兩種益生菌與積實(shí)聯(lián)用對(duì)功能性消化不良大鼠的改善作用及機(jī)制

摘要 目的探討兩種益生菌（枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌）聯(lián)合中藥枳實(shí)改善大鼠功能性消化不良（FD）的作用及機(jī)制。方法將大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（多潘立酮， 2.7mg/kg ）、枳實(shí)組 （9g/kg） 、嗜酸乳桿菌組（ 5×10⁷ cfu/kg）、枯草芽孢桿菌組（ 5×10⁷ cfu/kg）、嗜酸乳桿菌 + 積實(shí)組（嗜酸乳桿菌 5×10⁷ cfu/kg+積實(shí) 9g/kg ）、枯草芽孢桿菌 + 枳實(shí)組（枯草芽孢桿菌 5×10⁷ cfu/kg+枳實(shí) ），每組8只。除空白組外，其余各組大鼠采用夾尾刺激 .+ 饑飽失常 + 游泳力竭應(yīng)激干預(yù)法建立FD模型；成模后，各組大鼠灌胃相應(yīng)藥物/益生菌混懸液/生理鹽水，每天1次，持續(xù) 14d_o 末次給藥后，檢測(cè)大鼠胃排空率和小腸推進(jìn)率;檢測(cè)大鼠血清中腦腸肽相關(guān)指標(biāo)[胃泌素（GAS）、P物質(zhì)（SP）、血管活性腸肽（VIP）、生長(zhǎng)抑素（SS）、膽囊收縮素（CCK）]水平;觀察胃竇組織和十二指腸組織的病理學(xué)形態(tài);收集大鼠盲腸內(nèi)容物進(jìn)行腸道菌群測(cè)序分析；檢測(cè)大鼠胃竇組織中酪氨酸激酶受體c-Kit、干細(xì)胞因子（SCF）和十二指腸組織中Toll樣受體4（TLR4）、髓樣分化因子88（MyD88）、核因子 κB（NF-κB 的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與空白組比較，模型組大鼠胃排空率、小腸推進(jìn)率，血清中GAS、SP水平，厚壁菌門（Firmicutes）相對(duì)豐度，腸道菌群的Ace、Chao、Sobs指數(shù)，胃竇組織中SCF、c-Kit蛋白表達(dá)水平均顯著降低 （Plt;0.05） ；血清中VIP、SS、CCK水平，擬桿菌門（Bacteroidetes）相對(duì)豐度，十二指腸組織中TLR4、MyD88、NF- σ_κB 蛋白表達(dá)水平均顯著升高 （Plt;0.05） ）；胃竇組織結(jié)構(gòu)基本正常，但十二指腸組織結(jié)構(gòu)存在異常，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組比較，各給藥組大鼠上述指標(biāo)水平大部分顯著逆轉(zhuǎn) （Plt;0.05 ），胃竇組織結(jié)構(gòu)正常；除枯草芽孢桿菌組、枯草芽孢桿菌 + 枳實(shí)組外，其余大鼠十二指腸病理狀態(tài)均逐漸恢復(fù)。與各單藥組相比，各聯(lián)合組大鼠上述大部分指標(biāo)進(jìn)一步改善（ Plt;0.05） 。結(jié)論 枳實(shí)與上述兩種益生菌聯(lián)用均可改善FD大鼠的胃腸動(dòng)力，且效果優(yōu)于單獨(dú)用藥，具體作用機(jī)制可能與激活SCF/c-Kit信號(hào)通路、抑制TLR4/MyD88/NF- κB 信號(hào)通路有關(guān)。

中圖分類號(hào)R965；R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼A 文章編號(hào) 1001-0408（2025）13-1593-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.13.07

Ameliorative fects and mechanisms of two probiotics combined with Auranti Fructus Immaturus o1 functional dyspepsia in rats

LI Zongnian， XIONG Ying，GONG Xiaohui， WANG Lanlan，GUO Zhongqing， JIANG Linlin，LIU Hongying， DENG Kezhong（School of Pharmacy，Jiangxi University of Chinese Medicine，Nanchang ，China）

ABSTRACTOBJECTVEToinvestigateameliorativeectsandmechanismsoftwoprobiotics（Bacilussubtilis，Lactobailus acidophilus）combinedwith Auranti Fructus Immaturus（AFI）on functional dyspepsia（FD）inrats.METHODsRats were randomly divided into blank group，model group，positive control group（domperidone group， 2.7mg/kg ），AFI group （g_λg/kg） ， L. acidophilus group （5×10^τcfu/kg ），B.subtilis group （5×10⁷cfu/kg） ，L.acidophilus+AFI group（ L. acidophilus 5×10⁷cfu/kg⁺ AFI 9g/kg ），and B subtilis+AFI group（ B subtilis 5×10⁷ cfu/kg+AFI 9g/kg ），with8 rats in each group.Except for the blank group，F(xiàn)Dmodelwasestablishedbytail-clampingstimulation+hungerandsatietydisorder+swimmingexhaustioninothergroups. Aftermodeling，each groupwas giventhecorrspondingdrug/probioticsuspensions/physiologicalsalineintragastrically，oncea day，for14consecutivedays.Afterthelast medication，gastricemptyingrateandtherateof propulsionofthesmallintestinein ratsweremeasured；thelevelsofbrain-gutpeptide-related indicators [gastrin（GAS），substanceP（SP），vasoactiveintestinal peptide（VIP），somatostatin（SS）andcholecystokinin（CCK）] intheserumofrats were measured.Thepathological morphology ofthegastricantrum tissueandduodenal tissuewasobserved.Cecalcontents fromtheratswerecolectedforgutmicrobiota sequencinganalysis.Theproteinexpresionlevelsoftyrosinekinasereceptorc-Kitandstemcellfactor（SCF）inthegastricantrum tissue，as well as Tol-likereceptor 4（TLR4），myeloid differentiation factor 88（MyD88），and nuclearfactor κB （NF- κB ）inthe duodenaltissueoftherats were detected.RESULTS Comparedwiththeblank group，model groupshowed significantlylower gastricemptyingrate，smallintestinalpropulsionrate，serumlevelsofGASandSP，relativeabundanceofFirmicutes，Ace，Chao and Sobs indexes of the gut microbiota，and protein levels of SCF and c-Kit in gastric antrum （Plt;0.05） ），while serum levelsof

VIP，SS and CCK，relativeabundance ofBacteroidetes，as wellasprotein expressions ofTLR4，MyD88，and NF-κB were significantly higher （Plt;0.05 ）.The histological structure ofthegastric antrum tissue appeared basically normal; however， abnormalitieswereobserved in theduodenal structure，with a significant infiltration of inflammatory cells visible. Compared with the model group，all treatment groups significantlymodulatedmostoftheaboveindexes（ .-0.05 ）

Thehistologicalstructureofthegastricantrumtisue Was normal.ExceptfortheB.subtisgroupandtheB.subtilis+AFIgroup， the pathological statesof the duodenum intheremainingrats gradualyrecovered.Comparedwitheach single drug group，mostof above indexes in rats from each combination group showed further improvement （ Plt;0.05 ）.CONCLUSIONS The combination of AFIwithtwoprobioticscanimprovegastrointestinalmotlityiFDrats，andtheefectissuperiortothatofusingthedrugsalone. Thespecificunderlying mechanisms mayberelatedtotheactivationofthe SCF/c-Kit signaling pathwayandtheinhibitionof the TLR4/MyD88/NF- κB signaling pathway.

KEYWORDsfunctional dyspepsia；Auranti Fructus Immaturus；Bacilussubtis；Lactobacillusacdophilus；probiotics；SCF/cKit signaling pathway； TLR4/MyD88/NF σ_κB signaling pathway

功能性消化不良（functional dyspepsia，F(xiàn)D）是常見的功能性消化疾病，具有發(fā)病率高、易反復(fù)等特點(diǎn)，通常表現(xiàn)為胃排空延遲、十二指腸屏障受損與微炎癥、腸道菌群紊亂以及腦-腸肽失調(diào)等[-2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)FD多用促胃腸動(dòng)力藥或益生菌等進(jìn)行治療[3]。枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌是常見的益生菌，可通過調(diào)節(jié)胃腸道菌群、胃腸激素水平、分泌有益代謝物等發(fā)揮改善FD的作用[4-5]。枳實(shí)為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種或甜橙C.sinensisOsbeck的干燥幼果，具有破氣消積、化痰消痞的功效。在中醫(yī)看來，F(xiàn)D可歸屬于“胃皖痛\"\"痞滿\"的范疇，病機(jī)為氣機(jī)阻滯、脾胃運(yùn)化無力，因此應(yīng)以健脾和胃、疏肝理氣為總治療原則，多以枳實(shí)及其相關(guān)方劑進(jìn)行治療[7-8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，中藥/化學(xué)藥聯(lián)合益生菌治療FD具有較好的療效[。因此，筆者推測(cè)枳實(shí)與上述兩種益生菌聯(lián)用治療FD可能也具有較好的療效。

研究表明，F(xiàn)D患者的胃Cajal間質(zhì)細(xì)胞（interstitialcellsofCajal，ICC）會(huì)發(fā)生異常改變，從而影響胃腸道平滑肌細(xì)胞間的信息傳遞、神經(jīng)傳遞及自發(fā)性電活動(dòng)的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致胃腸道功能性障礙[9。而干細(xì)胞因子（stemcellfactor，SCF）在調(diào)節(jié)ICC的增殖、分化和功能方面至關(guān)重要，與平滑肌功能障礙密切相關(guān)[]。SCF是ICC細(xì)胞膜中酪氨酸激酶受體c-Kit的配體，c-Kit信號(hào)途徑被阻斷可導(dǎo)致ICC的異常增殖[]。還有研究表明，十二指腸炎癥及屏障受損是造成FD的主要原因之一，而十二指腸炎癥與Toll樣受體4（Toll-likereceptor4，TLR4）/髓樣分化因子88（myeloiddifferentiationfactor88，MyD88）/核因子 κB （nuclearfactor κB ，NF- σ_κB ）信號(hào)通路有關(guān)[2]。TLR4的激活可啟動(dòng) MyD88/NF?kB 信號(hào)通路的下游促炎途徑，使之釋放大量炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致腸道損傷[]。有鑒于此，本研究擬基于SCF/c-Kit和TLR4/MyD88/NF- σ_κB 信號(hào)通路，研究枳實(shí)與上述兩種益生菌聯(lián)用對(duì)FD大鼠的改善作用及可能機(jī)制，以期為FD的臨床治療提供新參考。

1材料

1.1 主要儀器

MultiskanGo1510型酶標(biāo)儀、NanoDrop2000型超微量分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)ThermoFisherScientific公司；Centrifuge5430R型低溫冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；SPW-DM型電泳儀購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；ChemicDoxXR+型凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；ECLIPSECI-L型正置白光顯微鏡、ECLIPSE80I型正置熒光顯微鏡購(gòu)自日本尼康公司。

1.2 主要藥品及試劑

枳實(shí)藥材（批號(hào)230612B）采自省樟樹市，經(jīng)中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室鄧可眾教授鑒定為酸橙C.aurantiumL.的干燥幼果。多潘立酮片（批號(hào)NHJ3542，規(guī)格 10mg 購(gòu)自西安楊森制藥有限公司；戊巴比妥鈉（批號(hào)P3761）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；羧甲基纖維素鈉（批號(hào)2208302）購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司；胃泌素（gastrin，GAS）、P物質(zhì)（substanceP，SP）、血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）生長(zhǎng)抑素（somatosta-tin，SS）膽囊收縮素（cholecystokinin，CCK）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（批號(hào)分別為MM-21284R1、MM-0444R1、MM-0625R1、MM-0493R1、MM-0034R1）均購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；鼠源 β -肌動(dòng)蛋白（ -actin）抗體（批號(hào)H681707031）購(gòu)自杭州華安生物技術(shù)有限公司；兔源c-Kit抗體、兔源SCF抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗大鼠二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（批號(hào)分別為18696-1-AP、26582-1-AP、SA00001-1、SA00001-2）均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔源TLR4、MyD88、NF- κB 抗體（批號(hào)分別為HY-P80918、HY-P80760、HY-P80765）均購(gòu)自美國(guó)MedChemexpress公司；FastPure型糞便DNA分離試劑盒（批號(hào)C01-10000）購(gòu)自上海美吉逾華生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究所用大鼠為SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重 180～ 220g ，共64只，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2019-0010。大鼠在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)7d，均自由進(jìn)食飲水。本實(shí)驗(yàn)均按照中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，倫理編號(hào)為20241107010。

1.4細(xì)菌

嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus，GIM1.208）由廣東省科學(xué)院微生物研究所提供；枯草芽孢桿菌[Bacillussubtilis，CMCC（B）63501]由中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心提供。

2 方法

2.1供試藥液的制備

取枳實(shí)粉末 50g ，加 2500mL 純水，加熱回流 1.5h 提取2次，合并藥液，過濾后濃縮成質(zhì)量濃度為 0.9g/mL （以生藥量計(jì)）的供試藥液

2.2 分組、造模與給藥

將64只適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后的大鼠隨機(jī)分成8組，分別為空白組（K組）模型組（M組）陽(yáng)性對(duì)照組（Y組，多潘立酮， 2.7mg/kg^[14] ）、積實(shí)組（Z組， 9g/kg^[14] ，以生藥量計(jì)）嗜酸乳桿菌組（R組， 5×10⁷ cfu/kg）、枯草芽孢桿菌組（B組， 5×10⁷ cfu/kg）、嗜酸乳桿菌 + 積實(shí)組（RL組，嗜酸乳桿菌 5×10⁷cfu/kg⁺ 枳實(shí) 9g/kg 、枯草芽孢桿菌 + 枳實(shí)組（BL組，枯草芽孢桿菌 5×10⁷ cfu/kg+積實(shí) 9g/kg） ！每組8只。除K組外，其余各組大鼠參考文獻(xiàn)[15]方法，采用夾尾刺激 + 饑飽失常 + 游泳力竭應(yīng)激干預(yù)法建立FD模型，即用止血鉗夾住大鼠尾巴遠(yuǎn)端1/3處，每次30min，每日2次（間隔 6h ），并于每日下午夾尾結(jié)束1h后進(jìn)行強(qiáng)迫游泳至大鼠力竭，隔日禁食禁水，連續(xù)造模21d。當(dāng)大鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少、反應(yīng)呆滯、毛發(fā)枯燥、糞便軟溏、進(jìn)食量減少時(shí)，表示造模成功。造模成功后，K組、M組大鼠灌胃生理鹽水，其余各組大鼠灌胃相應(yīng)藥液/益生菌混懸液（RL組、BL組在灌胃相應(yīng)益生菌4h后，灌胃枳實(shí)藥液），每天1次，連續(xù) 14d。

2.3大鼠胃排空率及小腸推進(jìn)率的檢測(cè)

末次給藥后，大鼠禁食不禁水 24h 后灌胃黑色營(yíng)養(yǎng)半固體糊（質(zhì)量為 m₀ ），灌胃體積 2mL 30min 后用 3% 戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈采血 10mL ，室溫下靜置30min后，以 3000r/min 離心 15min ，取上層血清保存?zhèn)溆谩Ｈ⊙瓿珊螅幩栏鹘M大鼠，取出胃組織、小腸、盲腸，稱取胃全重 （m） ，洗凈胃內(nèi)容物后吸干水分稱取胃凈重 （m₁） ，計(jì)算胃排空率：胃排空率 =[1-（m-m₁）/m₀]× 100%^[14] 。用直尺分別測(cè)量黑色營(yíng)養(yǎng)半固體糊自幽門向盲腸的推進(jìn)距離 （L₁） 和腸管總長(zhǎng) （L₂） ，計(jì)算小腸推進(jìn)率：小腸推進(jìn)率 =L₁/L₂×100%^[15] 。檢測(cè)結(jié)束后，收集大鼠胃組織、小腸、盲腸組織備用。

2.4大鼠血清中腦腸肽相關(guān)指標(biāo)水平檢測(cè)

取\"2.3\"項(xiàng)下各組大鼠血清樣品，按照ELISA試劑盒說明書方法檢測(cè)大鼠血清中GAS、SP、VIP、SS、CCK水平。

2.5大鼠胃竇組織和十二指腸組織的病理學(xué)形態(tài)觀察

取\"2.3\"項(xiàng)下部分胃組織和十二指腸組織適量，置于4% 多聚甲醛中固定，經(jīng)脫水、包埋、切片后進(jìn)行蘇木素-伊紅染色，經(jīng)封片處理后，采用顯微鏡觀察大鼠胃竇組織和十二指腸組織的病理學(xué)形態(tài)特征。

2.6大鼠腸道菌群檢測(cè)

取“2.3”項(xiàng)下各組大鼠盲腸內(nèi)容物，根據(jù)糞便DNA分離試劑盒操作說明抽提腸道菌群總基因組DNA，使用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA的完整度，使用NanoDrop2000型超微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和純度；經(jīng)擴(kuò)增、純化后，使用NEXTFLEXRapidDNA-SeqKit試劑盒對(duì)純化后的產(chǎn)物建庫(kù)，再利用Illu-minaNextseq2000測(cè)序平臺(tái)測(cè)序。腸道菌群檢測(cè)結(jié)果均在美吉生物云平臺(tái)上進(jìn)行分析。

2.7大鼠胃竇組織中SCF、c-Kit和十二指腸組織中TLR4、MyD88、NF- σ_κB 蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

取\"2.3\"項(xiàng)下各組大鼠胃竇組織適量，提取總蛋白，采用BCA法測(cè)蛋白濃度；將蛋白變性處理后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用 5% 脫脂奶粉室溫封閉 2h ，加入SCF、c-Kit ??β -actin一抗（稀釋度分別為 1：500，1：1 000，1：5 000） ，于 4^°C 孵育過夜；次日，用TBST洗膜 10min ，重復(fù)洗膜3次，加入相應(yīng)二抗（稀釋度為 1：10 000 ）室溫孵育1h，洗膜；經(jīng)顯影處理后，采用凝膠成像儀成像，使用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（ β_β -actin）的灰度值比值表示目的蛋白表達(dá)水平。另外，同上述方法檢測(cè)大鼠十二指腸組織中TLR4、MyD88、NF- κB 蛋白（稀釋度均為1：5000）表達(dá)水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPadPrism9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，故均用 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)（方差齊時(shí)）或Dunnett'sT3檢驗(yàn)（方差不齊時(shí)）。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05 。

3結(jié)果

3.1大鼠胃排空率及小腸推進(jìn)率檢測(cè)結(jié)果

與K組比較，M組大鼠胃排空率、小腸推進(jìn)率均顯著降低 （Plt;0.05） 。與M組比較，各給藥組大鼠胃排空率、小腸推進(jìn)率均顯著升高 （Plt;0.05） ）。與Z組、R組、B組分別比較，BL組大鼠小腸推進(jìn)率均顯著升高 （Plt; 0.05）。結(jié)果見表1。

3.2大鼠血清中腦腸肽相關(guān)指標(biāo)水平檢測(cè)結(jié)果

與K組比較，M組大鼠血清中GAS、SP水平均顯著降低，VIP、SS、CCK水平均顯著升高 （Plt;0.05） ；與M組比較，各給藥組大鼠血清中GAS、SP水平均顯著升高，VIP、SS、CCK水平均顯著降低 （Plt;0.05） 。與Z組、R組、B組分別比較，RL組和BL組大鼠血清中GAS、SP（RL組對(duì)比B組除外）水平均顯著升高 （Plt;0.05 ），VIP、SS、CCK水平均顯著降低 （Plt;0.05 0。結(jié)果見表2。

3.3大鼠胃竇組織和十二指腸組織的病理學(xué)形態(tài)觀察結(jié)果

各組大鼠胃竇組織結(jié)構(gòu)正常，黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，黏膜層血管無明顯充血，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，胃竇組織無器質(zhì)性病變。K組、Y組大鼠十二指腸整體結(jié)構(gòu)正常，腸絨毛排列較規(guī)則，黏膜上皮細(xì)胞無脫落壞死，黏膜層杯狀細(xì)胞數(shù)量豐富，間質(zhì)血管無明顯充血擴(kuò)張，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。M組、B組、BL組大鼠十二指腸結(jié)構(gòu)均存在異常，大量腸絨毛粘連，大量黏膜上皮細(xì)胞脫落壞死，黏膜層杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯減少，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；Z組、R組、RL組大鼠十二指腸組織病理狀態(tài)逐漸恢復(fù)正常，病變程度相比M組減輕。結(jié)果見圖1、圖2。

3.4大鼠腸道菌群檢測(cè)結(jié)果

在門水平上，與K組比較， M 組大鼠厚壁菌門（Firmicutes）相對(duì)豐度顯著降低（ .Plt;0.05 ），擬桿菌門（Bacteroidetes）相對(duì)豐度顯著升高 （Plt;0.05 ；與 M 組比較，各給藥組大鼠厚壁菌門相對(duì)豐度均顯著升高 （Plt;0.05） ），擬桿菌門相對(duì)豐度均顯著降低 （Plt;0.05） ；與Z組比較，RL組、BL組大鼠厚壁菌門相對(duì)豐度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義L ΔPgt;0.05 ），擬桿菌門相對(duì)豐度均顯著升高 （Plt;0.05） ，變形菌門（Proteobacteria）相對(duì)豐度均顯著降低 （Plt;0.05） ；與B組比較，RL組、BL組大鼠厚壁菌門、擬桿菌門的相對(duì)豐度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義！ （Pgt;0.05） ；與R組比較，RL組、BL組大鼠厚壁菌門相對(duì)豐度均顯著降低 （Plt;0.05） ，擬桿菌門相對(duì)豐度均顯著升高 （Plt;0.05 ）。結(jié)果見圖3。

進(jìn)一步通過Ace、Chao、Sobs指數(shù)對(duì)大鼠腸道菌群 ∝ 多樣性進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，與K組比較， M 組大鼠腸道菌群的Ace、Chao、Sobs指數(shù)均顯著降低 （Plt;0.05） ；與M組比較，各給藥組大鼠腸道菌群的Ace、Chao、Sobs指數(shù)均顯著升高 （Plt;0.05） ；與Z組、R組分別比較，RL組大鼠腸道菌群的Ace、Chao、Sobs指數(shù)均顯著升高 （Plt;0.05 。結(jié)果見圖4。

黃色箭頭：黏膜上皮細(xì)胞；紅色箭頭：杯狀細(xì)胞;黑色箭頭：炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

a：與K組比較， Plt;0.05; b：與M組比較， Plt;0.05 ;c：與Z組比較， Plt;0.05 ；d：與R組比較， ΔPlt;0.05 。

與K組比較，M組大鼠胃竇組織中SCF、c-Kit蛋白表達(dá)水平均顯著降低 （Plt;0.05） ，十二指腸組織中TLR4、MyD88、NF- κB 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（ Plt; 0.05）。與M組比較，各給藥組大鼠胃竇組織中SCF、c-Kit蛋白表達(dá)水平均顯著升高（ ），十二指腸組織中TLR4（B組和BL組除外）、MyD88、NF- κB 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（ （Plt;0.05 。與Z組、R組、B組分別比較，RL組、BL組大鼠胃竇組織/十二指腸組織中大部分蛋白表達(dá)水平均顯著升高/降低 ?Plt;0.05 ）。結(jié)果見表3、圖5、圖6。

4討論

FD是一種腸-腦相互作用的疾病，其特征是無器質(zhì)性原因的慢性癥狀，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量[]。枳實(shí)、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌對(duì)FD均有治療效果，因此積實(shí)與兩種益生菌聯(lián)合治療FD可能有明顯的療效優(yōu)勢(shì)。本研究中，枳實(shí)與兩種益生菌聯(lián)合給藥14d后，與M組比較，各給藥組大鼠的胃排空率、小腸推進(jìn)率均顯著升高，表明枳實(shí)、兩種益生菌以及枳實(shí)聯(lián)用益生菌均可改善FD大鼠的胃腸動(dòng)力。進(jìn)一步的病理觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)D大鼠的胃竇組織無明顯器質(zhì)性病變，但是十二指腸有一定程度的損傷，且伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。枳實(shí)、嗜酸乳桿菌以及兩者聯(lián)合使用均對(duì)FD大鼠的十二指腸損傷具有一定的改善作用，但是枯草芽孢桿菌及其與枳實(shí)的聯(lián)合使用均對(duì)FD大鼠的十二指腸損傷無明顯改善，這可能是由于枯草芽孢桿菌對(duì)十二指腸損傷的修復(fù)作用較弱，且能轉(zhuǎn)化枳實(shí)中具有調(diào)節(jié)腸道屏障作用的黃酮苷類成分（如橙皮苷、柚皮苷等[）。

GAS、SP、VIP、SS、CCK是廣泛分布在胃腸道的胃腸激素。研究表明，GAS和SP可以促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)，加速胃排空；VIP、SS、CCK可以抑制胃酸分泌，進(jìn)而減緩胃腸蠕動(dòng)。本研究結(jié)果顯示，與M組比較，各給藥組大鼠血清中GAS、SP水平均顯著升高，VIP、SS、CCK水平均顯著降低;與Z組、R組、B組分別比較，RL組和BL組大鼠血清中GAS、SP（RL組對(duì)比B組除外）水平均顯著升高，VIP、CCK、SS水平均顯著降低。這說明積實(shí)、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌均可促進(jìn)FD大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)，且積實(shí)與兩種益生菌的聯(lián)合作用更好。

研究表明，腸道菌群紊亂可能會(huì)通過破壞腸黏膜屏障、微生物-腸-腦軸等導(dǎo)致FD的發(fā)生和發(fā)展[19]。正常情況下，厚壁菌門與擬桿菌門的相對(duì)豐度比值（簡(jiǎn)寫為厚壁菌門/擬桿菌門值）處于穩(wěn)定狀態(tài)，當(dāng)厚壁菌門/擬桿菌門值降低時(shí)，表明腸道益生菌減少，易導(dǎo)致消化不良等問題[2。本研究結(jié)果顯示，相較于K組，M組大鼠厚壁菌門相對(duì)豐度降低，擬桿菌門相對(duì)豐度升高，即厚壁菌門/擬桿菌門值降低；與M組比較，各給藥組大鼠厚壁菌門/擬桿菌門值升高，提示腸道益生菌增多；與Z組比較，BL組、RL組厚壁菌門相對(duì)豐度無明顯差異，擬桿菌門相對(duì)豐度升高，變形菌門相對(duì)豐度降低，說明積實(shí)與兩種益生菌聯(lián)合后雖未提升腸道益生菌水平，但抑制了變形菌門的有害菌增殖。

研究表明，ICC的生長(zhǎng)、表型維持和功能活性主要由SCF/c-Kit信號(hào)通路介導(dǎo)，而c-Kit作為ⅢI型酪氨酸激酶受體，是ICC的特異性受體，主要由平滑肌細(xì)胞分泌，可與 SCF結(jié)合[0-]。ICC 的數(shù)量和形態(tài)結(jié)構(gòu)異常可直接影響胃腸動(dòng)力。ICC不僅可以接受SP、5-羥色胺等興奮性腦腸肽介導(dǎo)的腸壁緊張性收縮，促進(jìn)腸道運(yùn)動(dòng)；還可以接受抑制性腦腸肽如VIP等，使腸壁松弛2。此外，SCF/c-Kit信號(hào)通路的激活可增強(qiáng)胃腸激素的反應(yīng)性，通過磷酸化SP、神經(jīng)激肽1等受體，調(diào)節(jié)ICC內(nèi)在的起搏節(jié)律，從而增強(qiáng)胃腸道功能[22]。另有研究表明，腸道內(nèi)TLR4/MyD88/NF- κB 信號(hào)通路的激活可導(dǎo)致大量炎癥因子的分泌，從而引發(fā)廣泛的炎癥反應(yīng)，破壞腸上皮的結(jié)構(gòu)完整性，進(jìn)而損傷腸道的機(jī)械屏障和免疫屏障功能[12-13]。本研究結(jié)果顯示，與M組比較，各給藥組大鼠胃竇組織中SCF、c-Kit蛋白表達(dá)上調(diào)，十二指腸組織中TLR4（B組和BL組除外）MyD88、NF- κB 蛋白表達(dá)下調(diào)，且枳實(shí)與兩種益生菌聯(lián)合使用后可進(jìn)一步調(diào)控上述蛋白的表達(dá)。這說明枳實(shí)、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌可通過激活SCF/c-Kit信號(hào)通路、抑制TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路，發(fā)揮改善FD大鼠胃腸動(dòng)力的作用。

綜上所述，枳實(shí)與枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌兩種益生菌聯(lián)用均可改善FD大鼠的胃腸動(dòng)力，且效果優(yōu)于單獨(dú)用藥，具體作用機(jī)制可能與激活SCF/c-Kit信號(hào)通路、抑制TLR4/MyD88/NF- ??κB 信號(hào)通路有關(guān)。

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