白地霉和巢狀毛霉混合發酵腐乳后酵期理化性質及風味物質研究

中圖分類號：TS205.5 文獻標志碼：A 文章編號：1000-9973（2025）07-0047-08

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2025.07.007

Study on Physicochemical Properties and Flavor Substances of Sufu Mixed Fermented by Geotrichum candidum and Mucor nidicola in Post Fermentation Period

CHEN Chen，REN Yan-lin， CHEN Zhong-ai， PI Yu-ran， TIAN Juan，LIU Qin-ming，HU Yong-jin* （College of Food Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming 65O2o1，China）

Abstract： Sufu is mixed fermented with the ratio of Geotrichum candidum to Mucor nidicola of 2：1 In view of the post fermentation period of sufu，the changes of physicochemical properties and flavor substances are investigated. The results show that the total acid content increases rapidly during 4～ 6 weeks of post fermentation，reaching 1.148g/100g at the 9th week of post fermentation. At the 3rd week of post fermentation，the protein content increases rapidly. At the 9th week of post fermentation，the content of water-soluble protein reaches 21.05g/100g ，and the content of amino acid nitrogen reaches （20 1.293g/100g ，The total free amino acid content of sufu at the beginning of post fermentation is 1.388mg/g and it increases rapidly at the 9th week of post fermentation，reaching 22.272mg/g ，among which，the content of aspartic acid and glutamic acid presenting umami increases obviously， giving umami and sweetness to sufu. The content of alcohols increases significantly，accounting for 56.18% ，and the content of esters also increases，accounting for 10.73% ，which gives a unique aroma to sufu， thus improving the quality of sufu.

Key words： sufu； fermentation by mixed bacteria；post fermentation；physicochemical property； flavorsubstances

腐乳（sufu）是以大豆為主要原料，通過磨漿煮漿制成豆腐后，再將豆腐劃坯、前發酵、拌料，經后熟發酵制成的輔餐調味制品[1]。腐乳別稱霉豆腐、豆腐乳，西方國家又將其美稱為“中國奶酪”，是中國流傳千年的傳統民間特色美食[2]。與其他發酵大豆制品相比，腐乳獨特的生產工藝有效提高了大豆的生物學效價[3]，使其風味醇厚、濃香，口感滑潤、細膩，營養豐富[4]。腐乳富含多種代謝物，如風味物質和氨基酸等[5]，此外，它是蛋白質和鈣的良好來源，因此被認為是一種健康食品[7]。腐乳生產發酵方式主要有自然發酵、單菌發酵和混菌發酵。由于自然發酵在生產上不易控制，單菌發酵效率較低，因而混菌發酵逐漸成為焦點。腐乳發酵主要包括前期發酵和后期發酵[8]。前酵期主要指經過大豆的挑選清洗、浸泡研磨、過濾熬漿、壓塊成型制得豆腐，繼而將豆腐切成均勻的小方塊，在豆腐坯上接人菌種后發酵成毛坯的過程。后酵期主要指經過前酵期發酵成型制得的豆腐毛坯，進行搓毛后，加入白酒和各種輔料進行腌制，再裝罐密封發酵成熟。此階段發酵周期較長，一般為 2～4 個月，更可長達1年左右。

本研究以白地霉和巢狀毛霉按 Ω₂：Ω₁ 的比例混合發酵腐乳，針對混菌發酵后期的腐乳，以7d為一個周期測定其在不同時間段的水分含量、氨基酸態氮含量、總酸含量、水溶性蛋白質含量的變化，利用全自動氨基酸分析儀測定腐乳后酵開始時和后酵9周后腐乳中游離氨基酸的種類和含量，并采用GC-MS分別測定腐乳后酵開始時和后酵9周后腐乳中的揮發性風味物質。本研究為腐乳發酵方式及其品質優化提供了理論依據，對傳統自然發酵的腐乳品質提升具有重要意義。

1材料與方法

1.1 材料與試劑

腐乳樣品：昆明市石林縣某農家自制腐乳；菌種：云南省高校食品微生物資源與利用重點實驗室；金龍魚菜籽油：上海嘉里食品工業有限公司；路南高粱酒：昆明竹興酒業有限公司；食鹽：云南省鹽業有限公司；棘椒粉、花椒粉、八角粉：購自昆明大爾多超市。

1.2 儀器與設備

L8900氨基酸分析儀英國Biochrom公司;HC103鹵素水分測定儀南京曉曉儀器設備有限公司；AX223ZH/E電子天平奧豪斯儀器（常州）有限公司；Dragon-Lab 移液槍大龍興創實驗儀器（北京）有限公司；UV-1800紫外可見分光光度計翱藝儀器（上海）有限公司;SF-TDL-4A 高速離心機上海菲恰爾分析儀器有限公司；TSQ8000質譜儀賽默飛世爾科技有限公司。

1.3方法

1.3.1腐乳發酵菌株的篩選純化和鑒定

1.3.1.1采樣與菌種分離純化

采取自然發酵而成的不同時間階段（3，5，7d）的腐乳毛坯。稱取 1g 毛坯樣品于 10mL 無菌生理鹽水中，搖蕩后制成不同濃度 10^-2～10^-8 的10倍梯度稀釋液。吸取 0.5mL 不同濃度梯度的稀釋液于凝固的孟加拉紅平板內，并使用涂布棒進行涂布，使其在平板內混合均勻。混勻后倒置平板（不同稀釋度做3次平行），于 28^°C 培養箱中培養 2～3d 。挑選生長良好的單菌落，采用平板劃線法在孟加拉紅培養基上劃線培養，然后于 28°C 培養箱中培養 2～3d 。菌種純化3代后，轉接到試管斜面上培養2d，然后選取其中的白地霉和巢狀毛霉進行后續實驗。

1.3.1.2 菌株的分子生物學鑒定

選取能夠挑選單菌落并無雜菌生長的平板送至北京擎科生物科技股份有限公司進行DNA提取，R1菌株和R2菌株分別以IT（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）為引物進行PCR擴增，擴增產物經 1% 瓊脂糖凝膠電泳分離，進行18SrDNA基因測序。

將菌株的基因測序結果與NCBI網站上的GenBank數據庫經BLAST程序進行基因對比分析，確定菌株的種屬后，選取同源性高的10株菌，利用高同源性的10株菌的基因序列進行同源性分析，通過MegaX構建菌株的系統發育樹。

1.3.2 腐乳的制備

將豆腐切成 2cm×2cm×2cm 的小方塊，接入白地霉和巢狀毛霉比例為 2：1 、濃度為 10⁶CFU/mL 的菌懸液后進行發酵，取發酵成熟后的豆腐毛坯，先進行搓毛處理，然后將毛壞四周浸潤在 56% vol路南高梁白酒中，隨后瀝出毛坯。將事先稱量的 10% 食鹽、 7% 辣椒面、 2% 花椒面 .1% 八角粉（以毛坯重量計）混合均勻后，將毛坯四周裹上輔料進行拌料腌制處理，隨即將拌好料的腐乳毛坯整齊地碼放在事先用白酒消毒的罐子中，然后倒入事先煉熟并冷卻涼透的菜籽油（菜籽油需淹沒過所有豆腐坯），蓋上蓋子后，將腐乳于常溫下密封保存2個月，期間每7d為一個周期取樣用于后續理化指標的測定。

1.3.3 理化指標分析檢測

水分含量按照GB5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》中的方法進行測定[9]。總酸含量按照GB12456—2021《食品安全國家標準食品中總酸的測定》中的方法進行測定[10]。氨基酸態氮含量按照GB5009.235—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態氮的測定》中的方法進行測定[11]。水溶性蛋白質含量按照GB5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中的方法進行測定[12]。

1.3.4游離氨基酸的測定

采用L8900全自動氨基酸分析儀對后酵剛開始時的腐乳以及后酵第9周時的油腐乳進行游離氨基酸含量的測定。

待測樣品前處理：稱取 2g 腐乳樣品，加水定容至50mL 容量瓶中，混勻過濾后，吸取 20mL 待測液于離心管中，加人 20mL5% 磺基水楊酸溶液混勻，在 6000g 離心力下離心 10min ，吸取上清液 20mL 在旋轉蒸發儀中蒸干，加人 1mL 檸檬酸鈉緩沖液溶解后用 0.45μm 濾膜過濾上樣。

采用外標法測定樣品中游離氨基酸含量，氨基酸在分離柱分離后與芘三酮反應，生成物能被分光光度計檢測，脯氨酸檢測波長為 440nm ，其他氨基酸檢測波長為570nm 。氨基酸含量參照GB5009.124—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》中的方法進行測定[13]。

1.3.5 揮發性風味物質的測定

利用GC-MS對后酵剛開始時的腐乳以及后酵第9周時的油腐乳中的揮發性風味物質進行檢測分析。使用得到的揮發性風味物質總離子流圖，利用GC-MS對揮發性風味物質進行檢索定性分析，保留SI和RSI大于700的結果，利用揮發性風味物質的CAS號對其進行鑒定[14]。

待測樣品前處理：將 5g 樣品裝人 15mL 樣品瓶內，SPME萃取頭在氣相色譜口于溫度 270°C 下老化1h，將老化后的萃取頭插入樣品瓶頂空處， 60^°C 水浴萃取 60min 。萃取結束后插人GC-MS氣相層析的注射口，使用不分流模式熱解析揮發性風味物質。

1.3.6 腐乳的成熟標準

目前腐乳的成熟度多以總酸、氨基酸態氮的含量作為判斷依據[15]。成熟腐乳的基本理化指標見表1。

表1成熟腐乳評價指標

1.3.7 腐乳的感官評價

腐乳的感官評價是評價腐乳品質的重要指標之一，腐乳的感官評價表參照萬紅芳[16]的評價標準并稍作改動，包括腐乳的色澤、香氣、滋味、質地，本次共有10名同學進行感官評價，感官評價標準見表2，滿分為100分。

1.3.8 數據統計分析方法

使用Design-Expert11軟件進行數據分析，使用Origin9.0、Excel2020進行制表繪圖，數據結果以平均值 ± 標準偏差的形式表示。

2 結果與分析

2.1 菌種的分離與鑒定

從采集的3種不同發酵時間階段的路南腐乳的毛坯樣品中共篩選出5株優勢菌株，其中包括3株霉菌，2株酵母菌，見圖1。選擇優勢發酵菌株R1和R2進行后續實驗。

2.2 菌株基因序列測定

以菌株的基因序列為模板，R1菌株和R2菌株分別以ITS1和ITS4為引物進行PCR擴增，產物進行 1% 瓊脂糖凝膠電泳分離，18SrDNAPCR電泳結果見圖2。

由圖2可知，菌株有較清晰明亮的特異性條帶，由此可進行基因序列測定。

2.3菌株發育樹的建立

根據形態學觀察結合同源性比對，確立菌株R1為Geotrichumcandidum，菌株R2為Mucornidicola。根據同源性比對結果，采用MegaX對菌株建立系統發育樹，R1和R2菌株的系統發育樹分別見圖3和圖4。

2.4腐乳后酵期水分含量和總酸含量的變化

由圖5可知，腐乳前酵過程中水分含量較高，毛坯樣品的水分含量保持在 72.39% ，后酵 1～4 周期間壞體的水分含量大幅度降低，由 72.39% 降至 58.81% ，原因是后酵過程中食鹽、白酒、輔料的加入導致蛋白網絡結構發生改變，水分從蛋白孔徑中滲出。后酵 4～6 周期間，水分含量持續下降，保持在 57.4% 左右，后酵 7～9 周期間水分含量變化減緩并逐漸保持穩定，符合行業標準。后酵剛開始時總酸含量較低，為 0.158g/100g 。后酵4周內總酸含量增加較緩慢，后期隨著各種酶系的活性不斷提高以及微生物種間的協同作用，總酸含量迅速增加，由后酵4周時的 0.444g/100g 增加到后酵6周時的 0.809g/100g ，而后酵7周后總酸含量增速減緩，原因是微生物分解代謝了部分酸類物質，導致總酸含量增速減緩。后酵9周時總酸含量為 1.148g/100g ，未超過國家標準的 1.3g/100g ，且后續發酵過程接近尾聲，總酸含量變化逐漸趨于平緩。

由圖6可知，后酵過程中腐乳的氨基酸態氮含量呈現不斷上升的趨勢，主要原因是在腐乳發酵過程中，菌株分泌的蛋白酶促使蛋白質分解成肽、氨基酸等小分子物質，從而致使氨基酸態氮含量不斷上升。在后酵4周內氨基酸態氮含量上升較緩慢，行業標準規定每 100g 腐乳中氨基酸態氮含量不低于 0.42g 即達到基本成熟[7]，在后酵4周時氨基酸態氮含量為 0.441g/100g ，此時氨基酸態氮含量已經基本達到行業標準中成熟腐乳的要求。后酵4周后氨基酸態氮含量增速較快，當腐乳后酵9周時，氨基酸態氮含量達到最大值 1.293g/100g 。在腐乳后酵剛開始時水溶性蛋白質含量偏低，為 4.81g/100g 在腐乳后酵過程中，水溶性蛋白質含量持續上升，在后酵3周時快速上升，此時水溶性蛋白含量為 11.62g/100g ，最終在后酵9周時水溶性蛋白含量達到 21.05g/100g 。

2.6腐乳發酵過程中游離氨基酸變化分析

表3游離氨基酸組分分析

腐乳后酵剛開始時氨基酸總含量為 1.388mg/g 其中必需氨基酸含量為 0.996mg/g ，占氨基酸總含量的 71.76% ，含量最高的為蛋氨酸，其次依次為異亮氨酸、亮氨酸，這3種游離氨基酸含量達到 0.748mg/g ，占氨基酸總含量的 53.89% 。后酵過程中，腐乳的總游離氨基酸含量快速上升，達到 22.272mg/g ，遠高于一般市售腐乳的游離氨基酸含量，其中必需氨基酸含量達到12.456mg/g ，占氨基酸總含量的 55.93% ，含量最高的為異亮氨酸，其次為蛋氨酸、亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸，其含量均在 2mg/g 以上。后酵9周時呈現鮮味的天冬氨酸和谷氨酸含量出現較大增幅[18且含量較高，分別為1.426，2.213mg/g ，鮮味更突出。另外，后酵剛開始時腐乳中的苦味氨基酸含量較高，其能夠賦予毛坯獨特的滋味，而后酵9周時腐乳中呈現鮮甜味的氨基酸含量大幅升高，致使腐乳的滋味更加美味協調。

注：“—”表示未檢出。

腐乳中含有多種揮發性化合物，對感官品質非常有益[19]。由表4可知，后酵剛開始時腐乳中共檢出74種揮發性化合物，包括醇類16種、酯類5種、酸類2種、酚類8種、酮類5種、醛類1種、烯烴類5種、烷烴類11種、呋喃類及其他類21種。經后酵9周后腐乳中共檢出82種揮發性風味物質，包括醇類17種、酯類16種、醛類9種、酸類2種、酚類1種、酮類3種、烯烴類11種、烷烴類13種、呋喃類及其他類10種，表明原料可顯著增加腐乳中風味化合物的種類和含量。

腐乳后酵開始時共檢出醇類16種，占揮發性風味物質的 15.17% 。后酵9周后共檢出醇類17種，占 56.18% ，其中乙醇含量大量提高，主要是在拌料期間加入的高度白酒浸入腐乳，由后酵剛開始時的 0.99% 上升到 10.93% 。另外，芳樟醇含量極高，其能賦予腐乳特殊的花香味和甜香味[20]。對比后酵過程中腐乳中的酯類物質可知，酯類物質的種類和含量隨后酵的進行而升高。在腐乳后酵剛開始時，酯類物質的種類較少且含量較低，而后酵9周后總共檢出16種酯類，相對含量占 10.73% ，其原因是醇類物質發生酯化反應生成了酯類物質，致使生成大量酯類物質。在腐乳后酵過程中，脂肪酸分解成游離脂肪酸，在酶的催化作用下游離脂肪酸與乙醇發生酯化反應生成具有香氣的脂肪酸酯類物質[21]。

醛類是通過氨基酸的Strecker降解以及酯類物質的過氧化和降解兩條途徑產生的[22]，腐乳后酵開始時由于其前體物質較少，無法大量生成醛類物質。由于后酵9周后腐乳中氨基酸含量大幅提高，且酯類物質含量也有所提高，能夠生成醛類物質，最終檢出醛類9種。腐乳中烴類物質主要有烯烴和烷烴兩大類，后酵開始時檢出烴類物質16種，相對含量偏高。后酵9周后檢出烴類物質24種，隨著發酵時間的增加，烴類物質含量逐漸降低，原因是烴類物質的化學性質不穩定且易氧化。后酵開始時腐乳中檢出較高的酚類物質和吲哚等，酚類物質主要賦予腐乳臭味，使其呈現出腐乳的特征氣味。腐乳后酵9周后檢出具有特殊茴香氣味的茴香腦[23]，脂肪在腐乳后酵過程中降解生成己酸、辛酸等游離脂肪酸，賦予腐乳奶油味、脂肪味[24]；苯丙氨酸在酶的作用下能夠分解代謝成苯乙醇和苯甲醛，它們分別賦予腐乳花甜香和堅果味[25]。整體來看，腐乳的主體風味物質為醇類和酚類物質，賦予腐乳特征香氣，能使其香氣濃郁，呈現良好的風味。

2.8腐乳感官評定結果

從感官品評結果來看，后酵8周時腐乳評分最高，后酵10周與后酵8周時評分較接近，后酵6周時評分最低。3種不同發酵時間的腐乳在色澤上的差異不大，都具有較好的色澤外觀；另外，發酵8周以上的腐乳的香氣和滋味更佳，各種輔料和腐乳能達到協調，香氣濃郁，滋味可口，而發酵6周的腐乳香氣略微不足。后酵10周和后酵6周時腐乳的質地與后酵8周時的腐乳相比要差些。6周發酵時間短，質地不夠細膩且偏硬，不易涂抹，而10周發酵時間偏長，導致腐乳的質地偏軟塌，發酵8周左右其質地更佳，且結合理化指標發酵可達到成熟，由此可見，混合發酵也可縮短發酵周期，2個月左右發酵即可達到成熟。

3 結論與展望

混菌發酵的腐乳在后酵9周后能夠達到成熟，其總酸含量為 1.148g/100g ，氨基酸態氮含量為 1.293g/100g ，水溶性蛋白質含量為 21.05g/100g ，后酵8周時腐乳的感官評分最高，達88.1分，且滿足成熟腐乳行業標準，說明混菌發酵可以在不影響品質的前提下縮短發酵周期。腐乳后酵9周后總游離氨基酸含量達到 22.272mg/g ，腐乳后酵剛開始時共檢測出74種風味物質，腐乳后酵9周后風味物質更復雜，共檢測出82種揮發性風味物質。腐乳的主體風味物質為醇類和酚類物質，其賦予腐乳特征香氣，能使其香氣濃郁，呈現良好風味。

優化發酵條件后的腐乳中游離氨基酸含量高于市售腐乳，風味層次豐富，具有較高的食用價值。同時采用混菌發酵方式，縮短了其發酵周期，蛋白質降解效率高，進而降低了生產周期，提高了企業的利潤率。由于混合發酵的腐乳風味品質較好，因此可以進一步分析檢測混合菌種發酵過程中的營養成分、生物胺等，明確微生物間的群體感應和代謝途徑，為投人生產提供較全面、系統的理論指導和數據支撐。

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