與煙草抗黑脛病Ph基因緊密連鎖的SNP標記開發

中圖分類號：S572.03 文獻標識碼：A文章編號：1007-5119（2025）03-0020-09

Development of SNP Markers Tightly Linked to the Ph Gene Conferring Resistance to Tobacco Black Shank Disease

FENG Huixin12， CHEN Meng1， LIU Xijin3， WANG Dahai4， WU Feng3，DING Pengbo， TANG Lizhong6， XU Zhantao12， WANG Yuhua4，WU Xinru1*， ZONG Hao3* （1. Institute ofTobacco Research， Chinese Academy of Agricultural Sciences，Qingdao 266101，China; 2.Graduate Schoolof

ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijingo81，China;3.LinyobaccoCompanyofSandongrovince，Liy00，

Shandong，China; 4.WeifangTobaccoCompanyofShandongProvince，Weifang2612o5，Shandong，China;5.QingdaoTobacco Company of Shandong Province， Qingdao 266071， China; 6. Yongzhou Branch of Hunan Tobacco Company， Yongzhou 425900，Hunan，China）

Abstract： Originated from the wild tobacco Nicotiana plumbaginifolia， the Ph gene is a high-quality resistance source to black shank in tobacco breding.Inorder todevelo SNP markers linkedtothis geneto meet te demandofcurrent molecularbreeding， thisstudy used black shank-resistant flue-cured tobacco variety Coker371-Gold with the Ph gene and a susceptible variety Zhongyantexiang 301 without the Ph gene as materials. Using tobacco SSR markers and SNP variations of 33 cultivated tobacco germplasmresourcesbasedonwhole genome resequencing，the molecularcharacteriticsof thechromosomal fragmentof N. plumbaginifolia carrying the Ph gene was described.By constructing a backcross population segregating for black shank resistance， an integrated genetic map of 8 known molecular markers linked to the Ph gene was drawn， and on the basis，more closely linked SNP markers to the Ph genewere developed.The resultsshowed as the follows.（1） The N.plumbaginifolia chromosomal fragment carrying the Ph gene was probably transferred into cultivated tobacco intheform of terminal translocation，and hada good homology relationshipwiththereplacedcultivated tobaccochromosomal fragment，and its translocationsitewas located near 18.54Mb of Yunyan87HIC_ASM_14 chromosome; （2） Ph gene was located at the end of the translocation fragment，which probably being close to thetranslocationsite，andonecloselylinkedspecificSNPmarker wasobtainedoneachsideofthegee.Theseresultsprovideda

theoretical basisforfurthercreatingamorevaluableintercalarytranslocationline withsmallfagment，therebyprovidingtechical support for better utilization of this black shank disease resistance source in the future.

Keywords： tobacco; black shank; Ph gene; translocation; single nucleotide polymorphism

煙草黑脛病是由煙草疫霉Phytophthora par-asiticavar.nicotianae引起的土傳性真菌病害，是煙草生產上最具毀滅性的病害之一。該病自一個多世紀前被發現以來，迅速流行于世界各主要產煙國，每年造成巨大的經濟損失[1]。黑脛病可發生于煙草整個生育期，主要為害大田生長階段的煙株，以莖基部發病為主，可為害髓部、葉片，最終導致全株凋萎、枯死[2]。煙草黑脛病的發生與流行受多種因素影響，高溫高濕、排水不暢、連作等均可加重該病的危害程度。因此，在生產實踐中可通過與禾本科等非寄主作物合理輪作、推廣深耕高起壟移栽、加強排水和及時清理病株等栽培耕作措施，以及選用合適的殺菌劑、拮抗菌及誘抗劑來降低危害[3-5]。從可持續發展的角度考慮，培育抗病品種是防治黑脛病最經濟、有效和環保的措施，而其中的關鍵是尋找合適的抗源。經過幾十年的搜集、創制與試驗，煙草積累了豐富的黑脛病抗源，這些抗源主要來自：（1）煙草屬近緣種，如來源于野生煙草Nicotianaplumbaginifolia和N.longiflora的垂直抗性基因Php和 Phl^[6-7] ，及來源于N.rustica的 Wz 基因[8]；（2）栽培煙草種質資源，如來源于雪茄煙Florida301和Beinhart1000-1的水平抗性微效多基因，即數量性狀位點（quantitative trait loci， QTLs）[9-10]。此外，從煙草地方種質資源中也鑒定了一批抗源[11]；（3）栽培煙草人工誘變突變體，如劉曉俠等[12]采用輻射誘變的方法獲得了高抗黑脛病的紅花大金元突變體。

育種過程中，科研人員更偏好使用抗感分離明顯的垂直抗性基因。黑脛病目前有4個生理小種，分別是0、1、2和3號，其中0號和1號小種是包括我國在內的絕大多數產煙國的流行小種，以0號為優勢小種。鑒于此，來源于野生煙草N.plumbag-inifolia的抗黑脛病0號生理小種的 Ph 基因獲得了較多的關注。以攜帶 Ph 基因的烤煙品種Coker371-Gold為抗源，國內外先后開發了一系列與 Ph 基因連鎖的分子標記[13-15]，并成功應用于烤煙品種紅花大金元和 YNR3 的黑脛病抗性定向改良[16-17]。目前已開發的與 Ph 基因連鎖的分子標記尚存在諸多不足：（1）Bao 等[15]于2019年開發的標記中，絕大多數標記為相斥相標記（僅感病親本有條帶的顯性標記），較難用于回交分子育種，或多態性范圍較小，無法廣泛用于其他品種，僅BS-SCAR1實際使用效果較好，但該標記并不與 Ph 基因共分離，單一使用該標記存在誤判的可能；（2）目前已有的共顯性標記全部為 SSR（simple sequence repeat）標記[18-20]，不能滿足分子育種對基因型檢測低成本、高通量、自動化的需求，正日漸被新一代SNP（single nucleotidepolymorphism）標記取代。

基于上述研究現狀，本研究利用煙草SSR標記和基于全基因組重測序的SNP變異數據，對攜帶 Ph 基因的 N. plumbaginifolia染色體片段的分子特征進行系統、全面的描述，并構建遺傳分離群體，對現有與 Ph 基因連鎖的分子標記進行整合。在此基礎上，開發與 Ph 基因連鎖更為緊密的SNP標記，為今后更好地利用這一黑脛病抗源提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究使用的試驗材料由本課題組保存，包括攜帶 Ph 基因的抗黑脛病烤煙品種Coker371-Gold、不攜帶 Ph 基因的感黑脛病烤煙品種中煙特香301、二者雜交后產生的 F₁ ，以及 F₁ 再與中煙特香301回交產生的 BC₁F₁ 分離群體。包含Coker371-Gold和中煙特香301在內，用于全基因組重測序和SNP變異分析的33份栽培煙草種質資源相關信息詳見本課題組之前發表的研究論文[21]。

1.2基因組DNA提取、PCR和產物檢測

煙葉樣品經液氮冷凍并研磨后，使用新型植物基因組DNA提取試劑盒（CW0531，江蘇康為世紀生物科技股份有限公司）提取基因組DNA，并去除RNA污染，經NanoDrop2000微量分光光度計（ThermoFisherScientific）測定濃度后，稀釋至60～100μg/μL 作為PCR模板。PCR于VeritiTM96孔熱循環儀（4375305，ThermoFisherScientific）上進行。總反應體系為：基因組DNA模板 1μL ，上下游引物 10μmol/L） 各 1μL ， 2× Taq Master Mix（P111，南京諾唯贊生物科技股份有限公司） 7.5μL ddH₂O4.5μL ，總計 15μL 。SSR-PCR產物經 6% 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離和銀染顯色后直接觀察[22]；其他PCR產物經 1% 瓊脂糖凝膠電泳分離和溴化乙錠（EtBr）染色后，于紫外燈下觀察。

1.3SSR分析、PCR產物的分離、測序與物理位置確定

依據Bindler等[23]公布的煙草高密度SSR遺傳連鎖圖譜，參照Bao等[15]對 Ph 基因的定位結果，選取定位區間內及其側翼區段的SSR標記，在Coker371-Gold和中煙特香301之間進行多態性篩選。參照章蕾等[24]的方法從聚丙烯酰胺凝膠上分離SSR-PCR產物的目標DNA條帶，用移液吸頭搗碎后，加適量 煮沸 15min ，以12000r/min 離心 5min 后獲得的上清液作為模板，利用原SSR引物進行二次PCR，PCR產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測后進行常規測序，然后與云煙87和NtaSR1基因組比對，獲得SSR在基因組中的精確物理位置。

1.4 SNP變異分析

參照田震等[21]的方法，對包含烤煙、香料煙、白肋煙和曬煙等類型的33份栽培煙草種質資源進行SNP變異分析。

1.5煙草黑脛病接種、病情調查與抗性鑒定

參照GB/T23224—2008[25]和郭璇等[26]的方法，活化、擴繁和接種黑脛病病原菌。黑脛病0號生理小種接種于燕麥培養基上進行活化后，接入菌谷培養基進行擴繁。待煙苗長至5＼～6片真葉時，用刀輕輕劃傷莖基部及根部，接種定量攪拌均勻的菌谷，并覆土保濕。參照GB/T23222—2008[27]鑒定各試驗材料的黑脛病抗性。接種后每隔3天，對各單株的發病情況進行跟蹤調查，并根據病害嚴重度進行分級，直至病情不再發展。病情調查全部結束后，將0＼～1級判定為抗病，7＼～9級判定為感病。

1.6遺傳連鎖圖譜繪制

使用QTLIciMapping4.2計算遺傳距離和繪制遺傳連鎖圖譜[28]，LOD值設為3.0，遺傳距離以厘摩（cM）表示。

1.7特異SNP標記開發及PCR驗證

使用TBtools軟件[29]從烤煙栽培品種云煙87基因組中（由云南省煙草農業科學研究院完成測序、組裝與注釋，未公開）提取目標SNP位點及其上下游各 500bp 序列，與新公布的栽培煙草NtaSR1基因組[30比對，獲得各位點在NtaSR1基因組中的位置信息以及序列特異性；選取特異性較好的序列，用PrimerPremier5.0軟件設計PCR引物，PCR產物送北京六合華大基因科技有限公司進行常規測序，以驗證SNP變異是否真實存在。

2結果

2.1攜帶 Ph 基因的 N. plumbaginifolia染色體片段的分子標記分析

2.1.1SSR分析為更全面揭示攜帶 Ph 基因的 N. plumbaginifolia染色體片段的分子特征，以便為后續的基因定位和標記開發奠定基礎，參照Bao等[15]對 Ph 基因的定位結果，依據Bindler等[23]公布的煙草SSR高密度連鎖圖譜，選取第20連鎖群（Linkagegroup20，LG20）自端部至 70cM 區間內均勻分布的SSR標記22個，對中煙特香301和Coker371-Gold進行了分析，共獲得19個穩定擴增、條帶清晰的SSR標記。多態性分析顯示，自端部至 27.816cM 的9個SSR標記在中煙特香301和Coker371-Gold之間具有多態性，但其中僅有3個為共顯性標記（即在中煙特香301和Coker371-Gold都有擴增產物且條帶呈長度多態性），而剩余6個為中煙特香301的顯性標記（即僅在中煙特香301中有擴增產物，而在Coker371-Gold中則無擴增產物）；然而，自 39.192cM 至63.237cM 的10個SSR標記在中煙特香301和Coker371-Gold中雖都有擴增產物，但均無長度多態性（圖1A，B）。在煙草屬進化史上，由于N.plumbaginifolia與栽培煙草及其兩個祖先種 N. sylvestris和N.tomentosiformis分化已達幾百萬年，基因組之間已發生了劇烈的變化，積累了巨量的差異序列[31]。據此推斷，攜帶 Ph 基因的N.plumbagi-nifolia染色體片段可能是通過末端易位的形式轉移到栽培煙草基因組中的，其易位點位于煙草SSR第20連鎖群 27.816cM 至 39.192cM 之間（圖1B），分別對應于云煙87基因組HICASM14染色體13.029Mb 至 19.547Mb 之間，以及最新公布的NtaSR1基因組第19染色體（Chr19）150.695Mb至141.160Mb 之間（圖1C）。此外，依據該片段上的3個共顯性SSR標記推斷，該片段與被替換的栽培煙草染色體片段可能具有一定的同源性。但由于SSR標記數量較少，上述推斷較為粗糙。

注：A為中煙特香301與Coker371-Gold之間的SSR多態性分析；B為第20連鎖群端部 SSR標記及其位置；C為SSR標記在NtaSRI和云煙 87基因組中的物理位置，空白表示云煙87HIC_ASM_14在此處無數據。

NoteAndicatesteSploalsteeZoganteig303）ndke3olddicatesthSSakersdt geneticatioo;aalofst data deletionofYunyan87HIC_ASM_14atthis location.

2.1.2SNP分析為進一步揭示攜帶 Ph 基因的 N. plumbaginifolia染色體片段的詳細分子特征，對包含中煙特香301和Coker371-Gold在內的33份不同類型煙草種質資源進行了全基因組重測序。基于SNP變異分析數據，首先對Coker371-Gold不同于其他32份種質資源的2894個特異SNP進行了統計分析。結果顯示，有近一半（1282個，占比 44.30% ）特異SNP集中在HIC_ASM_14（分為HIC_ASM_14U和HIC_ASM_14D區段）染色體上，其余染色體SNP數量26＼～200個，與HIC_ASM_14差異巨大（圖2A）。特異SNP平均間距也表明，HIC_ASM_14上特異SNP密度顯著高于其他染色體（圖2B）。

進一步對HIC_ASM_14染色體上特異SNP的分布情況進行了統計分析，結果如圖2A所示，絕大多數（占比 96.57% 特異SNP集中分布在 0～ 18.54Mb （即HICASM14U）染色體區段上，該區段特異SNP平均間距也與前述HIC_ASM_14高度相似（圖2B）。其余區段（HIC_ASM_14D）則與其他染色體無明顯差異（圖2A，2B）。綜上，推測HIC_ASM_14U可能是攜帶 Ph 基因的N.plumbaginifolia染色體片段，其片段末端也與前述SSR分析推斷的片段易位區間吻合。

為進一步揭示攜帶Ph基因的N.plumbaginjfolia染色體片段與被替換的栽培煙草染色體片段之間的同源關系，對包括Coker371-Gold在內的全部33份種質資源，HIC_ASM_14染色體上 0～ 30Mb 區間內的共35379個SNP變異的等位SNP缺失率進行了分段統計。結果顯示，除 0～1Mb 區間外， 1～18.54Mb 區間內，Coker371-Gold的等位SNP缺失率0.32＼～0.59，顯著高于其他32份種質資源（0.00＼～0.02），而 18.54～30Mb 區間內，Coker371-Gold的等位SNP缺失率則與其他種質資源差異不顯著（圖3）。上述結果表明，攜帶 Ph 基因的 N. plumbaginifolia染色體片段與被替換的栽培煙草染色體片段之間具有較好的同源關系，其易位點位于云煙87HIC_ASM_14染色體 18.54Mb 附近。

2.2現有 Ph 基因連鎖分子標記的整合圖譜繪制

以Coker371-Gold和中煙特香301為對照，對二者雜交、回交產生的 BC₁F₁"群體進行黑脛病病原菌接種和發病情況調查，共鑒定獲得抗病植株113株、感病植株90株。卡方檢驗表明，抗感分離比符合顯性單基因遺傳[7，15]（表1）。

通過查閱并搜集5個已知與 Ph 基因連鎖的分子標記[15.18-19]，加上2.1.1篩選得到的3個共顯性SSR標記（圖1A），共獲得8個可以用于回交育種的分子標記（表2）。利用這些標記對上述 BC₁F₁ 群體進行基因型檢測，在此基礎上進行了遺傳連鎖圖譜的繪制。

結果如圖4A所示，除 InDel0617 與 Ph 基因共分離之外，其余標記皆位于同側，與 Ph 基因的遺傳距離分別為0.49、0.99和 1.48cM ，初步完成了現有 Ph 基因連鎖分子標記的整合圖譜繪制。通過分析這些連鎖標記的染色體位置，發現它們在物理圖譜上的相對位置與遺傳圖譜是一致的（表2），進一步表明了該遺傳連鎖圖譜的可靠性。

2.3與 Ph 基因緊密連鎖的SNP標記開發

為進一步明確 Ph 基因的區間，在標記Scf30K與InDel0617的定位區間，及InDel0617下游3Mb 區間內，搜集Coker371-Gold的特異SNP，進行新的連鎖分子標記開發，成功開發6對能穩定擴增的多態性SNP標記（表3）。利用這些SNP標記對 BC₁F₁ 群體進行基因型鑒定，依據連鎖遺傳原理，通過分析各標記檢測到的重組單株的不同，將 Ph 基因定位在SNP-2和SNP-6之間，該定位區間在云煙 87HIC_-ASM_-14 染色體上對應的區間大小約為 6.60Mb ，在NtaSR1Chr19染色體上對應的區間大小約為 12.89Mb （圖4B）。SNP-2和SNP-6與 Ph 基因的遺傳距離經計算皆為 0.49cM ，均達到了緊密連鎖程度（ ?0.5cM ），且均為Coker371-Gold特異SNP，可以有效用于眾多品種的 Ph 基因分子標記輔助改良育種。

3討論

與小麥、水稻、棉花等主要農作物類似[32-34]栽培煙草野生近緣種含有豐富的抗病基因，是重要的抗病育種資源[35]。通過遠緣雜交手段，目前已將野生煙草對普通花葉病、馬鈴薯Y病毒病、番茄斑萎病、野火病、黑脛病、根腐病、霜霉病、白粉病、根結線蟲病、胞囊線蟲病等主要病害的抗性轉移到栽培煙草中[36]。這種抗性的轉移一般是以雙二倍體、附加系、代換系等異染色體系的形式進行[32]。然而，由于野生種通常也攜帶大量的不良農藝性狀，與優異抗病性形成連鎖累贅，因此，育種實踐中更偏好使用遺傳穩定性好、連鎖累贅少的小片段易位系，尤其是中間插入小片段易位系[37]。借助煙草SSR分子標記和基于33份栽培煙草種質資源全基因組重測序獲得的3萬多個SNP的變異信息，本研究發現攜帶煙草抗黑脛病 Ph 基因的野生煙草N.plumbaginifolia染色體片段很可能是以末端易位的形式轉移到栽培煙草中的，且與被替換的栽培煙草染色體片段之間存在較好的同源關系。

注：A為8個已知與Ph基因連鎖的分子標記及其遺傳圖譜；B為6個新開發的與 Ph 基因連鎖的 SNP分子標記及其物理圖譜。重組單株表示表型與基因型發生重組的單株數量。

更為重要的是，在利用回交分離群體整合構建 Ph 基因遺傳連鎖圖譜，以及開發與 Ph 基因連鎖更為緊密的SNP分子標記的過程中，檢測到該野生煙草染色體片段與被替換的栽培煙草染色體片段之間發生了一定程度的遺傳重組。該研究結果表明，Ph基因可能位于片段末端，更接近易位點，為進一步創制更具使用價值的中間插入小片段易位系提供了理論依據。

目前，來源于雪茄煙Florida301的水平抗性QTLs仍然是煙草抗黑脛病育種的主要抗源。基因型分析表明，中國和美國現代育成的烤煙品種，如中煙100、云煙87、豫煙6號、K326、SpeightG-80等均含有來自Florida301的Phn7.1這一主效抗病位點[38-39]。由于這些QTLs對黑脛病0號和1號生理小種均具有抗性[9-10]，因此在0號和1號生理小種同時流行的地區不易引起優勢小種的轉換，可以保持品種抗性的相對穩定，但缺點是單個QTL的抗性水平不高。相比之下， Ph 基因介導的垂直抗性，盡管抗性水平較高，但由于僅對0號生理小種具有抗性，容易在上述地區引起優勢小種從0號到1號的轉換[40]，這也是目前在煙草抗黑脛病育種中并未廣泛使用 Ph 基因這一抗源的重要原因。近年來，由于尚未明確的原因，攜帶Florida301抗性的部分品種開始表現出黑脛病抗性的明顯下降，推測可能與氣候、生態等自然條件，以及栽培耕作方式等人為因素的改變引起的生理小種轉換或變異有關（相關信息來源于山東省烤煙品種區域試驗），這給Florida301黑脛病抗性的持久利用帶來了挑戰。因此，在新形勢下，將 Ph 基因的垂直抗性與Florida301及Beinhart1000-1等新鑒定的抗性種質資源的水平抗性相結合，從而避免長期使用單一抗源，可能是一種應對當下黑脛病危害的合理措施。

在本研究中，基于一個 BC₁F₁ 回交分離群體，使用SSR標記繪制的 Ph 基因遺傳連鎖圖譜，與Bao等人以及云南省煙草農業科學研究院所得結果不盡相同[15，18-20]。本研究并未將 Ph 基因定位在一個由SSR標記明確界定的染色體區間內，且各連鎖標記的相對位置也存在一定出入。究其原因，可能與使用的分離群體類型及群體大小有關。盡管攜帶 Ph 基因的 N. plumbaginifolia染色體片段與被替換的栽培煙草染色體片段之間存在較好的同源關系，但長久分化帶來的巨大序列差異（在特異SNP標記開發過程中可見Coker371-Gold與中煙特香301之間除SNP變異之外，還存在大量的InDel變異），依然會抑制這種野生種與栽培種之間同源染色體重組事件的發生，而各標記相對位置的確定主要依賴重組事件發生的數量（圖4）。因此，在今后對來自野生種的攜帶優異性狀同源染色體片段的研究中，對遺傳群體類型選擇和大小確定，應結合試驗目的及后續研究計劃予以充分考慮。

4結論

本研究基于煙草SSR標記和33份栽培煙草種質資源的SNP變異分析，系統闡明了攜帶抗煙草黑脛病 Ph 基因的N.plumbaginifolia染色體片段的分子特征，整合繪制了現有 Ph 基因分子標記的遺傳圖譜。在此基礎上，進一步開發了與 Ph 基因緊密連鎖的2個雙側特異SNP標記，可很好地滿足當前煙草抗病分子育種工作需求。

參考文獻

[1] 馬國勝，高智謀，陳娟.煙草黑脛病研究進展[J].煙草科技， 2001（9）：44-48. MAGS，GAO ZM，CHENJ.Research progress of tobacco black shank disease[J]. Tobacco Science amp; Technology，2001（9）： 44-48.

[2] 孫計平，李雪君，吳照輝，等.煙草黑脛病的研究進展[J].湖北農 業科學，2011，50（16）：3253-3256. SUNJP，LIXJ，WUZH，etal.Progress ontobacco black shank disease[J]. Hubei Agricultural Sciences，2011， 50（16）： 3253-3256.

[3] 謝永輝，張永貴，朱利全，等.煙草黑脛病綜合防治研究進展[J]. 生物技術進展，2015，5（1）：41-46. XIEYH，ZHANGYG，ZHULQ，etal.Research advancesin integrated managementof tobacco blackshank[J].Current Biotechnology，2015，5（1）： 41-46.

[4] 黃成江，李天福，邵巖，等.煙草黑脛病生物防治研究進展[J].亞 熱帶植物科學，2006，35（2）：74-77. HUANGCJ，LITF，SHAOY，etal.Areviewofadvancesin biological control of tobacco black shank[J].Subtropical Plant Science，2006，35（2）： 74-77.

[5] 趙亞南，黃大野，楊丹，等.煙草黑脛病研究進展[J].湖北農業科 學，2022，61（增刊1）：25-28. ZHAOYN，HUANGDY，YANGD，etal.Research progressof tobacco black shank disease[J].Hubei Agricultural Sciences，2022， 61（Suppl 1）： 25-28.

[6] CHAPLINJF.TransferofblackshankresistancefromNicotiana plumbaginifoliatoflue-curedN.tabacum[J].TobaccoScience，1962， 6： 184-189.

[7] JOHNSONES，WOLFFMF，WERNSMANEA，etal.Originof the blackshank resistance gene，Ph，in tobacco cultivar Coker371- Gold[J].PlantDisease，2002，86（10）：1080-1084.

[8] DRAKEK，LEWISRS.AnintrogressedNicotianarusticagenomic region confers resistance to Phytophthora nicotianae in cultivated tobacco[J].Crop Science，2013，53（4）：1366-1374.

[9] XIAOBG，DRAKEK，VONTIMITTAV，etal.Locationofgenomic regions contributing to Phytophthora nicotianaeresistance in tobacco cultivarFlorida 301[J].CropScience，2013，53（2）： 473-481.

[10]VONTIMITTA V，LEWIS R S. Mapping of quantitative trait loci affectingresistancetoPhytophthoranicotianaeintobacco（Nicotiana tabacum L.） line Beinhart-10oo[J].Molecular Breeding，2012，29（1）： 89-98.

[11] 李媛，劉國祥，佟英，等.烤煙種質資源黑脛病抗性再鑒定[J].中 國煙草科學，2019，40（2）：1-7. LI Y，LIU G X， TONG Y， et al. Reidentification of resistance to black shank disease of flue-cured tobacco germplasm resources[J]. Chinese Tobacco Science， 2019， 40（2）： 1-7.

[12]劉曉俠，王荔，文國松，等.煙草黑脛病抗性基因 Bsl（t） 的 RAPD標記[J].作物學報，2004，30（5）：516-518. LIU X X，WANGL，WENG S， et al. Screening and study of RAPD markers linked to tobacco black shank resistance gene Bs1（t）[J]. Acta Agronomica Sinica，2004，30（5）：516-518.

[13]JOHNSONE S，WOLFFMF，WERNSMANEA，et al.Markerassisted selection for resistance to black shank disease in tobacco[J]. Plant Disease，2002，86（12）：1303-1309.

[14]肖炳光.煙草基因組計劃進展篇：3.煙草分子標記遺傳連鎖圖構 建和重要抗病基因定位[J].中國煙草科學，2013，34（3）：118-119. XIAO B G. The tobacco genome project progress series：3. Construction of molecular markergenetic linkagemapand localization of important resistance genes in tobacco[J]. Chinese Tobacco Science，2013，34（3）：118-119.

[15] BAO Y G， DING N， QIN Q L， et al. Genetic mapping of the Ph gene conferring disease resistance to black shank in tobacco[J]. Molecular Breeding，2019，39（9）： 122.

[16] 云南省公司科技處.紅花大金元品種抗黑腔病和 TMV的定向改 良[J].中國煙草學報，2018，24（1）：123. Technology Department of Yunnan Provincial Company.The directional improvement of the Honghua Dajinyuan variety in terms ofresistanceto black shank and TMV[J].Acta Tabacaria Sinica， 2018， 24（1）： 123.

[17]焦芳嬋，陳學軍，童治軍，等.利用分子標記輔助選擇改良烤煙 資源YNR3黑脛病抗性[J].分子植物育種，2019，17（23）：7811- 7816. JIAO F C，CHEN X J， TONG Z J， et al. Improving the resistance of tobacco black shank intobacco resource YNR3bymarker-assisted selection[J].MolecularPlantBreeding，2019，17（23）：7811-7816.

[18]童治軍，肖炳光，李永平，等.一種用于煙草黑脛病抗性基因 Ph 輔助選擇的分子標記及其應用：CN201410250226[P].2017-02-15. TONG Z J， XIAOB G，LI Y P，et al. A molecular marker for assisted selection of Ph resistance gene in tobacco black shank disease and its application： CN201410250226[P].2017-02-15.

[19]童治軍，肖炳光，方敦煌，等.一種抗煙草黑脛病Ph 基因連鎖 的分子標記及其應用：CN201610054257[P].2020-02-04. TONG Z J， XIAO B G， FANG D H， et al. A molecular marker for Ph gene linkage against tobacco black shank disease and itsapplication： CN201610054257[P].2020-02-04.

[20] 肖炳光，李永平，童治軍，等.一種分子標記輔助選擇定向改良 煙草黑脛病抗性的育種方法：CN201610979196[P].2019-12-10. XIAO BG， LI Y P， TONG Z P，et al. A breeding method for molecular marker-assisted selection directed improvement of tobacco black shank resistance： CN201610979196[P]. 2019-12-10.

[21]田震，孫晉浩，武鈺存，等.中煙特香 301特異 SNP指紋圖譜構 建及應用[J].中國煙草科學，2024，45（5）：8-16. TIAN Z， SUN JH， WU Y C， et al. Construction and application of specific fingerprint of flue-cured tobacco variety Zhongyantexiang 301[J]. Chinese Tobacco Science，2024， 45（5）：8-16.

[22]WU QZ，WU XR， ZHANG XF，etal. Mapping of two white stem genesin tetraploid common tobacco （Nicotiana tabacum L.）[J]. Molecular Breeding，2014，34（3）： 1065-1074.

[23] BINDLER G，PLIESKE J， BAKAHER N， et al. A high density genetic map of tobacco （Nicotiana tabacum L.） obtained from large scale microsatellite marker development[J]. Theoretical and Applied Genetics，2011，123：219-230.

[24]章蕾，袁玲，黃建安，等.從非變性聚丙烯酰胺凝膠中回收 DNA小片段的兩種刀法い孜[J].中國衣子迪報，ZU11，2//）： 227-230. ZHANG L，YUAN L，HUANG J A， et al. Comparative study on two methods of recycling short DNA fragments from nondenaturing polyacrylamide gel[J]. Chinese Agricultural Science Bulltin， 2011， 27（7）： 227-230.

[25]煙草品種抗病性鑒定：GB/T 23224—2008[S].北京：中國標準出 版社，2009. Identification of_disease resistance of tobaccovarieties： GB/T 23224——20o8[S].Beijing： China Standards Pres，2009.

[26]郭璇，閆杏杏，蔣彩虹，等.雪茄煙 Beinhart1000-1對黑脛病0 號生理小種的抗性遺傳分析[J].中國煙草科學，2017，38（2）：56-62. GUO X， YAN X X， JIANG C H， et al. Genetic analysis of Beinhart100-1 resistance to black shank in tobacco[J].Chinese Tobacco Science，2017，38（2）： 56-62.

[27]煙草病蟲害分級及調查方法：GB/T23222—2008[S].北京：中國 標準出版社，2009. Grading and survey methods for tobacco diseasesand pests：GB/T 23222——20o08[S].Beijing： China Standards Press，2009.

[28]LI HH，RIBAUTJM，LI Z L，et al. Inclusive composite interval mapping （ICIM） for digenic epistasis of quantitative traits in biparental populations[J].TAG Theoretical andApplied Genetics， 2008，116（2）： 243-260.

[29]CHEN CJ， CHEN H， ZHANG Y， et al. TBtools： An integrative toolkitdeveloped for interactive analyses of big biological data[J]. Molecular Plant，2020，13（8）： 1194-1202.

[30]WANG JB， ZHANG Q L， TUNG J， et al. High-quality assembled and annotated genomes of Nicotiana tabacum and Nicotiana benthamiana reveal chromosome evolution and changes in defense arsenals[J]. Molecular Plant，2024，17（3）： 423-437.

[31]LEITCH I J， HANSON L， LIM K Y， et al. The ups and downs of genomesizeevolutioninpolyploidspeciesofNicotiana （Solanaceae）[J]. Annals ofBotany，2008，101（6）： 805-814.

[32]劉成，韓冉，汪曉璐，等.小麥遠緣雜交現狀、抗病基因轉移及 利用研究進展[J].中國農業科學，2020，53（7）：1287-1308. LIU C，HAN R， WANG X L， et al. Research progress of wheat wild hybridization，disease resistance genes transfer and utilization[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2020， 53（7）： 1287-1308.

[33]張國棟，鄒丹丹，單貞，等.遠緣雜交在水稻遺傳育種中的應用 [J].中國稻米，2020，26（1）：28-33. ZHANG G D，ZOU D D，SHAN Z， et al. Aplication of distant hybridization in rice geneticsand breeding[J].China Rice，2020， 26（1）： 28-33.

[34]鄭殿升，盛錦山.主要作物遠緣雜交概況[J].植物遺傳資源科學， 2002，3（1）：55-60. ZHENG D S，SHENG J S.Distant crosses of staple crops： A review[J]. Journal of Plant Genetic Resources，2002，3（1）：55-60

[35]佟道儒.煙草育種學[M].北京：中國農業出版社，1997. TONG D R.Tobacco breeding[M].Beijing： China Agriculture Press， 1997.

[36] KOLE C，BORLAUG N E. Wild crop relatives.Genomic and breeding resources：Vegetables[M].Berlin： Springer，2011.

[37] 黃琛，張錦鵬，劉偉華，等.普通小麥-冰草6P染色體中間插入 易位系的鑒定[J].植物遺傳資源學報，2013，14（4）：606-611. HUANGC，ZHANGJP，LIUWH，etal.IdentificationofwheatAgropyron cristatum 6P chromosome intercalary translocation lines[J].Journal ofPlant GeneticResources，20l3，14（4）： 606-611.

[38]楊志曉，王軼，劉紅峰，等.我國主栽烤煙品種親緣關系及育種 [J].中國煙草學報，2013，19（2）：34-41. YANG Z X， WANG Y，LIU HF， et al. Genetic relationship in major flue-cured tobacco cultivars in China and its implication in variety breeding[J].Acta Tabacaria Sinica，2013，19（2）：34-41.

[39]MAJM，HEIMC，HUMPHRY M，etal.Genetic analysis of Phn7.1， a majorQTL conferring partial resistance to Phytophthora nicotianae inNicotiana tabacum[J].MolecularBreeding，2019，39（1）.

[40]SULLIVAN M J， MELTON T A， SHEW H D. Managing the race structure of Phytophthora parasitica var.nicotianae with cultivar rntatinn[T] PlantDiceace 2005 80/12）：1285-1204