7個品種（系）鳳凰茶的染色體核型與聚類分析

鳳凰茶產于我國廣東省潮州市鳳凰山區，屬山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）植物[1]，是數量繁多、香型豐富的栽培型珍稀茶樹種質資源．但正是因為鳳凰茶品種、品系資源繁多，且主要以香型為主線將其歸類，存在同一香型中包含多個品種、品系，同型品種、品系之間的品質參差不齊的現象．加之茶樹通常是通過雜交進行育種，從而使各品種、品系之間的親緣關系混亂，本底不清，遺傳背景不明確，極大地妨礙了品種、品系之間的親緣歸類，以及育種親本的選配和種質資源的創新和利用．從細胞學上對染色體的核型進行研究分析，有助于從遺傳本質上揭示茶樹遺傳變異性狀的表達規律、闡明其物種進化的機制和途徑；對種間雜交和多倍體育種材料的鑒定都具有重要的參考價值.茶樹染色體的研究是從20世紀初開始的，前人鑒定出茶樹染色體在體細胞中為30條，性細胞中為15條[2-3]．近幾年對茶樹染色體的研究中發現了單倍體、三倍體以及四倍體[4-5]，但對潮州鳳凰茶染色體核型的研究還鮮見報道．為此，我們對7個鳳凰茶種質進行了核型分析，以期為潮州鳳凰茶的遺傳育種以及種質親緣關系的研究提供細胞學依據.

1材料與方法

1.1材料

蜜蘭香、紅心沙仁、大烏葉和梅占采于潮州鐵鋪中華名茶園；桂花香和白葉采于鳳凰山區的鵬龍茶園，宋種采于南馥茶園，共7個品種（系）鳳凰茶.

1.2 實驗儀器和試劑

EX20型光學顯微鏡（舜禹光學科技有限公司），電熱恒溫水浴鍋（蘇州珀西瓦爾實驗設備有限公司），纖維素（貨號：C8270）、果膠酶（貨號：P8181）、Giemsa染液（貨號：G1015）均購置于索萊寶生物科技有限公司； 0.002mol/L 的8-羥基喹啉、甲醇和冰乙酸均為分析純試劑.

1.3 實驗方法

于上午9：00-10：00摘取生長狀態良好的幼嫩芽尖，剝去多余的幼嫩葉片，將葉原基部分放入0.002% 的8-羥基喹啉在4 C 下預處理 4h～5h ，蒸餾水清洗后加入新鮮固定液（甲醇：冰乙酸 ：3：1 ）固定4h以上，切取生長點部分及葉原基置于載玻片上，用 4% 纖維素酶和 1% 果膠酶的混合液進行酶解 2.5h 左右，低滲 10min 后用鑷子蘸取固定液后迅速搗碎使細胞分散，過火，晾干后用 1：10 吉姆薩染液染 10min ，用自來水緩慢沖洗殘留的染液[6]．置于EX20型光學顯微鏡的100倍油鏡下進行染色體的觀察，拍照.

1.4染色體數目確定及核型分析

每種茶樹選取30個染色體數目清晰的中期分裂相細胞，計數．從中選取3個染色體形態完整且分散良好的分裂相細胞進行核型分析，按照染色體的大小和形態特征（主要根據著絲粒位置），來進行染色體分組、排序和同源染色體配對．染色體核型分析參照李懋學[7]的標準，核型公式參照Levan等[8]對染色體類型的分類系統，核型類型參照Stebbins[9]對核型類型的分類標準，核型不對稱系數的計算參照Arano[10]的方法.

1.5 數據分析及統計方法

試驗數據采用Photoshop CS6進行染色體核型圖的制作和數據的測量，用Microsoft Office Excel軟件進行數據處理和與修圖工具相結合制作染色體核型模式圖[11]．利用SPSS11軟件，以平均臂比為橫坐標，核型不對稱系數為縱坐標，建立核型不對稱散點圖，同時采用DPS對7個鳳凰茶品種進行聚類分析.

2 實驗結果與分析

2.1 染色體數目及形態

對7個鳳凰茶種分別統計30個以上的處于分裂中期且分布較好的圖片進行計數， 85% 以上的細胞具有相同的數目時，為該品種茶樹的染色體數目．各品種的染色體形態為圓棒狀，大小不一，經數據統計，除了梅占由45條染色體組成， 2n=45 ，是三倍體外，其他品種染色體均是30條， 2n=30 ，為二倍體，如圖1、圖2所示．根據李懋學[7]的標準，運用Excel2010和AdobePhotoshopCS6軟件測量染色體長度，將姐妹染色單體進行配對，并按照由長到短進行排序方式制作染色體核型圖及核型模式圖（圖1和圖2）.

2.2 染色體核型分析

由表1分析得出，7個品種鳳凰茶的染色體均靠近中部、近中部和近端部著絲點區，核型不對稱系數范圍在 58.94%～63.85% 之間，大小相對接近，但又略有不同．根據李懋學的標準，屬于中小染色體，符合普遍茶樹的標準[7]，結果見表2．通過對7個品種鳳凰茶的核型進行分析，其中白葉和大烏葉的核型公式相同，都是 2n=2x=30=18m+10sm+2st ，初步推斷白葉與大烏葉的親緣較其它近一些.

蜜蘭香和梅占沒有明顯的近端部著絲粒（st）出現，長臂與短臂的長度差別相對較小，染色體結構相對于其他品系的染色體結構較為對稱．根據植物進化的方向由對稱向不對稱的方向進行[5]，說明蜜蘭香和梅占較其他種質原始．7種鳳凰茶按其平均臂比由小到大的排序分別為梅占（1.47）lt;桂花香（1.56）lt;蜜蘭香（1.58）lt;白葉（1.71）lt;大烏葉（1.79）lt;紅心沙仁（1.87）lt;宋種（1.90）．平均臂比越小，染色體的對稱程度越高，就越原始．進一步說明，梅占原始，宋種先進.

實驗結果與李斌[4]等研究認為喬木型、大葉種茶樹的核對稱性較高；大、小葉種茶樹及其一些變種的核型均為2A或2B型[12]的觀點一致．潮州鳳凰茶種質染色體核型較對稱，屬原始的2A型，而從福建引進的宋種為2B型，相對于其他種質來說進化程度較高.

2.37種鳳凰茶的核型進化趨勢

核型不對稱散點圖中，坐標點接近右上方表示核型不對稱性強，進化程度高．反之，坐標點越靠近左下角代表其不對稱性越低，種的進化程度相對也越低「13]．由圖3可知，7個鳳凰茶品種的不對稱性程度較大，宋種最靠圖的右上方，說明其進化程度高，而梅占最靠圖的左下方，表明其較其它品種原始.

以核型數據為基礎的聚類分析能更好地考察物種間的親緣關系[14]．本研究參照前人的方法，以染色體長度比、平均臂比和核型不對稱系數為原始數據進行聚類分析[15]．結果如圖4所示，鳳凰茶品種間的遺傳距離變化范圍較大，為1.1＼～25.0，表明品種間具有豐富的遺傳多樣性．當遺傳距離約為10時，7個品種明顯分為2類，第一類包括大烏葉、紅心沙仁和宋種，這3個品種的核型不對稱系數、臂比值較大，且染色體長度接近；第二類包括桂花香、梅占、白葉和蜜蘭香，這4個品種核型不對稱系數相對較小，且染色體相對長度范圍和臂比值也均相對較小.

3討論

植物染色體的基數在一個屬或更高的分類群中是穩定的，而且染色體的核型在進化演替過程中具有一定的規律性，可以根據植物染色體核型的分型推斷不同品系的進化程度[16]．植物界的進化趨勢是從核對稱型向核不對稱型發展的，在系統演化上，古老或原始植物的核型較為對稱，而在常見衍生或進化到更高水平的植物，核型大多數是不對稱核型[17]．潮州鳳凰茶種質資源豐富，經過幾百年的選育以及自然變異形成了今天的烏龍、紅茵、水仙、黃茶和色種等5個品系及近百個株系，目前課題組從染色體核型角度對7個鳳凰茶品種進行研究，發現鳳凰茶的核型均表現出不同程度的差異，7個鳳凰茶品種的進化程度為：梅占lt;桂花香lt;蜜蘭香lt;白葉lt;大烏葉lt;紅心沙仁lt;宋種．茶樹染色體制備的樣品采用的是莖尖幼葉包裹的葉原基和生長點部位，該部位細胞分裂能力活躍，相對于用茶樹根尖制備染色體取材容易，是該種質制備染色體的最佳材料．后期課題組將繼續對潮州其它鳳凰茶品種（系）進行核型分析，研究其親緣關系，為鳳凰茶優良種質資源篩選以及品種推廣應用等方面提供重要的依據.

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Karyotype and Cluster Analysis of Seven Fenghuang Tea Cultivars

YANG Dong-juan，GONG Xi，LIN Jin-tao，LIN Yang，LV Gui-ze，GUO Shou-jun， ZOU Xiang-hui （Collge of Life Sciences and Food Enginering，Hanshan Normal University，Chaozhou，Guangdong， 521041）

Abstract：In this study，the leaf primordium of seven Fenghuang tea cultivars were used as experimental materials to prepare chromosome slides andanalyze karyotype characteristics via enzymolysis-assisted cell wall removal and hypotonic treatment.Cluster analysis was subsequently performed to evaluate the genetic similarity among cultivars and explore their phylogenetic relationships．The results indicated that six Fenghuang tea cultivars （Baiye，Dawuye，Guihuaxiang，Hongxinsharen，Milanxiang， and Songzhong）were diploid with 3O chromosomes and karyotype formulas classified as 2A，2A，2A， 2A，2A，and 2B，respectively.Meizhan was identified as a triploid with 45 chromosomes anda karyotype formula of 2A. The karyotype formulas were as follows：2n=2x=3O=18m+10sm+2st（Baiye and Dawuye）；2n=2x=30=20m+8sm+2st （Guihuaxiang）；2n=2x=30 =14m+14sm+2st （Hongxinsharen）; 2n=2x=30=20m+10sm （Milanxiang）；2n=2x=30=16m ¹⁺ 10sm+4st （Songzhong）；and 2n=3x=45=33m+12sm （Meizhan）.The asymmetrical karyotype coefficients ranged from 58.94% to 63.85% .Based on karyotypeevolutionary trends，Baiye，Dawuye，Guihuaxiang，Hongxinsharen，Milanxiang，and Meizhan wereinferred to represent more primitive forms，whereas Songzhong exhibited relatively advanced evolution.The clustering results showed that the seven cultivars were divided into two major categories at agenetic distance of 1O：Category I included Dawuye，Hongxinsharen，and Songzhong；Category II comprised Guihuaxiang，Baiye，Meizhan，and Milanxiang.These findings provide cytological evidence for elucidating the evolution and genetic relationships among Chaozhou Fenghuang tea cultivars .

Key words：Fenghuang tea；chromosome number；karyotype analysis；cluster analysis

責任編輯 周春娟