本氏煙tsRNAs對馬鈴薯Y病毒侵染的響應

中圖分類號：S435.72 文獻標識碼：A文章編號：1007-5119（2025）03-0070-11

Altered Expression of Transfer-RNA-derived small RNAs after Potato Virus Y Infection in Nicotiana benthamiana

GAO Xinwen， SONG Hongping， WANG Hui， MIAO Pu³ ， JIAO Yubing1， SHEN Lili'， WANG Yujie3*， YANG Jinguang1 （1.Institute ofTobaccoResearchofChinese Academyof Agricultural Sciences，Qingdao 266101，China; 2.YangtzeUniversity Jingzhou434025，Hubei，China; 3.Luoyang CityCompanyofHenan TobaccoCompany，Luoyang 471oo，HenanChina）

Abstract： To explore the molecular mechanismsunderlyingNicotiana benthamiana responses topotato virus Y（PVY）infection， smallRNA sequencing （sRNA-seq）andtranscriptomesequencing （RNA-seq）were employed toanalyze thediferences intsRNAs andtranscriptionalesponsesinN.benthmianafollowingPVYinfection.Teresultsshowedthat39iferentillyexpressdtNAs （tRNAhalves）and119tRFs（tRNA-relatedfragments）wereidentifiedatthe7thdaypost-inoculation.Enrichmentanalysisof diferentiallexpresedtargetgenes （DETGs）demonstratedtat117and60target genesoftFsinleavesandstems，espectively were predominantlyenrichedinpathwayssuchassignaltransductionandenergymetabolism.Notably，theexpresionoft-1：18- His-GTG-1-M3was mostsignificantlydown-regulated iPVY-infectdleaves.SuppressgtheexpresionoftDR-1：18-Hs-G-1- M3 in N. benthamiana markedly increasingthe expresion levels of its target genes，yabDand RNF170.These findings provide a reference forfurtherin-depthresearchontheroleoftsRNAsinPVY-host plant interactionsandthedevelopmentofPVYcontrol strategies.

Keywords： Nicotiana benthamiana; potato virus Y; small RNA sequencing; transcriptome sequencing

馬鈴薯Y病毒（potatovirusY，PVY）作為一種單鏈RNA病毒，具有分布廣[]、進化快、種群規模龐大以及高度宿主依賴性等特點，在生產上尚無靶向藥劑。相關研究表明，通過特定的小非編碼RNAs（sncRNAs），包括微小RNA（miRNAs）、小干擾RNA（siRNAs）、tsRNAs、小核RNA（snRNAs）、小胞質RNA（scRNAs）以及皮小RNA（piRNAs）等，能夠對植物抗病毒免疫能力進行有效調節，其中，針對miRNAs和siRNAs的研究最為深人[2]。利用人工miRNA（amiRNA）技術可以有效增強植物對病毒的抗性，例如，以miR159、miR167b和miR171為基礎設計靶向序列，賦予煙草對PVY和馬鈴薯X 病毒（potato virusX，PVX）的抗性[3]；miR482/2118可以調控番茄的天然免疫機制，有助于植株形成針對病原體攻擊的新型防御層[4]。此外，人工設計的siR099序列可靶向熱休克蛋白70（HSP70），增強本氏煙的抗病毒免疫[5]。然而，另一方面，部分病毒利用siRNAs和miRNAs促進自身的侵染，例如，番茄叢矮病毒（tomato bushy stuntvirus，TBSV）的沉默抑制因子P19通過與siRNA結合，增強TBSV對本氏煙的侵染[；黃瓜花葉病毒（cucumbermosaicvirus，CMV的2b蛋白可以與AGO1蛋白互作并影響內源miRNA途徑，抑制依賴于宿主RDR6/SGS3的次級siRNA的產生，最終減弱宿主的抗病毒RNA沉默反應，為病毒自身的侵染和復制創造有利條件[7]。

tsRNAs是一類新型的小非編碼RNA，包括tRFs（tRNA-related fragments）和 tiRNAs（ tRNAhalves）兩種類型，在基因轉錄和轉錄后水平上都發揮著重要的調控作用。已有研究表明，在生物或非生物脅迫下，植物中部分特異性tsRNAs的表達會出現顯著變化。例如，在擬南芥中，干旱和氧化應激可導致 S^′–tRF^ArgCCT 顯著上調[8]，鹽脅迫誘導產生的 5^′-tRF^GlyGCC 在紫外光處理下表達量也會增加[9]。此外，tsRNAs還能對病毒和真菌的侵染做出響應。例如，呼吸道合胞病毒（respiratory syncy-tial virus，RSV）[10-12]和蘋果莖溝病毒（apple stemgroovingvirus，ASGV）[13]侵染時，tsRNAs表達量會發生改變。 5^′-tRF^Ala 在真菌侵染時，能夠響應并調控CYP71A13基因轉錄水平[14-15]。在調控機制方面，tRFs與miRNAs類似，可在RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complexes， RISC）中形成效應元件[16-17]，調控基因轉錄水平；而tiRNAs則主要作為生物標志物發揮作用，在疾病診斷[18]及治療檢測[19中具有重要應用價值。

盡管tsRNAs在諸多生物過程中發揮著關鍵作用，但目前尚未發現tsRNAs響應PVY侵染的相關報道。因此，參考已有研究手段，本研究對PVY侵染本氏煙的tsRNAs表達譜進行分析，并對tRFs進行靶基因預測；隨后比較分析預測靶基因表達量變化，并對部分靶基因進行初步驗證。研究結果將為進一步闡明PVY侵染機制及其調控網絡提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

冷凍離心機（10020，德國Sigma公司）、掌上離心機（S1010，賽洛捷克公司）、實時熒光定量PCR儀（7500-Fast，美國ThermoFisher公司）、紫外分光光度計（NanoDrop2000，美國ThermoFisher公司）、PCR儀（Bio-rad，MyCycler公司）。

試劑：總RNA的提取試劑TRIzol、cDNA合成試劑盒購自諾唯贊公司。tsRNAs提取試劑盒以及tsRNAscDNA合成試劑盒購自美國Arraystar公司。熒光定量引物及tDR-1：18-His-GTG-1-M3抑制劑以及抑制劑對照組由上海生工生物有限公司合成。1× PBS（ pH=7.4 ， 0.01mol/L 購自德國Sigma公司。

1.2供試植物、病毒培養

馬鈴薯Y病毒接種至三生煙擴繁。本氏煙（Nicotianabenthamiana）植株在人工氣候室中培養，光照 16h/d ，溫度為 25°C ，相對濕度約為 80% 光合有效輻射為 100μmol/（m²?s）_? 。PVY毒源與本氏煙均保存于本實驗室，栽培基質購自壽光沃德公司。

1.3 試驗時間、地點與方法

1.3.1試驗時間、地點試驗于2023年6月在病毒實驗室進行。1.3.2病毒接種當本氏煙長至5＼～6片葉時，采用摩擦接種法接種PVY，接種至本氏煙兩片最大展開葉上。1.3.3樣品采集及RNA提取對接種PVY7d的本氏煙（PVY，處理組）以及未接種PVY的本氏煙（NC，對照組）進行取樣，取頂部兩片系統葉片及系統葉片所連接的莖。本試驗包括12個樣品（PVY_Leaf_1、PVY_Leaf_2、PVY_Leaf_3以及NC_Leaf_1、NC_Leaf_2、NC_Leaf_3;PVY_Stem_1、PVY_Stem_2、PVY_Stem_3以及NC_Stem_1、NC_Stem_2、NC_Stem_3）。每個樣品6株本氏煙，3個重復。分別對以上樣品進行總RNA的提取，提取到的RNA用于SmallRNA及RNA測序。

1.3.4SmallRNA、RNA測序及生物信息學分析對

1.3.3提取的12個RNA樣本進行sRNA及mRNA建庫。cDNA文庫的構建方法由上海歐易生物醫學科技有限公司提供。質量控制sRNA測序讀數步驟如圖1。首先，使用cutadapt[20]對接頭序列進行去除，并過濾掉小于 15bp 、大于 35bp 的序列。使用fastx_toolkit （version 0.0.13）[21]軟件，對序列進行Q20質量控制（PhredQuality Score20），保留Phred質量分數 20（Q20）?80% 的序列。隨后使用NGSQCToolkit （version2.3.2）[22]過濾掉含有N堿基的讀數。最終得到高質量的可用于后續分析的cleanreads。對cleanreads的長度分布進行統計，以初步評估樣本的小RNA分布情況。根據本氏煙基因組中的tRNAs序列，將cleanreads與tRNAs序列進行比對（基于0堿基錯配的原則），從tRNAs的5端或3端精確匹配讀數，并根據長度預測tiRNAs和tRFs的分類。統計與本氏煙基因組中tRNAs序列精確匹配的cleanreads百分比。接下來使用RepeatMasker[23]軟件，將過濾后的序列同repeat數據庫進行比對，鑒定可能的重復序列。針對鑒定出的重復序列進行過濾去除。分析tiRNAs和tRFs的表達情況。根據已確定的tiRNAs和tRFs 的表達量統計數據，使用transcript permillion（TPM）評估tiRNAs和tRFs的表達量。分析tiRNAs和tRFs之間的差異。對于有生物重復的配對樣本，使用R軟件中的DESeq2軟件包[24進行差異tiRNAs和tRFs篩選。

1.3.5RNA樣品前處理、cDNA合成及實時熒光定量PCR（qRT-PCR）從總RNA中提取tsRNAs，并將其反轉成cDNA用于接下來的tsRNAs實時熒光定量PCR，U6作為內參基因。mRNAs實時熒光定量PCR無需對總RNA進行前處理， β -Actin作為內參基因。qRT-PCR引物見表1。qRT-PCR反應條件： 95^°C ， 10min ；40個PCR循環 [95^°C 10s ； 60°C ， 60s （收集熒光）]。擴增反應結束后，進行PCR產物的熔解曲線分析，反應程序為： 95^°C 10s ， 60°60s ， 95°15s ，其中降溫速度為2.2^°C/s ，升溫速度為 0.15^°C/s 。

1.3.6tRFs靶基因預測及生物信息學分析對于差異表達的tRFs使用targetfinder軟件[25]進行靶基因預測。此外，使用基于超幾何分布的R軟件對篩選后的tRFs預測靶基因進行GO和KEGG通路富集分析 值小于0.05為顯著）。

1.3.7瞬時浸潤tDR-1：18-His-GTG-1-M3抑制劑tDR-1：18-His-GTG-1-M3抑制劑通過合成與其序列反向互補的RNA鏈實現競爭性結合，從而有效干擾目標RNA，抑制tDR-1：18-His-GTG-1-M3的表達水平和功能。為提高抑制劑在植物體內的穩定性，對合成的RNA進行了甲氧修飾，以防止快速降解。此外，采用 1×PBS 作為浸潤劑，以確保抑制劑順利滲透植物組織。使用 100nmol/L tDR-1：18-His-GTG-1-M3抑制劑對本氏煙葉片進行瞬時浸潤，以便評估其對目標基因表達的影響。

1.3.8數據處理與分析試驗數據采用MicrosoftofficeExcel2016、GraphPadPrism8.0.1、R語言4.3.1進行處理，基因及tsRNAs相對表達量的組間差異分析采用 t 檢驗。

2結果

2.1PVY侵染后本氏煙葉片和莖中的tsRNAs表達譜

各樣本cleanreads比對率 ≥86.68% ，測序數據質量較高（表2），讀數計數主要分布在 21～24nt 長度范圍內，其中長度為24nt時的讀數數量最高（圖2A）。對tsRNAs進行鑒定及分類，在本氏煙的葉片和莖中， 5^′ -tRFs的比例最高 43.26% ，接下來依次是 、 5^′ -tiRNAs（ 17.61% 0和 3^′. -tiRNAs（ 5.55% （圖2B）。對PVY處理前后本氏煙中的tsRNAs表達量進行對比分析發現，PVY侵染導致39個tiRNAs和119個tRFs的表達量發生了顯著變化，其中有2個tiRNAs、6個tRFs在本氏煙葉片和莖中均發生顯著差異表達（圖2C）。在本氏煙葉片中，76個tsRNAs的表達量發生了顯著變化，其中29個tRFs上調，24個下調；15個tiRNAs上調，8個下調。在莖中90個tsRNAs的表達量發生了顯著變化，有37個tRFs上調、35個下調，6個tiRNAs上調、12個tiRNAs下調（圖2D）。對tsRNAs類型進行了統計，結果顯示（圖3），在本氏煙的葉片和莖中，源自 tRNAMet_CAT的tsRNAs數量最多。

2.2 tsRNAs的差異表達分析

分別從葉片和莖中選取差異顯著并且重復性較好的17、18個tsRNAs進行非監督層次聚類分析，PVY處理前后本氏煙葉片、莖tsRNAs表達量存在明顯的分群現象。在PVY處理后葉片中差異表達的17個tsRNAs中，7個下調tsRNAs為一類，10個上調為一類（圖4A）。在PVY處理后莖中的18個tsRNAs中，11個下調為一類，7個上調為一類（圖4B）。為進一步驗證sRNA-seq結果的準確性，從葉片和莖中各選取5個顯著差異表達的tsRNAs進行qRT-PCR檢測（圖4C），葉片中的5個tsRNAs在PVY侵染后的差異表達情況與sRNA-seq結果一致，tDR-1：18-His-GTG-1-M3、tDR-1：20-Arg-TCG-1-M2、tDR-1：25-Cys-GCA-3-M2顯著下調，tDR-1：26-Glu-TTC-5、tDR-1：23-Tyr-GTA-1-M10顯著上調。莖中有3個tsRNAs在PVY侵染后的差異表達情況與sRNA測序結果一致，tDR-59：73-Phe-GAA-1-M2、tDR-1：20-Arg-CCG-2表達量顯著下調，tDR-1：32-Glu-TTC-5表達量顯著上調。因此，該測序結果具有一定的可靠性，可用于后續的研究。值得注意的是，tDR-1：18-His-GTG-1-M3是一種未被表征的 5^′"-tRF，其表達量在PVY侵染后下調最顯著 （109₂FC=-7.28）

注：A，sRNA的長度分布；B，tsRNAs的類型分布；C，PVY侵染后本氏煙葉片和莖中差異表達的tsRNAs數量；D，PVY侵染后本氏煙葉片和莖中差異表達的tsRNAs表達量上下調情況。

Note：Aeg bentis of Nicotiana benthamiana after PVY infection.

Fig.2tsRNAs expression profile in PVY-infected Nicotiana benthamiana leaves and stems

Fig. 4Differential expresson levels of tsRNAs in Nicotiana benthamiana after PVY infection

2.3PVY侵染后本氏煙的mRNAs表達譜

RNA-seq結果顯示，每個RNA文庫大約有5000萬個cleanreads， 85.29% 的cleanreads可以映射到本氏煙基因組上，其中，38657個編碼蛋白質的基因至少在一個樣本中表達。為了確定候選的免疫相關基因，對PVY侵染和未侵染的本氏煙進行了RNA-seq比較分析。結果發現，PVY侵染后，在 plt;0.05 且 |og₂FC|gt;1 條件下，本氏煙葉片中有1496個差異表達基因（DEGs，differential expressedgenes），包括883個上調DEGs和613個下調DEGs（圖5A）。莖中有3427個DEGs，包括1454個上調DEGs和1973個下調DEGs（圖5B）。進一步利用基因組百科全書（KEGG，KyotoEncycgan-ranlopediaofGenesandGenomes）對DEGs進行通路富集分析，結果顯示，本氏煙葉片中在信號轉導通路富集到的DEGs最多，有83個；其次是碳水化合物代謝通路（51個）（表3）。莖中在能量代謝通路中富集到的DEGs最多，有175個；其次是碳水化合物代謝通路（170個）（表3）。

注：A、B熱圖分別顯示PVY侵染后本氏煙葉片和莖中顯著差異表達的mRNAs（ plt;0.05 ，紅色和藍色分別表示高表達和低表達，顏色越深，代表該mRNA在PVY侵染前后的相對表達量變化越顯著。下同。

Note：A，aasoatlielpdsisfoeeio （plt;0.05） ; red and blueepsentdsilaiep mRNA beforeand after PVY infection.The sameas below.

Fig.5DiferentialexpresionprofilesofmRNAsintheleaves （A）andstems （B）ofNicotiana benthamianaafterPVYinfection

2.4tRFs靶基因預測與RNA-seq聯合分析

為了更好地解析PVY侵染本氏煙后tRFs發揮的調控作用，對其進行靶基因預測與RNA-seq聯合分析。在PVY侵染的本氏煙葉片中共鑒定出53個差異表達的tRFs，預測得到2635個靶基因。在莖中共鑒定出72個差異表達的tRFs，預測得到6315個靶基因。進一步將預測靶基因結果與DEGs結果取交集，得到差異表達靶基因（DETGs，Differen-tiallyExpressedTargetGenes）集合，結果顯示，莖和葉片中分別有602、117個DETGs。為進一步驗證RNA-seq結果的準確性，選擇了8個DETGs進行qRT-PCR分析。結果表明，PVY侵染后的本氏煙葉片中，yabD（Niben101Scf01413g00003， plt;0.01 ）、RNF170（Niben101Scf03827g01009， plt;0.0001 表達量顯著下調；XTH23（Niben101Ctg13782g00003，plt;0.0001 ）、TOR1L2（Niben101Scf10157g01024， plt;0.05）、BnaC07g23050D（Niben101Scf00577g07003，plt;0.01 ）表達量顯著上調（圖6A）。其中，yabD、RNF170、XTH23和TOR1L2的qRT-PCR檢測結果與RNA-seq結果保持一致（圖6C），認為該測序結果具有一定的可靠性，可用于后續的研究。由圖6B可見，RNA-seq測序結果與qRT-PCR結果。

注：A，qRT-PCR檢測葉片中8個基因mRNAs的相對表達量；B，實時熒光定量PCR結果與轉錄組測序結果相關性分析；C，RNA-seq 檢測PVY侵染后本氏煙葉中8個基因mRNAs的表達情況 （plt;0.05）。相關性極顯著 （plt;0.0001） 。

Note：Aeliee expression levels of 8 gene mRNAs in Nicotiana benthamiana leavesafter PVY infection detected by RNA-seq （plt;0.05）

進一步對DETGs進行GO富集分析，并篩選出3個分類中的前三個通路。結果顯示，在本氏煙葉片中，生物學過程中明顯富集的類別依次為氧化還原反應、轉錄調控-DNA模板和代謝過程；細胞組分方面富集的類別依次為細胞核、膜和膜的組成成分；分子功能方面富集的類別依次為DNA結合、蛋白質結合和ATP結合（圖7A）。在本氏煙莖中，生物學過程中富集的類別依次為氧化還原反應、轉錄調控-DNA模板和蛋白質磷酸化；細胞組分富集的類別依次為膜、細胞核和膜的組成成分；在分子功能方面，依次為蛋白質結合、ATP結合和DNA結合（圖7B）。

2.5tDR-1：18-His-GTG-1-M3抑制表達對預測靶基因表達量的影響

sRNA-seq測序結果顯示，tDR-1：18-His-GTG-1-M3在PVY侵染后的本氏煙葉片中顯著下調（圖4A），tDR-1：18-His-GTG-1-M3是一個長度為17nt未被表征的 5^′ -tRF，可以和tRNA（Niben101Scf01866t02014.1）實現0堿基錯配（圖8A）。瞬時浸潤抑制劑能夠極顯著降低tDR-1：18-His-GTG-1-M3在本氏煙葉片中的表達量（圖8B）。qRT-PCR檢測tDR-1：18-His-GTG-1-M3預測靶基因yabD、RNF-170、Eif2s3y的表達量（圖8C），結果顯示yabD和RNF170表達量顯著上調，表明抑制tDR-1：18-His-GTG-1-M3的表達量可以顯著提高yabD和RNF170的表達水平。

注：A，tDR-1：18-His-GTG-1-M3模型圖；B，tDR-1：18-His-GTG-1-M3抑制效率；C，tDR-1：18-His-GTG-1-M3預測靶基因表達水平。 Note：Ad tDR-1：18-His-GTG-1-M3.

3討論

植物病毒具有宿主特異，傳播途徑廣泛，以及潛伏期癥狀不顯著或無癥狀等特點，防治困難[1]，目前生產上尚無有效化學藥劑，主要依賴于植物自身的免疫反應。植物與病原微生物在長期博弈過程中不斷協同進化，通過提高植物免疫相關基因的表達抑制病毒對其宿主基因的調控，成為防治植物病毒病的有效措施之一。此前，基于RNA干擾（RNAi）原理，miRNAs和siRNAs通過降解靶標基因的mRNAs并在轉錄后水平抑制基因表達，一直以來備受關注[26]。然而，越來越多的研究表明，tsRNAs同樣具備調控基因表達的潛力[27-29]。本研究表明，PVY侵染后，本氏煙葉片和莖中的tsRNAs顯著差異表達。其中tDR-1：18-His-GTG-1-M3在本氏煙葉片中下調最為顯著。靶基因預測結果顯示，tDR-1：18-His-GTG-1-M3可以調控環指蛋白170基因（RNF170，Ringfingerprotein170）和yabD基因。RNF170作為一種與TLR3結合的E3連接酶，通過促進TLR3降解來選擇性地抑制TLR3觸發的先天性免疫反應[30-31]，是研究植物抗病性的潛在重要靶標之一。

植物免疫負調控因子主要通過負向調控機制抑制免疫反應，已有研究證實，敲除免疫負調控因子可以有效提高宿主抗病性，如BdWRKY19負調控活性氧（ROS）的產生，OsRFPH2-6負調控水稻對稻瘟病的抗性，利用CRISPR/Cas9基因技術編輯以上基因可以顯著提高植株抗病性[32-33]。但是，CRISPR/Cas9基因技術操作流程相對復雜且周期較長。后續，本研究將創制納米載體包裹遞送tsRNAs至植株體內，調控植物免疫負調控因子的表達水平，提高植物抗病性。同時，目前的研究認為tiRNAs主要作為一種生物標志物發揮作用。例如，tiRNAs應用于檢測米諾環素大鼠神經元PC12細胞缺血再灌注損傷的治療效果[19]。本研究后續還將進一步篩選PVY侵染后差異表達顯著的tiRNAs標志物，并用于評估tsRNAs納米遞送的干預效果。

4結論

本研究系統揭示了PVY侵染本氏煙后tsRNAs的動態調控網絡及分子機制。整合sRNA-seq與RNA-seq多組學分析發現，PVY侵染7d后，本氏煙葉片和莖中分別檢測到39種tiRNAs、119種tRFs顯著差異表達。sRNA-seq特征顯示24nttsRNAs為優勢tsRNAs類型。其中， 5^′. -tRFs占差異tsRNAs總量的 43.26% 。關鍵差異表達分子tDR-1：18-His-GTG-1-M3在葉片中顯著下調，并通過靶向調控yabD和RNF170基因表達參與宿主轉錄調控。進一步通路分析表明，PVY侵染可激活植物信號轉導、能量代謝及碳水化合物代謝等核心通路，闡明了植物響應病毒入侵的多維度系統調控機制。

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