術分析3組樣本間根際土壤細菌物種組成、群落結構及多樣性，旨在探討土壤養分和微生物組成與其鱗莖腐爛病之間的相互關系，并為太白貝母的病害預防及生長管理提供一定的科學參考。

1材料與方法

1.1 根際土壤樣品的采集

樣品采集于紅池壩太白貝母基地 （31^°32^′ 50.38^′′N，109^°2^′8.7^′′E） ，海拔 1779.4m 。選取面積為 50m×20m 田間管理措施一致的太白貝母地塊，每間隔 12m 相鄰的3個小區，每個小區內隨機選取3株具有典型發病癥狀的太白貝母植株根際土壤混合均勻（編號為TD），同時選取3株生長健康、未發病的太白貝母植株根際土壤混合均勻（編號為TH），再取自距離太白貝母試驗地采樣點 50m 左右，從未種過太白貝母的土壤作為對照（編號為CK），各處理重復3次。將9個樣品分別裝于滅菌的離心管中放入冰盒保存，帶回實驗室后去雜，一部分用于DNA的提取，一部分自然風干過篩后用于土壤理化性質的測定。

1.2 土壤理化性質分析

將自然陰干的土壤磨碎過篩（60目）， pH 采用電位法測定（以水土比 5：1 進行處理后，再用pH計測定）；土壤有機質、全氮、全磷、全鉀、堿解氮、有效磷、速效鉀等養分指標測定參考鮑士旦[14的方法。

1.3土壤基因組DNA 提取、PCR 擴增與產物純化

分別稱取9個土壤樣品 0.25g ，按照試劑盒（PowerSoilDNAIsolation Kit，MOBIO 公司）說明書的方法進行總DNA的提取。經 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳（DYY-6C型電泳儀，北京六一）檢測DNA提取質量，使用紫外分光光度計（UV-1810D型，北京普析）檢測DNA樣品的濃度與純度。以稀釋后的DNA為模板，采用細菌通用引物 338F （ 5^′ -ACTCCTACGGGAGGCAGCA- ?3^′ ）和 806R （ 5^′ -GGACTACHVGGGTWTCTA AT-

3^′ ）對 16SrDNA 序列的 V3～V4 高變區進行擴增。PCR擴增體系為： 5× FastPfu緩沖液 4μL 2.5mmol/L dNTPs 2μL ，引物338F、806R（5μmol/L） 各 0. 8μL ，FastPfu聚合酶 0. 4μL DNA模板（ ）1 μL ，最后用滅菌的 將反應體系補至 20μL 。PCR反應條件為 30s;30 個循環； ^72°C，10min 。PCR擴增產物使用 2% 瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，純化后送至北京奧維森基因科技有限公司進行高通量測序。

1.4 數據分析

利用Excel201O對數據進行整理、計算分析，利SPSS2020中的Duncan分析法對數據進行單因素方差分析（ANOVA）。使用Uparse（version7.1）軟件，在 97% 相似性水平下對序列進行OTUs聚類分析。采用Mothur軟件計算Chaol等物種豐富度和 Shannon 和 Simpson等物種多樣性指數以及Venn圖的繪制，Beta多樣性分析（PCA分析），采用Canoco4.5軟件進行余分析（RDA），采用Origin2016軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 根際土壤理化性質

由表1可知，3組土壤樣品中的 ΔpH 、有機質、全氮、全磷、全鉀、堿解氮、速效磷和速效鉀等土壤養分差異顯著（ ?Plt;0.05） 。試驗地土壤類型屬于弱酸性， pH 為 5.73～6.48，pH 顯著降低，表明土壤逐漸酸化。感病植株根際土壤中 ΔpH 、全鉀和速效鉀含量均顯著低于健康植株根際土壤和未種植太白貝母土壤（ Plt;0.05 ，而感病植株根際土壤中全氮、堿解氮速效磷含量顯著高于健康植株根際土壤和未種植太白貝母土壤 （Plt;0.05） 。感病植株和健康植株根際土壤中的有機質含量顯著高于未種植太白貝母土壤（ Plt;0. 05） ，而全鉀含量則顯著低于未種植太白貝母土壤（ ?Plt;0.05） 。

2.2根際土壤細菌的 a 多樣性分析

對感病和健康太白貝母植株根際土壤、未種植太白貝母土壤的9個土壤樣品采用高通量測序，最終得到高質量序列共 535～909 條，其中CK、TH、TD組分別平均為 54～268 條、 59～430 條、 .56～781 條，且大部分長度集中在 400～440 bp。從圖1看出，曲線隨著測得序列數量的增加而基本趨于平緩，說明測序數量足夠，能反映9個土壤樣本的細菌群落組成，為后續研究奠定了良好的基礎。

從表2中可以看出土壤根際細菌物種覆蓋率均達到 98% 以上，表明3組樣品所構建的細菌文庫能有效地反映其物種多樣性，但也有部分細菌未被發現。各樣品土壤根際細菌物種Chao1指數和Shannon指數，從表2可見差異性較大。Chaol指數和Shannon指數均以健康植株根際土壤最高，TH、TD、CK組中Chaol指數分別為4829.52、4634.60、3523.11，差異達顯著水平（ Plt;0.05 ），表明健康植株根際土壤細菌群落豐度越高。TH、TD、CK組中Shannon指數分別為9.85、9.71、9.31，差異達顯著水平（ ?Plt;0.05） ，而TH、TDCK組中Simpson指數分別為0.9912、0.9987、0.9979，差異不顯著（ Pgt;0. 05 ），表明健康根際土壤細菌群落的多樣性越高。

由圖2可知，CK、TD、TH3組土壤樣品共產生6544個細菌OTUs，其中，TH組樣品的OTUs最多，為3790個，占總數的 56.58% ;其次為TD組樣品，為3626個，占總數的 55.41% ：CK組的最少，為2829個，占總數的 43.23% ，說明感病太白貝母植株根際土壤細菌的OTUs數較TH、CK明顯減少了。3組土壤共有的OUTs為2968個，CK有281個OTUs，TD組有331個特有的OUTs，TH組有459個特有的OTUs，預示著TH組有較多的特有微生物種類。TH和CK共有248個OTUs，TD和CK共有278個OTUs，而TH和TD共有1979個OTUs，表明TH和TD的細菌群落相似度較高，TH和CK、TD和CK的細菌菌群落相似度較低。

2.3 土壤細菌群落的組成

使用Silva數據庫對OTU序列進行相似性比對，9個土壤樣品在細菌門水平上組成基本相似，共檢測出42門、111綱、155目、289科、479屬，但門水平相對豐度有所差別。如圖3所示，相對豐度大于 1% 有12門細菌，TH、TD、CK根際土壤中優勢菌群門分別是變形菌門（Proteobacte-ria） （44.11%，24.32%，43.08%） 、酸桿菌門（Ac-idobacteria） （5.17%，21.50%，13.59%） 、擬桿菌門（Bacteroidetes） （5.17%.20.07%.6.13%） 放線菌門（Actinobacteria）（19. 21% 、7. 17% 715.11% ）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）（2 （4.16%，1.85% ， 4.97% ）、藍藻門（Cyanobacteria） （0.85%.2.84%.5.51%） 、綠彎菌門（Chlo-roflexi） （3.37%.2.62%.4.26%） 、疣微菌門（Verrucomicrobia） （4.34%.2.90%.1.21%） 、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）（2. 40% 、1. 93% ！0.62%） 、厚壁菌門（Firmicutes）（1. 64% 、6.53% 、1. 40% ）、浮霉菌門（Planctomycetes）（0.48%.5.99%.1.13%） 、儉菌總門（Parcubac-teria） （2.32%.0.62%.0.36%） ，這些菌在TH、TD、CK太白貝母根際土壤中分別占細菌總數的97.58%.98.14% 和 96.63% 。其中，變形菌門、酸桿菌門、擬桿菌門和放線菌門4門細菌為太白貝母根際土壤中相對豐度均大于 10% ，顯著高于其他門細菌（ Plt;0.05） ，是根際土壤中的優勢門。與感病根際土壤相比，健康根際土壤和未種植太白貝母土壤中變形菌門、放線菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門相對豐度上升，其相對豐度分別是感病根際土壤的1.81倍、1.77倍，2.68倍、2.11倍，2.25倍、2.69倍，1.29倍、1.63倍；而感病根際土壤中酸桿菌門、擬桿菌門、藍藻門、厚壁菌門、浮霉菌門相對豐度上升，特別是酸桿菌門、擬桿菌門的相對豐度是健康根際土壤的4.16倍、3.88倍；健康根際土壤中疣微菌門、硝化螺旋菌門、儉菌總門的相對豐度高于感病根際土壤和未種植太白貝母土壤。太白貝母感病植株根際土壤細菌優勢門水平相對豐度的變化，可能是太白貝母植株根際土壤細菌相互間存在的拮抗平衡遭到破壞，導致太白貝母植株抗性減弱。

2.4根際土壤細菌群落的相關性分析

在屬水平對不同根際土壤群落組成結構進行PCA主成分分析。較健株相比，太白貝母感病后，根際土壤細菌群落的主成分發生了變異，土壤細菌群落的主成分的方差累計貢獻率為56.06% ，坐標軸中樣本對應的主成分變異方差為15.22% （圖5），說明這兩個主成分是解釋3組樣本中土壤細菌群落差異的主因子。CK1、CK2、CK3位于Y軸右側的X軸上方，TD1、TD2、TD3位于Y軸左側的X軸上方，TH1、TH2、TH3位于Y軸左側的X軸下方。3組樣品中組內距離較近，表明組內細菌群落結構相似度較高；組間距離相對較遠，表明組間細菌群落結構均具有明顯差異。結果與3組樣品的UPGMA聚類結果類似（圖6）。

基于WeightedUnifrac距離算法做太白貝母根際細菌樣品的UPGMA聚類分析，將各樣品在屬水平上的聚類結果展示在圖6中，TH、CK土壤樣品聚為一類，TD土壤樣品聚為另一類，這種結果說明，TH、CK根際土壤細菌結構相似，TH、CK與TD根際細菌群落結構存在一定的差異。

2.5根際土壤理化性質與細菌群落結構相關性分析

根際土壤理化性質與太白貝母細菌 α^- 多樣性指數之間的相關性分析見表3，豐富度指數Chao1與堿解氮呈顯著正相關，與有機質、全氮呈極顯著正相關，而與 pH 、全磷、全鉀、有效磷、速效鉀呈極顯著負相關。多樣性指數Shannon與有機質呈極顯著正相關，與全氮呈顯著正相關，與全鉀、有效磷、速效鉀呈極顯著負相關，而與全磷呈顯著負相關，說明太白貝母根際菌細多樣性主要受土壤 pH 、有機質、全氮、全磷、全鉀、堿解氮、有效磷及速效鉀的影響。

分別對3組土壤樣品中 pH 、有機質（SOM）、全氮（TN）、全磷（TK）、全鉀（TP）、速效氮（AN）、速效磷（AP）、速效鉀（AK）與OTU之間的相關性進行冗余分析（圖7），前2軸總共解釋了77.19% 的細菌群落變化，軸1特征值為66.48% ，軸2特征值為 10.71% 。從圖中可以看出，土壤 pH 、有機質、全氮、全磷、全鉀、有效磷、速效鉀與布氏桿菌屬、芽單孢菌屬、Candidatus_Solibacter、根瘤菌屬、酸熱菌屬、酸桿菌屬及Mu-cilaginibacter的相對豐度呈顯著正相關，與硝化螺菌屬、變桿菌屬、H16、RB41、鞘氨醇單胞菌屬、土生單胞菌屬、假單胞桿菌屬、費氏桿菌屬和黃桿菌屬的相對豐度呈顯著負相關。H16、RB41、鞘氨醇單胞菌屬、土生單胞菌屬、假單胞桿菌屬、費氏桿菌屬和黃桿菌屬與土壤堿解氮呈顯著正相關，而與其他環境因子呈顯著負相關，由此說明根際細菌群落的結構組成受土壤環境理化因子的影響。

3 結論與討論

鱗莖腐爛病是一種危害極大的土傳病害，它的發生與根際土壤的理化性質、土壤微生物的群落結構與數量有著密切的關系[15-16]，土壤養分氮磷鉀失調、酸化增加土傳病害發生、加重，嚴重影響植物生長、造成產量降低、品質變劣[17-18]。因此，了解土壤理化性質對太白貝母鱗莖腐爛病的發生具有重要的意義。本試驗土壤理化性質測定結果表明，3組樣品土壤理化性質存在顯著差異，

主要表現在感病植株根際土壤的全氮、全磷、堿解氮和有效磷含量顯著高于健康植株根際土壤，而pH 、有機質、全鉀、速效鉀含量顯著低于健康植株根際土壤。馬月等[19]在人參根腐病的研究中報道了健康人參根際土壤中有機質、速效鉀、堿解氮、pH的含量顯著高于發病人參根際土壤，速效磷沒有明顯變化。在黃連根腐病的研究中，也報道了病株根際土壤速效磷、速效氮顯著高于健株[20]。而李雪萍等[9]研究結果卻顯示青稞根腐病的發生與有機質、有效磷、速效鉀和pH相關系數很小，且不顯著。以上研究結果的不一致可能受植物種類、土壤類型、土壤肥力、土壤理化性質、氣候條件以及田間農事操作等多種因素影響。

王壤微生物在一定程度上反映土壤質量和健康程度，對植物健康起著十分重要的作用[21-22]，當根際土壤中細菌群落結構合理，多樣性程度越高，物種越豐富，植物抗病性就越強[23]。通過 Miseq測序平臺對3組太白貝母土壤樣品進行基因組測序，發現健康樣品中細菌在門、綱、目、科、屬和OUT分類水平高于感病根際細菌群落， α^- 多樣性分析結果表明，健康太白貝母根際土壤細菌OTU數目高于感病植株，病株根際土壤OTU數自高于未種植太白貝母土壤，健康根際土壤比病株根際土壤擁有更多特有物種，病株根際土壤細菌群落結構的多樣性低于健株。與楊尚東等[24]研究發現，甘蔗宿根矮化病的患病株與非感病植株相比，根際土壤的細菌豐度與多樣性不同程度降低的結果一致。在Chaol指數、Shannon指數、Simpson指數上，健康植株、感病植株根際土壤細菌群落結構與豐富度均比未種植太白貝母土壤豐富，與葛應蘭等[25]在馬鈴薯根際土壤細菌 Simp-son指數、Shannon指數和Chaol指數高于非根際的結果一致;而毛竹林[26]、橡膠樹[27]地根際土壤細菌群落豐富度及多樣性均低于非根際土壤，造成這種差異說明植物對根際微生物具有較強的選擇性、特異性[28]。研究表明，感染病害后對植物根際土壤細菌影響較大，常常導致細菌種群數量減少且群落多樣性趨于單—[29-31]。因此，鱗莖腐爛病侵染太白貝母后，引起其根際王壤的細菌數量下降，多樣性程度和豐度低于健康植株根際土壤，從而使得根際土壤細菌發生了變化，可推測太白貝母鱗莖腐爛的發生、蔓延可能與其根際土壤細菌多樣降低密切相關。

土傳病害的發生與植株根際土壤微生物數量及群落結構有密切關系[32]，土壤微生物的種類和數量影響植物生長、發育，土壤微生物群落可作為土壤質量的指標[33-34]。研究結果發現，鱗莖腐爛病引起太白貝母根際土壤細菌群落結構與多樣性變化，一些菌群結構表現出一定的差異。其中，變形菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、放線菌門為太白貝母根際微生物群落中的優勢菌門，與浙貝母[35]、北艾[36]根際土壤的研究也顯示相同的優勢菌。變形桿菌門具有溶磷、釋鉀和固氮功能[17]，已被廣泛應用在植物病蟲害防治、肥料高效利用、污水處理等[37]方面。感病根際土壤中酸桿菌門相對豐度增加，筆者推測與太白貝母的根系酸性生長環境可能有關，因而太白貝母根際選擇和富集了較高豐度的酸桿菌門菌群[38]。同時擬桿菌門、厚壁菌門、厚壁菌門、浮霉菌門數量及所占比例增多而變形菌門、放線菌門、芽孢桿菌門、綠彎菌門等減少，這一結果與楊尚東等[24]的結果相似。病原優勢屬如黃桿菌屬、地桿菌屬、RB41、假單胞桿菌屬相對豐度高于健康植株根際土壤，黃桿菌屬可引起核桃黑斑病[39]、菜葉斑病[40]和印度橡膠榕葉枯病[41]的發生；假單胞菌屬中 P .agarici、P .amygdali、 P .asplenii等20個種是引起多種植物[42-43]和食用菌[44]的主要細菌性病害的病原菌。而健株根際土壤中卻聚集較多的有益菌，如Candidatus_Solibacter、海生囊菌屬、慢生根瘤菌屬、硝化螺菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、王生單胞菌屬等的相對豐度較高，研究表明慢生根瘤菌屬、根瘤菌屬和芽胞桿菌屬分別隸屬于變形菌門和芽胞桿菌門，為生防菌，對植物病蟲害具有一定防病作用[45-46]。鞘氨醇單胞菌屬中的某一些菌株報道具有固氮作用[47]，還能分泌萘乙酸等生長激素和病原菌拮抗物質[48]。Haliangium在健康植株根際富集，可能增強土壤中的固氮和溶磷功能[49]，并促進植物生長來抵御病原菌的侵染，這還有待于進一步研究證實。因此，太白貝母患鱗莖腐病與其根際土壤微生物群落變化有一定相關性，推測某些種的有益菌，其數量下降導致病原菌浸染加重，發病率上升，故可作為太白貝母土壤健康與鱗莖腐爛病發生的指示因子。

總之，土壤理化性質與微生物群落組成具有緊密聯系，3組土壤理化性質具有顯著差異，通過Illumina高通量測序分析明確了鱗莖腐爛病侵染對太白貝母根際土壤中細菌群落結構及多樣性的變化，為太白貝母鱗莖腐爛病的生物防治提供了借鑒。本研究只是對太白貝母感染鱗莖腐爛病后一個時期的細菌群落結構及多樣性進行了分析，尚缺乏對太白貝母植株各個生長期和發病階段細菌多樣性研究，以及真菌群落多樣性分析，在今后將作進一步的研究。

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Effects of Bulb Rot Disease on Rhizosphere Soil Characteristics and Bacterial Community Structure of Fritillaria taipaiensis P.Y.Li

HAN Feng1'2， ZHANG Wenwei1 ， LUO Chuan1，WANG Li1 ， TAN Qiusheng1 and LIN Maoxiang1 （1.Chongqing Institute of Medical Plant Cultivation，Nanchuan Chongqing408435，China;2.Chongqing Enginering Research Center forFineVariety Breding Techniquesof Chinese Materia Medica，Nanchuan Chongqing408435，China）

Abstract This study aims to investigate the effects of bulb rot on the physical and chemical properties of rhizosphere soil as wellas the bacterial community structure and diversity of Fritillaria taipaiensis.The rhizosphere soil of F .taipaiensis plants with healthy bulbs，the rhizosphere soil of plants with bulb rot，and bulk soil were selected as research materials.The soil physical and chemical properties were measured，and Illumina MiSeq sequencing technology was used to analyze the structural diversity，composition，and relative abundance of bacterial communities in the three sample groups. The results showed that there were significant differences in pH，organic matter， total nitrogen，total phosphorus，total potassium，available nitrogen，available phosphorus，and available potassium between the rhizosphere soils of healthy and diseased plants.A total of 6 544 bacterial OTUs were detected in the three groups of soil samples，representing 42 phyla，111 classes，155 orders，289 families， and 479 genera.The relative abundances of Proteobacteria，Acidobacteria，Bacteroidetes，and Actinobacteria exceeded 10% ，making them the dominant phyla. Bryobacter，Candidatus_Solibacter， Flavobacterium，and Rhizomicrobium had relative abundances greater than 3% ，making them dominant genera.Correlation analysis between soil properties and rhizosphere microbial in fields indicated that soil pH ，organic matter，total nitrogen，total phosphorus，total potassium，available phosphorus，and available potassium were significantly positively correlated with Brucella ，Gemmatimonas ， Candidatus_Solibacter， Rhizomicrobium， Acidothermus，Acidibacter ，and Mucilaginibacter.Significant negative correlations were observed with Nitrospira， Varibacter， H16，RB41， Sphingomonas ， Terrimonas ， Pseudomonas， Ferruginibacter，and Flavobacterium. The results provide a theoretical basis for controlling bulb rot disease in F . taipaiensis by regulating the microbial community structure.

Key wordsFritillria taipaiensis P. Y.Li; Bulb rot;Rhizosphere soil; Bacterial diversity; High throughput sequencing

Received 2024-09-10 Returned 2024-11-12

Foundation item Special Project of Basic Research of Chongqing Municipality （No. 23JK71-2512）; Special Project for Performance Incentive and Guidance of Chongqing Scientific Research Institutions （No.cstc2018ixil-ibkvl30002）.

First authorHAN Feng，female，associate research fellow. Research area：cultivation of medicinal plants.E-mail：hanfengasdf@126.com

Corresponding authorLIN Maoxiang，male，research fellow.Research area：classification of medicinal plant resources and protection of endangered plants. E-mail：linmx20o7@126.com

ZHANG Wenwei， male，associate research fellow.Research area：cultivation and quality of medicinal plants.E-mail：ssf333@126.com

（責任編輯：史亞歌 Responsible editor：SHI Yage）