與煙草抗黑脛病Ph基因緊密連鎖的SNP標(biāo)記開發(fā)

中圖分類號(hào)：S572.03 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-5119（2025）03-0020-09

Development of SNP Markers Tightly Linked to the Ph Gene Conferring Resistance to Tobacco Black Shank Disease

FENG Huixin12， CHEN Meng1， LIU Xijin3， WANG Dahai4， WU Feng3，DING Pengbo， TANG Lizhong6， XU Zhantao12， WANG Yuhua4，WU Xinru1*， ZONG Hao3* （1. Institute ofTobacco Research， Chinese Academy of Agricultural Sciences，Qingdao 266101，China; 2.Graduate Schoolof

ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijingo81，China;3.LinyobaccoCompanyofSandongrovince，Liy00，

Shandong，China; 4.WeifangTobaccoCompanyofShandongProvince，Weifang2612o5，Shandong，China;5.QingdaoTobacco Company of Shandong Province， Qingdao 266071， China; 6. Yongzhou Branch of Hunan Tobacco Company， Yongzhou 425900，Hunan，China）

Abstract： Originated from the wild tobacco Nicotiana plumbaginifolia， the Ph gene is a high-quality resistance source to black shank in tobacco breding.Inorder todevelo SNP markers linkedtothis geneto meet te demandofcurrent molecularbreeding， thisstudy used black shank-resistant flue-cured tobacco variety Coker371-Gold with the Ph gene and a susceptible variety Zhongyantexiang 301 without the Ph gene as materials. Using tobacco SSR markers and SNP variations of 33 cultivated tobacco germplasmresourcesbasedonwhole genome resequencing，the molecularcharacteriticsof thechromosomal fragmentof N. plumbaginifolia carrying the Ph gene was described.By constructing a backcross population segregating for black shank resistance， an integrated genetic map of 8 known molecular markers linked to the Ph gene was drawn， and on the basis，more closely linked SNP markers to the Ph genewere developed.The resultsshowed as the follows.（1） The N.plumbaginifolia chromosomal fragment carrying the Ph gene was probably transferred into cultivated tobacco intheform of terminal translocation，and hada good homology relationshipwiththereplacedcultivated tobaccochromosomal fragment，and its translocationsitewas located near 18.54Mb of Yunyan87HIC_ASM_14 chromosome; （2） Ph gene was located at the end of the translocation fragment，which probably being close to thetranslocationsite，andonecloselylinkedspecificSNPmarker wasobtainedoneachsideofthegee.Theseresultsprovideda

theoretical basisforfurthercreatingamorevaluableintercalarytranslocationline withsmallfagment，therebyprovidingtechical support for better utilization of this black shank disease resistance source in the future.

Keywords： tobacco; black shank; Ph gene; translocation; single nucleotide polymorphism

煙草黑脛病是由煙草疫霉Phytophthora par-asiticavar.nicotianae引起的土傳性真菌病害，是煙草生產(chǎn)上最具毀滅性的病害之一。該病自一個(gè)多世紀(jì)前被發(fā)現(xiàn)以來，迅速流行于世界各主要產(chǎn)煙國，每年造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。黑脛病可發(fā)生于煙草整個(gè)生育期，主要為害大田生長階段的煙株，以莖基部發(fā)病為主，可為害髓部、葉片，最終導(dǎo)致全株凋萎、枯死[2]。煙草黑脛病的發(fā)生與流行受多種因素影響，高溫高濕、排水不暢、連作等均可加重該病的危害程度。因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中可通過與禾本科等非寄主作物合理輪作、推廣深耕高起壟移栽、加強(qiáng)排水和及時(shí)清理病株等栽培耕作措施，以及選用合適的殺菌劑、拮抗菌及誘抗劑來降低危害[3-5]。從可持續(xù)發(fā)展的角度考慮，培育抗病品種是防治黑脛病最經(jīng)濟(jì)、有效和環(huán)保的措施，而其中的關(guān)鍵是尋找合適的抗源。經(jīng)過幾十年的搜集、創(chuàng)制與試驗(yàn)，煙草積累了豐富的黑脛病抗源，這些抗源主要來自：（1）煙草屬近緣種，如來源于野生煙草Nicotianaplumbaginifolia和N.longiflora的垂直抗性基因Php和 Phl^[6-7] ，及來源于N.rustica的 Wz 基因[8]；（2）栽培煙草種質(zhì)資源，如來源于雪茄煙Florida301和Beinhart1000-1的水平抗性微效多基因，即數(shù)量性狀位點(diǎn)（quantitative trait loci， QTLs）[9-10]。此外，從煙草地方種質(zhì)資源中也鑒定了一批抗源[11]；（3）栽培煙草人工誘變突變體，如劉曉俠等[12]采用輻射誘變的方法獲得了高抗黑脛病的紅花大金元突變體。

育種過程中，科研人員更偏好使用抗感分離明顯的垂直抗性基因。黑脛病目前有4個(gè)生理小種，分別是0、1、2和3號(hào)，其中0號(hào)和1號(hào)小種是包括我國在內(nèi)的絕大多數(shù)產(chǎn)煙國的流行小種，以0號(hào)為優(yōu)勢小種。鑒于此，來源于野生煙草N.plumbag-inifolia的抗黑脛病0號(hào)生理小種的 Ph 基因獲得了較多的關(guān)注。以攜帶 Ph 基因的烤煙品種Coker371-Gold為抗源，國內(nèi)外先后開發(fā)了一系列與 Ph 基因連鎖的分子標(biāo)記[13-15]，并成功應(yīng)用于烤煙品種紅花大金元和 YNR3 的黑脛病抗性定向改良[16-17]。目前已開發(fā)的與 Ph 基因連鎖的分子標(biāo)記尚存在諸多不足：（1）Bao 等[15]于2019年開發(fā)的標(biāo)記中，絕大多數(shù)標(biāo)記為相斥相標(biāo)記（僅感病親本有條帶的顯性標(biāo)記），較難用于回交分子育種，或多態(tài)性范圍較小，無法廣泛用于其他品種，僅BS-SCAR1實(shí)際使用效果較好，但該標(biāo)記并不與 Ph 基因共分離，單一使用該標(biāo)記存在誤判的可能；（2）目前已有的共顯性標(biāo)記全部為 SSR（simple sequence repeat）標(biāo)記[18-20]，不能滿足分子育種對(duì)基因型檢測低成本、高通量、自動(dòng)化的需求，正日漸被新一代SNP（single nucleotidepolymorphism）標(biāo)記取代。

基于上述研究現(xiàn)狀，本研究利用煙草SSR標(biāo)記和基于全基因組重測序的SNP變異數(shù)據(jù)，對(duì)攜帶 Ph 基因的 N. plumbaginifolia染色體片段的分子特征進(jìn)行系統(tǒng)、全面的描述，并構(gòu)建遺傳分離群體，對(duì)現(xiàn)有與 Ph 基因連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行整合。在此基礎(chǔ)上，開發(fā)與 Ph 基因連鎖更為緊密的SNP標(biāo)記，為今后更好地利用這一黑脛病抗源提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究使用的試驗(yàn)材料由本課題組保存，包括攜帶 Ph 基因的抗黑脛病烤煙品種Coker371-Gold、不攜帶 Ph 基因的感黑脛病烤煙品種中煙特香301、二者雜交后產(chǎn)生的 F₁ ，以及 F₁ 再與中煙特香301回交產(chǎn)生的 BC₁F₁ 分離群體。包含Coker371-Gold和中煙特香301在內(nèi)，用于全基因組重測序和SNP變異分析的33份栽培煙草種質(zhì)資源相關(guān)信息詳見本課題組之前發(fā)表的研究論文[21]。

1.2基因組DNA提取、PCR和產(chǎn)物檢測

煙葉樣品經(jīng)液氮冷凍并研磨后，使用新型植物基因組DNA提取試劑盒（CW0531，江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司）提取基因組DNA，并去除RNA污染，經(jīng)NanoDrop2000微量分光光度計(jì)（ThermoFisherScientific）測定濃度后，稀釋至60～100μg/μL 作為PCR模板。PCR于VeritiTM96孔熱循環(huán)儀（4375305，ThermoFisherScientific）上進(jìn)行。總反應(yīng)體系為：基因組DNA模板 1μL ，上下游引物 10μmol/L） 各 1μL ， 2× Taq Master Mix（P111，南京諾唯贊生物科技股份有限公司） 7.5μL ddH₂O4.5μL ，總計(jì) 15μL 。SSR-PCR產(chǎn)物經(jīng) 6% 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離和銀染顯色后直接觀察[22]；其他PCR產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳分離和溴化乙錠（EtBr）染色后，于紫外燈下觀察。

1.3SSR分析、PCR產(chǎn)物的分離、測序與物理位置確定

依據(jù)Bindler等[23]公布的煙草高密度SSR遺傳連鎖圖譜，參照Bao等[15]對(duì) Ph 基因的定位結(jié)果，選取定位區(qū)間內(nèi)及其側(cè)翼區(qū)段的SSR標(biāo)記，在Coker371-Gold和中煙特香301之間進(jìn)行多態(tài)性篩選。參照章蕾等[24]的方法從聚丙烯酰胺凝膠上分離SSR-PCR產(chǎn)物的目標(biāo)DNA條帶，用移液吸頭搗碎后，加適量 煮沸 15min ，以12000r/min 離心 5min 后獲得的上清液作為模板，利用原SSR引物進(jìn)行二次PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測后進(jìn)行常規(guī)測序，然后與云煙87和NtaSR1基因組比對(duì)，獲得SSR在基因組中的精確物理位置。

1.4 SNP變異分析

參照田震等[21]的方法，對(duì)包含烤煙、香料煙、白肋煙和曬煙等類型的33份栽培煙草種質(zhì)資源進(jìn)行SNP變異分析。

1.5煙草黑脛病接種、病情調(diào)查與抗性鑒定

參照GB/T23224—2008[25]和郭璇等[26]的方法，活化、擴(kuò)繁和接種黑脛病病原菌。黑脛病0號(hào)生理小種接種于燕麥培養(yǎng)基上進(jìn)行活化后，接入菌谷培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)繁。待煙苗長至5＼～6片真葉時(shí)，用刀輕輕劃傷莖基部及根部，接種定量攪拌均勻的菌谷，并覆土保濕。參照GB/T23222—2008[27]鑒定各試驗(yàn)材料的黑脛病抗性。接種后每隔3天，對(duì)各單株的發(fā)病情況進(jìn)行跟蹤調(diào)查，并根據(jù)病害嚴(yán)重度進(jìn)行分級(jí)，直至病情不再發(fā)展。病情調(diào)查全部結(jié)束后，將0＼～1級(jí)判定為抗病，7＼～9級(jí)判定為感病。

1.6遺傳連鎖圖譜繪制

使用QTLIciMapping4.2計(jì)算遺傳距離和繪制遺傳連鎖圖譜[28]，LOD值設(shè)為3.0，遺傳距離以厘摩（cM）表示。

1.7特異SNP標(biāo)記開發(fā)及PCR驗(yàn)證

使用TBtools軟件[29]從烤煙栽培品種云煙87基因組中（由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院完成測序、組裝與注釋，未公開）提取目標(biāo)SNP位點(diǎn)及其上下游各 500bp 序列，與新公布的栽培煙草NtaSR1基因組[30比對(duì)，獲得各位點(diǎn)在NtaSR1基因組中的位置信息以及序列特異性；選取特異性較好的序列，用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行常規(guī)測序，以驗(yàn)證SNP變異是否真實(shí)存在。

2結(jié)果

2.1攜帶 Ph 基因的 N. plumbaginifolia染色體片段的分子標(biāo)記分析

2.1.1SSR分析為更全面揭示攜帶 Ph 基因的 N. plumbaginifolia染色體片段的分子特征，以便為后續(xù)的基因定位和標(biāo)記開發(fā)奠定基礎(chǔ)，參照Bao等[15]對(duì) Ph 基因的定位結(jié)果，依據(jù)Bindler等[23]公布的煙草SSR高密度連鎖圖譜，選取第20連鎖群（Linkagegroup20，LG20）自端部至 70cM 區(qū)間內(nèi)均勻分布的SSR標(biāo)記22個(gè)，對(duì)中煙特香301和Coker371-Gold進(jìn)行了分析，共獲得19個(gè)穩(wěn)定擴(kuò)增、條帶清晰的SSR標(biāo)記。多態(tài)性分析顯示，自端部至 27.816cM 的9個(gè)SSR標(biāo)記在中煙特香301和Coker371-Gold之間具有多態(tài)性，但其中僅有3個(gè)為共顯性標(biāo)記（即在中煙特香301和Coker371-Gold都有擴(kuò)增產(chǎn)物且條帶呈長度多態(tài)性），而剩余6個(gè)為中煙特香301的顯性標(biāo)記（即僅在中煙特香301中有擴(kuò)增產(chǎn)物，而在Coker371-Gold中則無擴(kuò)增產(chǎn)物）；然而，自 39.192cM 至63.237cM 的10個(gè)SSR標(biāo)記在中煙特香301和Coker371-Gold中雖都有擴(kuò)增產(chǎn)物，但均無長度多態(tài)性（圖1A，B）。在煙草屬進(jìn)化史上，由于N.plumbaginifolia與栽培煙草及其兩個(gè)祖先種 N. sylvestris和N.tomentosiformis分化已達(dá)幾百萬年，基因組之間已發(fā)生了劇烈的變化，積累了巨量的差異序列[31]。據(jù)此推斷，攜帶 Ph 基因的N.plumbagi-nifolia染色體片段可能是通過末端易位的形式轉(zhuǎn)移到栽培煙草基因組中的，其易位點(diǎn)位于煙草SSR第20連鎖群 27.816cM 至 39.192cM 之間（圖1B），分別對(duì)應(yīng)于云煙87基因組HICASM14染色體13.029Mb 至 19.547Mb 之間，以及最新公布的NtaSR1基因組第19染色體（Chr19）150.695Mb至141.160Mb 之間（圖1C）。此外，依據(jù)該片段上的3個(gè)共顯性SSR標(biāo)記推斷，該片段與被替換的栽培煙草染色體片段可能具有一定的同源性。但由于SSR標(biāo)記數(shù)量較少，上述推斷較為粗糙。

注：A為中煙特香301與Coker371-Gold之間的SSR多態(tài)性分析；B為第20連鎖群端部 SSR標(biāo)記及其位置；C為SSR標(biāo)記在NtaSRI和云煙 87基因組中的物理位置，空白表示云煙87HIC_ASM_14在此處無數(shù)據(jù)。

NoteAndicatesteSploalsteeZoganteig303）ndke3olddicatesthSSakersdt geneticatioo;aalofst data deletionofYunyan87HIC_ASM_14atthis location.

2.1.2SNP分析為進(jìn)一步揭示攜帶 Ph 基因的 N. plumbaginifolia染色體片段的詳細(xì)分子特征，對(duì)包含中煙特香301和Coker371-Gold在內(nèi)的33份不同類型煙草種質(zhì)資源進(jìn)行了全基因組重測序。基于SNP變異分析數(shù)據(jù)，首先對(duì)Coker371-Gold不同于其他32份種質(zhì)資源的2894個(gè)特異SNP進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，有近一半（1282個(gè)，占比 44.30% ）特異SNP集中在HIC_ASM_14（分為HIC_ASM_14U和HIC_ASM_14D區(qū)段）染色體上，其余染色體SNP數(shù)量26＼～200個(gè)，與HIC_ASM_14差異巨大（圖2A）。特異SNP平均間距也表明，HIC_ASM_14上特異SNP密度顯著高于其他染色體（圖2B）。

進(jìn)一步對(duì)HIC_ASM_14染色體上特異SNP的分布情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖2A所示，絕大多數(shù)（占比 96.57% 特異SNP集中分布在 0～ 18.54Mb （即HICASM14U）染色體區(qū)段上，該區(qū)段特異SNP平均間距也與前述HIC_ASM_14高度相似（圖2B）。其余區(qū)段（HIC_ASM_14D）則與其他染色體無明顯差異（圖2A，2B）。綜上，推測HIC_ASM_14U可能是攜帶 Ph 基因的N.plumbaginifolia染色體片段，其片段末端也與前述SSR分析推斷的片段易位區(qū)間吻合。

為進(jìn)一步揭示攜帶Ph基因的N.plumbaginjfolia染色體片段與被替換的栽培煙草染色體片段之間的同源關(guān)系，對(duì)包括Coker371-Gold在內(nèi)的全部33份種質(zhì)資源，HIC_ASM_14染色體上 0～ 30Mb 區(qū)間內(nèi)的共35379個(gè)SNP變異的等位SNP缺失率進(jìn)行了分段統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，除 0～1Mb 區(qū)間外， 1～18.54Mb 區(qū)間內(nèi)，Coker371-Gold的等位SNP缺失率0.32＼～0.59，顯著高于其他32份種質(zhì)資源（0.00＼～0.02），而 18.54～30Mb 區(qū)間內(nèi)，Coker371-Gold的等位SNP缺失率則與其他種質(zhì)資源差異不顯著（圖3）。上述結(jié)果表明，攜帶 Ph 基因的 N. plumbaginifolia染色體片段與被替換的栽培煙草染色體片段之間具有較好的同源關(guān)系，其易位點(diǎn)位于云煙87HIC_ASM_14染色體 18.54Mb 附近。

2.2現(xiàn)有 Ph 基因連鎖分子標(biāo)記的整合圖譜繪制

以Coker371-Gold和中煙特香301為對(duì)照，對(duì)二者雜交、回交產(chǎn)生的 BC₁F₁"群體進(jìn)行黑脛病病原菌接種和發(fā)病情況調(diào)查，共鑒定獲得抗病植株113株、感病植株90株。卡方檢驗(yàn)表明，抗感分離比符合顯性單基因遺傳[7，15]（表1）。

通過查閱并搜集5個(gè)已知與 Ph 基因連鎖的分子標(biāo)記[15.18-19]，加上2.1.1篩選得到的3個(gè)共顯性SSR標(biāo)記（圖1A），共獲得8個(gè)可以用于回交育種的分子標(biāo)記（表2）。利用這些標(biāo)記對(duì)上述 BC₁F₁ 群體進(jìn)行基因型檢測，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了遺傳連鎖圖譜的繪制。

結(jié)果如圖4A所示，除 InDel0617 與 Ph 基因共分離之外，其余標(biāo)記皆位于同側(cè)，與 Ph 基因的遺傳距離分別為0.49、0.99和 1.48cM ，初步完成了現(xiàn)有 Ph 基因連鎖分子標(biāo)記的整合圖譜繪制。通過分析這些連鎖標(biāo)記的染色體位置，發(fā)現(xiàn)它們?cè)谖锢韴D譜上的相對(duì)位置與遺傳圖譜是一致的（表2），進(jìn)一步表明了該遺傳連鎖圖譜的可靠性。

2.3與 Ph 基因緊密連鎖的SNP標(biāo)記開發(fā)

為進(jìn)一步明確 Ph 基因的區(qū)間，在標(biāo)記Scf30K與InDel0617的定位區(qū)間，及InDel0617下游3Mb 區(qū)間內(nèi)，搜集Coker371-Gold的特異SNP，進(jìn)行新的連鎖分子標(biāo)記開發(fā)，成功開發(fā)6對(duì)能穩(wěn)定擴(kuò)增的多態(tài)性SNP標(biāo)記（表3）。利用這些SNP標(biāo)記對(duì) BC₁F₁ 群體進(jìn)行基因型鑒定，依據(jù)連鎖遺傳原理，通過分析各標(biāo)記檢測到的重組單株的不同，將 Ph 基因定位在SNP-2和SNP-6之間，該定位區(qū)間在云煙 87HIC_-ASM_-14 染色體上對(duì)應(yīng)的區(qū)間大小約為 6.60Mb ，在NtaSR1Chr19染色體上對(duì)應(yīng)的區(qū)間大小約為 12.89Mb （圖4B）。SNP-2和SNP-6與 Ph 基因的遺傳距離經(jīng)計(jì)算皆為 0.49cM ，均達(dá)到了緊密連鎖程度（ ?0.5cM ），且均為Coker371-Gold特異SNP，可以有效用于眾多品種的 Ph 基因分子標(biāo)記輔助改良育種。

3討論

與小麥、水稻、棉花等主要農(nóng)作物類似[32-34]栽培煙草野生近緣種含有豐富的抗病基因，是重要的抗病育種資源[35]。通過遠(yuǎn)緣雜交手段，目前已將野生煙草對(duì)普通花葉病、馬鈴薯Y病毒病、番茄斑萎病、野火病、黑脛病、根腐病、霜霉病、白粉病、根結(jié)線蟲病、胞囊線蟲病等主要病害的抗性轉(zhuǎn)移到栽培煙草中[36]。這種抗性的轉(zhuǎn)移一般是以雙二倍體、附加系、代換系等異染色體系的形式進(jìn)行[32]。然而，由于野生種通常也攜帶大量的不良農(nóng)藝性狀，與優(yōu)異抗病性形成連鎖累贅，因此，育種實(shí)踐中更偏好使用遺傳穩(wěn)定性好、連鎖累贅少的小片段易位系，尤其是中間插入小片段易位系[37]。借助煙草SSR分子標(biāo)記和基于33份栽培煙草種質(zhì)資源全基因組重測序獲得的3萬多個(gè)SNP的變異信息，本研究發(fā)現(xiàn)攜帶煙草抗黑脛病 Ph 基因的野生煙草N.plumbaginifolia染色體片段很可能是以末端易位的形式轉(zhuǎn)移到栽培煙草中的，且與被替換的栽培煙草染色體片段之間存在較好的同源關(guān)系。

注：A為8個(gè)已知與Ph基因連鎖的分子標(biāo)記及其遺傳圖譜；B為6個(gè)新開發(fā)的與 Ph 基因連鎖的 SNP分子標(biāo)記及其物理圖譜。重組單株表示表型與基因型發(fā)生重組的單株數(shù)量。

更為重要的是，在利用回交分離群體整合構(gòu)建 Ph 基因遺傳連鎖圖譜，以及開發(fā)與 Ph 基因連鎖更為緊密的SNP分子標(biāo)記的過程中，檢測到該野生煙草染色體片段與被替換的栽培煙草染色體片段之間發(fā)生了一定程度的遺傳重組。該研究結(jié)果表明，Ph基因可能位于片段末端，更接近易位點(diǎn)，為進(jìn)一步創(chuàng)制更具使用價(jià)值的中間插入小片段易位系提供了理論依據(jù)。

目前，來源于雪茄煙Florida301的水平抗性QTLs仍然是煙草抗黑脛病育種的主要抗源。基因型分析表明，中國和美國現(xiàn)代育成的烤煙品種，如中煙100、云煙87、豫煙6號(hào)、K326、SpeightG-80等均含有來自Florida301的Phn7.1這一主效抗病位點(diǎn)[38-39]。由于這些QTLs對(duì)黑脛病0號(hào)和1號(hào)生理小種均具有抗性[9-10]，因此在0號(hào)和1號(hào)生理小種同時(shí)流行的地區(qū)不易引起優(yōu)勢小種的轉(zhuǎn)換，可以保持品種抗性的相對(duì)穩(wěn)定，但缺點(diǎn)是單個(gè)QTL的抗性水平不高。相比之下， Ph 基因介導(dǎo)的垂直抗性，盡管抗性水平較高，但由于僅對(duì)0號(hào)生理小種具有抗性，容易在上述地區(qū)引起優(yōu)勢小種從0號(hào)到1號(hào)的轉(zhuǎn)換[40]，這也是目前在煙草抗黑脛病育種中并未廣泛使用 Ph 基因這一抗源的重要原因。近年來，由于尚未明確的原因，攜帶Florida301抗性的部分品種開始表現(xiàn)出黑脛病抗性的明顯下降，推測可能與氣候、生態(tài)等自然條件，以及栽培耕作方式等人為因素的改變引起的生理小種轉(zhuǎn)換或變異有關(guān)（相關(guān)信息來源于山東省烤煙品種區(qū)域試驗(yàn)），這給Florida301黑脛病抗性的持久利用帶來了挑戰(zhàn)。因此，在新形勢下，將 Ph 基因的垂直抗性與Florida301及Beinhart1000-1等新鑒定的抗性種質(zhì)資源的水平抗性相結(jié)合，從而避免長期使用單一抗源，可能是一種應(yīng)對(duì)當(dāng)下黑脛病危害的合理措施。

在本研究中，基于一個(gè) BC₁F₁ 回交分離群體，使用SSR標(biāo)記繪制的 Ph 基因遺傳連鎖圖譜，與Bao等人以及云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院所得結(jié)果不盡相同[15，18-20]。本研究并未將 Ph 基因定位在一個(gè)由SSR標(biāo)記明確界定的染色體區(qū)間內(nèi)，且各連鎖標(biāo)記的相對(duì)位置也存在一定出入。究其原因，可能與使用的分離群體類型及群體大小有關(guān)。盡管攜帶 Ph 基因的 N. plumbaginifolia染色體片段與被替換的栽培煙草染色體片段之間存在較好的同源關(guān)系，但長久分化帶來的巨大序列差異（在特異SNP標(biāo)記開發(fā)過程中可見Coker371-Gold與中煙特香301之間除SNP變異之外，還存在大量的InDel變異），依然會(huì)抑制這種野生種與栽培種之間同源染色體重組事件的發(fā)生，而各標(biāo)記相對(duì)位置的確定主要依賴重組事件發(fā)生的數(shù)量（圖4）。因此，在今后對(duì)來自野生種的攜帶優(yōu)異性狀同源染色體片段的研究中，對(duì)遺傳群體類型選擇和大小確定，應(yīng)結(jié)合試驗(yàn)?zāi)康募昂罄m(xù)研究計(jì)劃予以充分考慮。

4結(jié)論

本研究基于煙草SSR標(biāo)記和33份栽培煙草種質(zhì)資源的SNP變異分析，系統(tǒng)闡明了攜帶抗煙草黑脛病 Ph 基因的N.plumbaginifolia染色體片段的分子特征，整合繪制了現(xiàn)有 Ph 基因分子標(biāo)記的遺傳圖譜。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開發(fā)了與 Ph 基因緊密連鎖的2個(gè)雙側(cè)特異SNP標(biāo)記，可很好地滿足當(dāng)前煙草抗病分子育種工作需求。

參考文獻(xiàn)

[1] 馬國勝，高智謀，陳娟.煙草黑脛病研究進(jìn)展[J].煙草科技， 2001（9）：44-48. MAGS，GAO ZM，CHENJ.Research progress of tobacco black shank disease[J]. Tobacco Science amp; Technology，2001（9）： 44-48.

[2] 孫計(jì)平，李雪君，吳照輝，等.煙草黑脛病的研究進(jìn)展[J].湖北農(nóng) 業(yè)科學(xué)，2011，50（16）：3253-3256. SUNJP，LIXJ，WUZH，etal.Progress ontobacco black shank disease[J]. Hubei Agricultural Sciences，2011， 50（16）： 3253-3256.

[3] 謝永輝，張永貴，朱利全，等.煙草黑脛病綜合防治研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)進(jìn)展，2015，5（1）：41-46. XIEYH，ZHANGYG，ZHULQ，etal.Research advancesin integrated managementof tobacco blackshank[J].Current Biotechnology，2015，5（1）： 41-46.

[4] 黃成江，李天福，邵巖，等.煙草黑脛病生物防治研究進(jìn)展[J].亞 熱帶植物科學(xué)，2006，35（2）：74-77. HUANGCJ，LITF，SHAOY，etal.Areviewofadvancesin biological control of tobacco black shank[J].Subtropical Plant Science，2006，35（2）： 74-77.

[5] 趙亞南，黃大野，楊丹，等.煙草黑脛病研究進(jìn)展[J].湖北農(nóng)業(yè)科 學(xué)，2022，61（增刊1）：25-28. ZHAOYN，HUANGDY，YANGD，etal.Research progressof tobacco black shank disease[J].Hubei Agricultural Sciences，2022， 61（Suppl 1）： 25-28.

[6] CHAPLINJF.TransferofblackshankresistancefromNicotiana plumbaginifoliatoflue-curedN.tabacum[J].TobaccoScience，1962， 6： 184-189.

[7] JOHNSONES，WOLFFMF，WERNSMANEA，etal.Originof the blackshank resistance gene，Ph，in tobacco cultivar Coker371- Gold[J].PlantDisease，2002，86（10）：1080-1084.

[8] DRAKEK，LEWISRS.AnintrogressedNicotianarusticagenomic region confers resistance to Phytophthora nicotianae in cultivated tobacco[J].Crop Science，2013，53（4）：1366-1374.

[9] XIAOBG，DRAKEK，VONTIMITTAV，etal.Locationofgenomic regions contributing to Phytophthora nicotianaeresistance in tobacco cultivarFlorida 301[J].CropScience，2013，53（2）： 473-481.

[10]VONTIMITTA V，LEWIS R S. Mapping of quantitative trait loci affectingresistancetoPhytophthoranicotianaeintobacco（Nicotiana tabacum L.） line Beinhart-10oo[J].Molecular Breeding，2012，29（1）： 89-98.

[11] 李媛，劉國祥，佟英，等.烤煙種質(zhì)資源黑脛病抗性再鑒定[J].中 國煙草科學(xué)，2019，40（2）：1-7. LI Y，LIU G X， TONG Y， et al. Reidentification of resistance to black shank disease of flue-cured tobacco germplasm resources[J]. Chinese Tobacco Science， 2019， 40（2）： 1-7.

[12]劉曉俠，王荔，文國松，等.煙草黑脛病抗性基因 Bsl（t） 的 RAPD標(biāo)記[J].作物學(xué)報(bào)，2004，30（5）：516-518. LIU X X，WANGL，WENG S， et al. Screening and study of RAPD markers linked to tobacco black shank resistance gene Bs1（t）[J]. Acta Agronomica Sinica，2004，30（5）：516-518.

[13]JOHNSONE S，WOLFFMF，WERNSMANEA，et al.Markerassisted selection for resistance to black shank disease in tobacco[J]. Plant Disease，2002，86（12）：1303-1309.

[14]肖炳光.煙草基因組計(jì)劃進(jìn)展篇：3.煙草分子標(biāo)記遺傳連鎖圖構(gòu) 建和重要抗病基因定位[J].中國煙草科學(xué)，2013，34（3）：118-119. XIAO B G. The tobacco genome project progress series：3. Construction of molecular markergenetic linkagemapand localization of important resistance genes in tobacco[J]. Chinese Tobacco Science，2013，34（3）：118-119.

[15] BAO Y G， DING N， QIN Q L， et al. Genetic mapping of the Ph gene conferring disease resistance to black shank in tobacco[J]. Molecular Breeding，2019，39（9）： 122.

[16] 云南省公司科技處.紅花大金元品種抗黑腔病和 TMV的定向改 良[J].中國煙草學(xué)報(bào)，2018，24（1）：123. Technology Department of Yunnan Provincial Company.The directional improvement of the Honghua Dajinyuan variety in terms ofresistanceto black shank and TMV[J].Acta Tabacaria Sinica， 2018， 24（1）： 123.

[17]焦芳嬋，陳學(xué)軍，童治軍，等.利用分子標(biāo)記輔助選擇改良烤煙 資源YNR3黑脛病抗性[J].分子植物育種，2019，17（23）：7811- 7816. JIAO F C，CHEN X J， TONG Z J， et al. Improving the resistance of tobacco black shank intobacco resource YNR3bymarker-assisted selection[J].MolecularPlantBreeding，2019，17（23）：7811-7816.

[18]童治軍，肖炳光，李永平，等.一種用于煙草黑脛病抗性基因 Ph 輔助選擇的分子標(biāo)記及其應(yīng)用：CN201410250226[P].2017-02-15. TONG Z J， XIAOB G，LI Y P，et al. A molecular marker for assisted selection of Ph resistance gene in tobacco black shank disease and its application： CN201410250226[P].2017-02-15.

[19]童治軍，肖炳光，方敦煌，等.一種抗煙草黑脛病Ph 基因連鎖 的分子標(biāo)記及其應(yīng)用：CN201610054257[P].2020-02-04. TONG Z J， XIAO B G， FANG D H， et al. A molecular marker for Ph gene linkage against tobacco black shank disease and itsapplication： CN201610054257[P].2020-02-04.

[20] 肖炳光，李永平，童治軍，等.一種分子標(biāo)記輔助選擇定向改良 煙草黑脛病抗性的育種方法：CN201610979196[P].2019-12-10. XIAO BG， LI Y P， TONG Z P，et al. A breeding method for molecular marker-assisted selection directed improvement of tobacco black shank resistance： CN201610979196[P]. 2019-12-10.

[21]田震，孫晉浩，武鈺存，等.中煙特香 301特異 SNP指紋圖譜構(gòu) 建及應(yīng)用[J].中國煙草科學(xué)，2024，45（5）：8-16. TIAN Z， SUN JH， WU Y C， et al. Construction and application of specific fingerprint of flue-cured tobacco variety Zhongyantexiang 301[J]. Chinese Tobacco Science，2024， 45（5）：8-16.

[22]WU QZ，WU XR， ZHANG XF，etal. Mapping of two white stem genesin tetraploid common tobacco （Nicotiana tabacum L.）[J]. Molecular Breeding，2014，34（3）： 1065-1074.

[23] BINDLER G，PLIESKE J， BAKAHER N， et al. A high density genetic map of tobacco （Nicotiana tabacum L.） obtained from large scale microsatellite marker development[J]. Theoretical and Applied Genetics，2011，123：219-230.

[24]章蕾，袁玲，黃建安，等.從非變性聚丙烯酰胺凝膠中回收 DNA小片段的兩種刀法い孜[J].中國衣子迪報(bào)，ZU11，2//）： 227-230. ZHANG L，YUAN L，HUANG J A， et al. Comparative study on two methods of recycling short DNA fragments from nondenaturing polyacrylamide gel[J]. Chinese Agricultural Science Bulltin， 2011， 27（7）： 227-230.

[25]煙草品種抗病性鑒定：GB/T 23224—2008[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出 版社，2009. Identification of_disease resistance of tobaccovarieties： GB/T 23224——20o8[S].Beijing： China Standards Pres，2009.

[26]郭璇，閆杏杏，蔣彩虹，等.雪茄煙 Beinhart1000-1對(duì)黑脛病0 號(hào)生理小種的抗性遺傳分析[J].中國煙草科學(xué)，2017，38（2）：56-62. GUO X， YAN X X， JIANG C H， et al. Genetic analysis of Beinhart100-1 resistance to black shank in tobacco[J].Chinese Tobacco Science，2017，38（2）： 56-62.

[27]煙草病蟲害分級(jí)及調(diào)查方法：GB/T23222—2008[S].北京：中國 標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009. Grading and survey methods for tobacco diseasesand pests：GB/T 23222——20o08[S].Beijing： China Standards Press，2009.

[28]LI HH，RIBAUTJM，LI Z L，et al. Inclusive composite interval mapping （ICIM） for digenic epistasis of quantitative traits in biparental populations[J].TAG Theoretical andApplied Genetics， 2008，116（2）： 243-260.

[29]CHEN CJ， CHEN H， ZHANG Y， et al. TBtools： An integrative toolkitdeveloped for interactive analyses of big biological data[J]. Molecular Plant，2020，13（8）： 1194-1202.

[30]WANG JB， ZHANG Q L， TUNG J， et al. High-quality assembled and annotated genomes of Nicotiana tabacum and Nicotiana benthamiana reveal chromosome evolution and changes in defense arsenals[J]. Molecular Plant，2024，17（3）： 423-437.

[31]LEITCH I J， HANSON L， LIM K Y， et al. The ups and downs of genomesizeevolutioninpolyploidspeciesofNicotiana （Solanaceae）[J]. Annals ofBotany，2008，101（6）： 805-814.

[32]劉成，韓冉，汪曉璐，等.小麥遠(yuǎn)緣雜交現(xiàn)狀、抗病基因轉(zhuǎn)移及 利用研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，53（7）：1287-1308. LIU C，HAN R， WANG X L， et al. Research progress of wheat wild hybridization，disease resistance genes transfer and utilization[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2020， 53（7）： 1287-1308.

[33]張國棟，鄒丹丹，單貞，等.遠(yuǎn)緣雜交在水稻遺傳育種中的應(yīng)用 [J].中國稻米，2020，26（1）：28-33. ZHANG G D，ZOU D D，SHAN Z， et al. Aplication of distant hybridization in rice geneticsand breeding[J].China Rice，2020， 26（1）： 28-33.

[34]鄭殿升，盛錦山.主要作物遠(yuǎn)緣雜交概況[J].植物遺傳資源科學(xué)， 2002，3（1）：55-60. ZHENG D S，SHENG J S.Distant crosses of staple crops： A review[J]. Journal of Plant Genetic Resources，2002，3（1）：55-60

[35]佟道儒.煙草育種學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1997. TONG D R.Tobacco breeding[M].Beijing： China Agriculture Press， 1997.

[36] KOLE C，BORLAUG N E. Wild crop relatives.Genomic and breeding resources：Vegetables[M].Berlin： Springer，2011.

[37] 黃琛，張錦鵬，劉偉華，等.普通小麥-冰草6P染色體中間插入 易位系的鑒定[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2013，14（4）：606-611. HUANGC，ZHANGJP，LIUWH，etal.IdentificationofwheatAgropyron cristatum 6P chromosome intercalary translocation lines[J].Journal ofPlant GeneticResources，20l3，14（4）： 606-611.

[38]楊志曉，王軼，劉紅峰，等.我國主栽烤煙品種親緣關(guān)系及育種 [J].中國煙草學(xué)報(bào)，2013，19（2）：34-41. YANG Z X， WANG Y，LIU HF， et al. Genetic relationship in major flue-cured tobacco cultivars in China and its implication in variety breeding[J].Acta Tabacaria Sinica，2013，19（2）：34-41.

[39]MAJM，HEIMC，HUMPHRY M，etal.Genetic analysis of Phn7.1， a majorQTL conferring partial resistance to Phytophthora nicotianae inNicotiana tabacum[J].MolecularBreeding，2019，39（1）.

[40]SULLIVAN M J， MELTON T A， SHEW H D. Managing the race structure of Phytophthora parasitica var.nicotianae with cultivar rntatinn[T] PlantDiceace 2005 80/12）：1285-1204