黑沙蒿有效物質(zhì)群改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機制研究

中圖分類號R965；R285 文獻標(biāo)志碼A 文章編號 1001-0408（2025）13-1604-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.13.09

Study on mechanism of the efective substance groups from Artemisia ordosica inameliorating rheumatoid arthritis

Hugejile'，WANG Qinghu'，ZHANG Xiaofeng'，KANG Xiurong2，BAI Yingchun1，Lihuricha’，GAO Mingxia’ （1.College of Traditional Mongolian Medicine，Inner Mongolia University for Nationalities，Inner Mongolia Tongliao O2800，China;2.Departmentof Medicine andFood，Tongliao Vocational Collge，Inner Mongolia Tongliao 028000，China）

ABSTRACTOBJECTIVETo investigate theameliorating efect and mechanism ofthe efective substance groups fromArtemisia ordosica（AbbreviatedasHSH）onrheumatoidarthritis（RA）basedonclusterofdiferentiation4/lymphocytecel-specificproteintyrosinekinase/zeta-chain-assciatedproteinkinaseof70kDa/interleukin-17（CD4/LCK/ZAP70/IL-17）signalingpathway. METHOD Theratsweredivided into normal group，model group，HSHlow-dose，medium-dose and high-dosegroups（2.7， 10.8， 21.6mg/kg ）and positive control group（Tripterygium glycosides tablet， 6.3mg/kg ），with1O rats in each group.Except for normal group，RArat model was induced bycomplete Freund’sadjuvant in other groups.Afer modeling，each group was given relevantmedicineornormalsalineintragastrically，onceaday，for28consecutivedays.Thechangesinanklejoitswelingand arthritis index inrats were determined;thepathological changesofanklejointtissewereobserved；thelevelsof inflammatory factors[IL-1β，IL-21，IL-17A，IL-2，interferon γ （ IFN-γ ）and IL-6] in serumand joint fluidof ratswere determined；the levels ofTh1，Th17and Tregcelsinthe whole bloodandspleeofrats were detected;；proteinand mRNAexpressons ofLCK，proto

oncogenetyrosine-protein kinase Fyn（Fyn），ZAP7O，CD45， RAR-related orphan receptor γt （RORγ） ，and forkhead box protein 3 （Foxp3）in ankle synovial tissue were determined. RESULTS Compared with normal group，the changes in anklejoint swelling，arthritis index，the levels ofIL- ?1β ，IL21，IL-17A，IL-2，IFN- γ and IL-6 in serum and joint fluid， thelevelsofThl，Th17cellsandThl7/Tregvalueinwhole

bloodandspleen，and the proteinand mRNA expressionlevelsofLCK，F(xiàn)yn，ZAP70，CD45，andRORyt inankle joint synovium were all significantly increased/elevated（ .Plt;0.05 ）.The level of Treg cells in the spleen，as well as the protein and mRNA expression levels of Foxp3 in the ankle joint synovium were significantly decreased （ ΔPlt;0.05 ）.Compared with model group，most of the above-mentioned indicators were significantly reversed in the positivecontrol group and alldose groups of HSH（ ΔPlt;0.05 ） Thedegreeof pathologicalchangesinanklejointtissueswasmarkedlyimproved，andinflammationwasaleviated. CONCLUSIONSHSHcanregulatethecascadereactionsintheCD4/LCK/ZAP70/IL-17pathwaywithintheT-cellreceptor signalingpathway，therebymodulatingtheTh17/Tregbalance.Thisleadstothesuppresionof inflammatoryresponsesandthe alleviation of synovial tissue damage in ratswith RA.

KEYWORDSArtemisiaordosica；effective substance groups；rheumatoid arthrtis；CD4/LCK/ZAP70/IL-17signaling pathway; Th17/Treg balance；inflammatory responses

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoidarthritis，RA）是一種以滑膜炎為病理基礎(chǔ)的炎癥性和自身免疫性疾病。我國關(guān)節(jié)炎患者有1億以上，且人數(shù)在不斷增加，尤其是在內(nèi)蒙古嚴寒地區(qū)[1-2]。RA歸屬于蒙醫(yī)\"協(xié)日烏素\"病，據(jù)蒙醫(yī)燥“協(xié)日烏素\"功效理論，藥物治療RA時，辨證選擇具有燥“協(xié)日烏素\"功效的蒙藥，以調(diào)三根、扶胃火，促進精華與糟粕的分解[3]

黑沙蒿是具有燥“協(xié)日烏素\"功效的蒙藥材之一，對關(guān)節(jié)腫脹和疼痛有明顯的干預(yù)效果，尤其對\"協(xié)日烏素”病的有效率可達到 90% 以上[4。本課題組前期對黑沙蒿活性成分進行分析后發(fā)現(xiàn)，黑沙蒿有效物質(zhì)群（簡稱HSH）主要含有苯丙素類、黃酮類及酚酸類化合物[5-6]，可明顯改善RA大鼠的一般情況，減輕關(guān)節(jié)腫脹程度，但具體作用機制尚不明確。本課題組前期采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測了HSH改善RA的作用機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可能通過調(diào)節(jié)T細胞受體信號通路中分化簇4（clusterofdifferentiation4，CD4）/淋巴細胞特異性酪氨酸激酶（lymphocytecell-specific protein-tyrosine kinase，LCK）/ 鏈相關(guān)蛋白激酶（zeta-chain-associated proteinki-naseof 70kDa ，ZAP70）/白細胞介素17（interleukin-17，IL-17）信號通路發(fā)揮作用[]。基于此，本研究擬基于上述信號通路探究HSH改善RA的作用機制，以期為HSH治療RA提供實驗依據(jù)。

1材料

1.1主要儀器

DNM-9602型酶標(biāo)分析儀購自北京普朗新技術(shù)有限公司，CaliburI型流式細胞儀購自碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司，NANODROP2000型分光光度計、ABI7500型熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）儀均購自美國ThermoFisherScientific公司，SQS-120P型數(shù)字掃描成像系統(tǒng)購自深圳生強生物科技有限公司，YLS-7C型足趾容積測量儀購自北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 主要藥品與試劑

完全弗氏佐劑和鼠源IL-17A、叉頭框蛋白3（forkheadboxprotein3，F(xiàn)oxp3）抗體（批號分別為1003234204、2422187、2565424）購自美國ThermoFisherScientific公司；固定/破膜試劑盒和鼠源 γ? -干擾素（interferon- ?γ ，IFN-γ）、CD25、CD3抗體（批號分別為00833356、70411023、A30651、AF13982）均購自美國BD公司；流式細胞微球陣列法靈活檢測試劑組包括IFN- γ 、IL-2、IL-1β、IL-6、IL-17A、IL-21單因子微球檢測組件（貨號分別為558342、558346、560232、560231、560282、564343）均購自美國BD公司；鼠源CD4、CD8a抗體（批號分別為2386305、AF14045）均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；兔源LCK、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Fyn（proto-oncogene tyrosine-protein kinase Fyn，簡寫為Fyn）、ZAP70、CD45、視黃酸受體相關(guān)孤兒受體γt亞型（RAR-related orphan receptorγt，RORγt）單克隆抗體以及山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulinG，IgG）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（貨號分別為ab227975、ab184276、ab32410、ab317446、ab207082、111035003、115035003）均購于美國Jackson公司；鼠源GAPDH單克隆抗體（貨號REK0005）購于天津銳爾康生物科技有限公司；雷公藤多昔片（批號Z42021212，規(guī)格10mg 購于遠大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司；所有基因的引物由深圳華大基因科技有限公司合成。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級雄性SD大鼠，體重為180～220g ，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（遼）2020-0001。大鼠飼養(yǎng)在內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院動物實驗中心，自由進食進水；環(huán)境溫度為 24～26^°C ，濕度為 （55±5）% ，光照和黑暗 12h 交替。本實驗經(jīng)內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，批件號為NM-LL-2024-03-12-08。

2 方法

2.1 HSH的制備

取黑沙蒿 20kg ，用 95% 乙醇回流提取2次，每次6h，回收乙醇，得到乙醇提取物；利用硅膠色譜柱分離乙醇提取物，先用石油醚-乙酸乙酯溶液 脫脂后，再用甲醇洗脫，合并洗脫液，回收溶劑后得到HSH（得率為 0.2% [7]

2.2 分組、造模、給藥及取材

將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，選取60只大鼠，使用隨機數(shù)字表法分為6組，分別為正常組、模型組和HSH低、中、高劑量組 （2.7，10.8，21.6mg/kg^[8]） 以及陽性對照組（雷公藤多昔片， 6.3mg/kg ，劑量根據(jù)臨床等效劑量換算），每組10只。除正常組外，對其余各組大鼠腹腔注射戊巴比妥 （35mg/kg） 麻醉后，于大鼠左后足跖趾墊處一次性注射完全弗氏佐劑，每只 0.15mL^[9] ，以誘導(dǎo)RA大鼠模型。正常組大鼠在相同部位注射等體積生理鹽水。3d后觀察造模大鼠左后足踝關(guān)節(jié)紅腫情況，若明顯腫脹，提示造模成功[1]。各組大鼠灌胃相應(yīng)藥物或生理鹽水，每天1次，連續(xù) 28d 。

末次給藥 24h 后，通過腹腔注射戊巴比妥麻醉大鼠，收集其腹主動脈血，取部分腹主動脈血制備血清，置于 -80^°C 冰箱中保存?zhèn)溆谩Ａ砣「怪鲃用}血適量，置于肝素鋰抗凝管中，備用。取血完成后，處死各組大鼠，以2mL 磷酸鹽緩沖液（PBS）灌洗其踝關(guān)節(jié)，經(jīng)離心處理后即得關(guān)節(jié)液；剖取脾臟、踝關(guān)節(jié)組織保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度及關(guān)節(jié)炎指數(shù)檢測

在造模前及給藥后第1、7、14、21、28天，分別測定各組大鼠踝關(guān)節(jié)容積以計算踝關(guān)節(jié)腫脹度，同時采用5級評分法對大鼠左后足的關(guān)節(jié)炎程度進行主觀評分，記錄為關(guān)節(jié)炎指數(shù)[12]。

2.4大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)學(xué)觀察

取各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織適量，以 4% 多聚甲醛固定24h ，經(jīng)脫水包埋后切片；然后進行蘇木素-伊紅（HE）染色，經(jīng)中性樹膠封片后，采用顯微鏡觀察大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)學(xué)特征。

2.5大鼠血清和關(guān)節(jié)液中炎癥因子水平檢測

取各組大鼠血清和關(guān)節(jié)液樣品適量，按照試劑盒說明書方法處理，采用流式細胞微球陣列法檢測大鼠血清和關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-21、IL-17A、IL-2、IFN- γ 和IL-6水平。

2.6 大鼠全血及脾臟中Th1、Th17、Treg細胞水平檢測

取各組大鼠全血樣品，經(jīng)Ficoll分離液分離外周血單個核細胞，用無菌PBS洗滌2次，重懸細胞；加入LAC緩沖液培養(yǎng)4h，以激活淋巴細胞，待測。另取各組大鼠脾臟組織適量，置于細胞篩中研磨組織，得單細胞懸液，經(jīng)無菌PBS洗滌2次后，重懸細胞；加入LAC緩沖液培養(yǎng) 4h ，以激活淋巴細胞，待測。取上述兩種細胞樣品適量，分別加入不含EDTA的胰酶進行消化，然后用冷PBS沖洗細胞，加入抗體CD3、CD4、CD8a、CD25的混合物，于 4^°C 避光孵育 30min ；固定破膜后，加入細胞內(nèi)抗體IFN- ?γ IL-17A、Foxp3，室溫避光染色 30min ；采用流式細胞儀測定全血及脾臟組織中Th1、Th17、Treg細胞水平。

2.7大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜中LCK、Fyn、ZAP70、CD45、RORγt、Foxp3蛋白表達檢測

取各組大鼠踝關(guān)節(jié)的滑膜組織適量，經(jīng)裂解后提取總蛋白。將蛋白變性處理后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，以 5% 脫脂乳密封，在室溫下放置1h；加入LCK、Fyn、ZAP70、CD45、RORγt、Foxp3、GAPDH（稀釋度均為 1：3 000 ）孵育過夜；洗膜后，加入相應(yīng)二抗（稀釋度為1：5000）孵育2h;再次洗膜后，采用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，采用ImageJ軟件分析蛋白條帶，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值表示目的蛋白的表達水平。

2.8大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜中LCK、Fyn、ZAP70、CD45、RORγt、Foxp3mRNA表達檢測

采用TRIzol試劑提取各組大鼠踝關(guān)節(jié)的滑膜組織總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;以cDNA為模板進行PCR擴增。擴增條件為 95^°C 預(yù)變性 10min 95^°C 變性5s，60^°C 退火30s，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2^-ΔΔCt 方法計算各目的基因的表達水平。引物序列和擴增產(chǎn)物長度見表1。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPadPrism8.0.2軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以 表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey'sHSD檢驗。檢驗水準 α=0.05 。

3結(jié)果

3.1大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度及關(guān)節(jié)炎指數(shù)的檢測結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠給藥期間踝關(guān)節(jié)腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)均顯著增加/升高 ?Plt;0.05 ）。與模型組比較，除第7天的陽性對照組外，各給藥組大鼠從給藥第7天開始，踝關(guān)節(jié)腫脹度均顯著減小（ （Plt;0.05） ;HSH中、高劑量組大鼠從給藥第7天開始，關(guān)節(jié)炎指數(shù)均顯著降低 Plt;0.05 。結(jié)果見表2、表3。

3.2大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

正常組大鼠踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)正常，關(guān)節(jié)軟骨表面平滑整潔，軟骨細胞排列有序，滑膜組織結(jié)構(gòu)正常，未觀察到炎癥細胞浸潤和血管增生等病理變化。模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織明顯增生、排列紊亂并延伸至關(guān)節(jié)腔內(nèi)，出現(xiàn)大量炎癥細胞浸潤，且形成肉芽組織和血管翳。與模型組相比，各給藥組大鼠踝關(guān)節(jié)組織病變程度明顯改善，炎癥減輕。結(jié)果見圖1。

3.3大鼠血清和關(guān)節(jié)液中炎癥因子水平的檢測結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠血清和關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-21、IL-17A、IL-2、IFN- γ 、IL-6水平均顯著升高（ Plt; 0.05）；與模型組比較，陽性對照組和HSH低、中、高劑量組大鼠血清（HSH高劑量組IL-1β以及陽性對照組和HSH低劑量組IL-6除外）和關(guān)節(jié)液中上述指標(biāo)水平均顯著降低（ ?lt;0.05 ）。結(jié)果見表4、表5。

3.4大鼠全血及脾臟中Th1、Th17、Treg細胞水平檢測結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠全血和脾臟中Th1、Th17細胞水平及Th17/Treg值均顯著升高 （Plt;0.05 ，脾臟中Treg細胞水平顯著降低 （Plt;0.05） 。與模型組比較，各給藥組大鼠全血中Th1、Th17（陽性對照組除外）

細胞水平及Th17/Treg值均顯著降低 （Plt;0.05 ；陽性對照組和HSH高劑量組大鼠全血中Treg細胞水平均顯著升高 （Plt;0.05） ；各給藥組大鼠脾臟中上述細胞水平及Th17/Treg值大部分顯著逆轉(zhuǎn) （Plt;0.05 。結(jié)果見表6、表7。

3.5大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜中LCK、Fyn、ZAP70、CD45、RORyt、Foxp3蛋白表達檢測結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜中LCK、Fyn、ZAP70、CD45、RORγt蛋白表達水平均顯著升高，F(xiàn)oxp3蛋白表達水平顯著降低 （Plt;0.05） ；與模型組比較，各給藥組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜中上述蛋白表達水平大部分顯著逆轉(zhuǎn)（ ?Plt;0.05 ）。結(jié)果見圖2、表8。

表8HSH對大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜中LCK、Fyn、ZAP70、CD45、RORyt、Foxp3蛋白表達的影響 ））

3.6大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜中LCK、Fyn、ZAP70、CD45、RORγt、Foxp3mRNA表達檢測結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜中LCK、Fyn、ZAP70、CD45、RORytmRNA表達水平均顯著升高，F(xiàn)oxp3mRNA表達水平顯著降低（ Plt;0.05 ；與模型組比較，各給藥組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜中LCK、Fyn、ZAP70、CD45、RORytmRNA表達水平均顯著降低（ （Plt;0.05 ），陽性對照組和HSH低劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜中Foxp3mRNA表達水平均顯著升高（ （Plt;0.05 ）。結(jié)果見表9。

4討論

黑沙蒿是具有潛在開發(fā)前景的燥“協(xié)日烏素”蒙藥材，主要含苯丙素類、黃酮類及酚酸類成分，這些成分具有良好的抗炎和抗氧化作用，既能抑制IL-1β、IL-6和IL-17等促炎因子的表達，又能調(diào)節(jié)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠Th1/Th2淋巴細胞平衡和抑制氧化應(yīng)激[13-14]。

在RA發(fā)展初期，可見滑膜血管損傷，隨后T細胞（主要是 CD4⁺T 細胞）流人，并被抗原呈遞細胞進一步激活，產(chǎn)生IFN- ?γ 、IL-2、IL-17等炎癥因子[15]。Th17細胞是參與RA病情發(fā)展的重要免疫細胞[1，IL-17是由Th17細胞分泌的促炎細胞因子，該分泌過程有著復(fù)雜的免疫調(diào)控機制，T細胞受體信號通路在其中發(fā)揮了重要作用[]。本研究采用完全弗氏佐劑誘導(dǎo)RA大鼠模型，旨在基于T細胞受體信號通路中CD4/LCK/ZAP70/IL-17途徑探討HSH對RA的改善作用及潛在機制。

在RA的疾病發(fā)展過程中，炎癥反應(yīng)貫穿始終，因此抗炎是RA治療的關(guān)鍵。 CD4⁺T 細胞產(chǎn)生的Th1和Th17可分泌促炎因子，引起滑膜炎癥；而產(chǎn)生的Th2可分泌抗炎因子，Treg可分泌免疫抑制因子，從而緩解RA炎癥反應(yīng)[8]。研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)Th1/Th2、Th17/Treg平衡對改善RA具有重要意義[9]。本研究結(jié)果顯示，HSH可減輕RA大鼠的踝關(guān)節(jié)腫脹度，改善關(guān)節(jié)病理損傷，降低大鼠血清和關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-21、IL-17A、IL-2、IFN- ?γ 、IL-6水平，調(diào)節(jié)Th1、Th17和Treg細胞水平，降低 Th17/Treg值，提示HSH可能通過調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡，減輕RA大鼠的炎癥反應(yīng)。

T細胞受體信號通路功能失調(diào)與RA的發(fā)生與發(fā)展有密切關(guān)系[2]。Src激酶、Syk激酶和磷酸酶是T細胞受體信號通路被激活和傳導(dǎo)的關(guān)鍵酶，其中Src家族酪氨酸蛋白激酶Fyn、LCK可磷酸化細胞內(nèi)免疫受體酪氨酸激活基序（immune receptor tyrosine-based activation mo-tif，ITAM），而磷酸化的ITAM可招募細胞質(zhì)內(nèi)ZAP70聚集，被聚集的ZAP70 則再次被LCK磷酸化和激活[2]。另外，跨膜酪氨酸磷酸酶CD45可解除Src分子的抑制作用，被激活的ZAP70可引起跨膜的T細胞活化連接蛋白（linkerforactivationofTcells，LAT）發(fā)生磷酸化，從而調(diào)節(jié)下游信號活化T細胞，形成級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細胞增殖和免疫調(diào)節(jié)紊亂[22]。RORγt是Th17細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)oxp3是Treg細胞的特異性標(biāo)記[23]。本研究結(jié)果顯示，HSH可降低大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜中LCK、Fyn、ZAP70、CD45、RORyt蛋白和mRNA表達水平，上調(diào)Foxp3蛋白和mRNA表達水平，提示HSH可通過調(diào)節(jié)T細胞的功能和分化，發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，HSH可通過調(diào)節(jié)T細胞受體信號通路中CD4/LCK/ZAP70/IL-17途徑的級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡，從而抑制RA大鼠的炎癥反應(yīng)，減輕滑膜組織損傷。

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（收稿日期：2025-01-14 修回日期：2025-06-01）