深綠卷柏不同炮制品的理化性質及其止血作用的研究

中圖分類號：R945 文獻標識碼：A 文章編號：1007-6883（2025）03-0015-09

DOI：10.19986/j.cnki.1007-6883.2025.03.003

深綠卷柏（Selaginella doederleini Hieron.）是卷柏科（Selaginellaceae）卷柏屬（Selaginella）土生蕨類植物，別名石上柏、大葉菜．喜生長于陰濕林下或酸性土壤中，主產于兩廣、閩、浙、臺、云、貴等地區，被認為是民間用藥石上柏的正品，收載于《廣東省中藥材標準》（2010年）、《廣西省中藥材標準》（1990年）、《湖南省中藥材標準》（2009年）、《江西省中藥材標準》（1996年）和《上海市中藥材標準》（1994年）等．其性涼、味甘、微苦、澀，具有祛風除濕、清熱解毒、消腫止咳、抗癌止血等功效[1．深綠卷柏生品主要含黃酮（主要為雙黃酮）、生物堿、木脂素、有機酸和甾醇類等成分．具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗突變、抗病毒和降血壓等作用，對皮膚創傷也有一定的治療作用[2]．但炮制后卷柏的物性、化學成分及其藥性均會發生較大的變化[3-4].

常見的炒法炮制是直接將生藥置于一定溫度的鍋中加熱炒制為表面呈黃色、焦褐色或焦黑色；炒炭法是在武火或文火作用下，中藥表面化為焦黑色、內部焦黃色或焦褐色，炒炭的關鍵是“存性”[5].傳統制炭憑借經驗判斷炮制終點，主觀性較強；現代炮制工藝選擇炮制溫度、時間和火候等作為關鍵參數，并借助現代視覺技術、嗅覺技術通過顏色、氣味等定量識別炮制終點6．鄒婷及丁珂[8等利用pH、炭吸附力和色度值等對炭藥炮制的程度進行了表征，并表明了這些指標可作為中藥飲片“炒炭存性”的質量控制指標．程鈺潔[9]及楊海玲[10]等研究了炮制對炭藥顏色、抗氧化及止血作用的影響．炮制程度對深綠卷柏的化學成分及其生物活性的影響尚未見文獻報道，本研究借助化學分析法及現代感官儀器分析法對炒制程度不同深綠卷柏的理化特性與炮制程度的相關性進行探討，并對其體外抗氧化和止血作用進行了研究，為深綠卷柏的“炒炭存性”的研究方法提供實驗依據.

1材料與方法

1.1 材料與試劑

深綠卷柏于2022年11月11日采購于廣西玉林，置于陰涼干燥處貯藏備用．為確保實驗的嚴謹，故炮制與進行實驗之前先進行了形態鑒定與顯微鑒定，確認所購買的藥材為《中國植物志》所載的深綠卷柏.

檸檬酸、檸檬黃、 95% 乙醇、無水乙醇、石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、DMSO、氯化鈉、二氯甲烷和無水硫酸鈉試劑均為AR級：廣州化學試劑廠；DPPH為AR級：國藥集團化學試劑有限公司；抗壞血酸為AR級：阿拉丁試劑（上海）有限公司；pH緩沖劑：鄰苯二甲酸氫鉀（ ?pH4.0 ）和混合磷酸鹽（ Φ_pH6.86 ）：上海儀電科學儀器股份有限公司；娃哈哈牌純凈水：淘寶娃哈哈官方旗艦店.

1.2 儀器

美的C22-HT2218HM型電磁爐：廣東美的生活電器制造有限公司；RHP-250型高速多功能粉碎機：浙江永康市榮浩工貿有限公司；賽多利斯PB-10酸度計：賽多利斯科學儀器有限公司；T6新世紀紫外可見分光亮度計：北京普析通用儀器有限公司；JZ-350色差儀：上海首立實業有限公司；BSA124S-CW電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；600A中藥粉碎機：浙江榮浩工貿有限公司；A-1000S水流抽氣機：上海愛朗儀器有限公司；N-1200B旋轉蒸發儀：上海愛朗儀器有限公司；FDU-2110凍干機：OKYORIKAKIKAI CO.LTD；BILON98-IIID超聲波細胞破碎機：上海比朗儀器有限公司；MμLtiskan MK3酶標儀：賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；HERAEUS311恒溫培養箱：廣東丹利科技有限公司；PEN3電子鼻：德國AIRSENSE公司.

1.3 試驗方法

1.3.1深綠卷柏樣品預處理與測定

深綠卷柏生品及其炮制品的制備參照《中國藥典》2015版第一部及陳國佩的方法處理[4-5]．炭吸附力的測定參考丁珂等的方法[7-8]，按公式計算：吸附力 吸附量/樣品量．酸堿度的測定參照楊海玲[0]等的方法進行．色差值的測定參照楊海玲[10]等的方法，總色差按公式計算： ΔE=[（ΔL^*）?2+ （Δa^*）^?2+（Δb^*）^?2]?0.5 ，本文利用色差儀表征不同炮制程度深綠卷柏的色澤，并用 ΔL^* 、 a^* 、 L^* 和b^* 等特征值．其中 a^* 表示顏色的紅綠色度， a^*gt;0 表示偏紅、 a^*lt;0 表示偏綠； b^* 表示黃藍色度， b^*gt;0 表示偏黃、 b^*lt;0 表示偏綠; L^* 值表示顏色的明亮度，越大表示明亮度越高，反之越暗[-13]；而 ΔL^* 值表示炮制品與生品的顏色的亮度的差異.

1.3.2揮發性成分提取及色譜條件

揮發性成分提取：稱取 1.00g 深綠卷柏生品或炮制品裝人 15mL SPME樣品瓶，加蓋密封；于 48 C 下頂空萃取（ 65μm 萃取頭DVB/PDMS）吸附 20min ，然后在 250‰ 的GC-MS進樣口解吸 5min

色譜條件：采用AgilentHP-5石英毛細管色譜柱（ 30m×0.25mm×0.25μm） ，進樣口溫度250°C ；載氣He；流量 1.00mL/min ，采用不分流方式進樣．程序升溫（起始溫度 50^qC ，以5 C?min^-1 升至 140‰ ，再以 10°C?min^-1 升至 240°C ）．利用NIST95和Wiley7譜庫檢索，并結合相關文獻和匹配度，對各分離組分進行定性分析；同時采用峰面積歸一化法定量.

1.3.3 電子鼻分析

樣品準備與測定：將深綠卷柏的三種不同炮制品及生品粉末，分別稱取 5g ，置于一次性杯中，用雙層保鮮膜封口，用橡皮筋扎緊，在 50^qC 溫 5min ，采用頂空吸氣法，先打開電子鼻裝置開關，預熱 30min ，每次檢測之前先用潔凈的空氣清洗傳感器陣列，準備采樣進氣時直接將進樣的探針插入含樣品的一次性樣品杯中，電子鼻進行測定，每個樣品重復測3次，選取穩定性最佳一次作為檢測結果，選取檢測響應處于較平穩的（51＼～55）的數值進行分析[14]．測定實驗室室溫21 °C ；相對濕度 47% ：采樣時間1s/組；傳感器自清洗時間 60s ；傳感器歸零時間 10s ；實驗藥材樣品準備時間 5s ；進樣體積流量 400mL/min ；分析采樣時間 60s ．電子鼻傳感器性能描述[15]．電子鼻所測數據用Winmuster軟件進行主成分分析（PCA）、載荷分析（LOA）、線性判別分析（LDA）和傳感陣列分析.

1.3.4抗氧化性的測定

水提物的制備．仿照中藥熬煮提取的方法，水煮沸提取三次．分別取炒炭、炒黃、炒焦和深綠卷柏生品粉末，第1次料液比為 1：10 （ Δg/mL ，煮沸 30min ；第2次加料液比為 1：8 C Δ_g/mL ，煮沸20min，第3次加料液比為 1：5 （ Δg/mL ），煮沸 10min ，藥液合并．合并后的藥液經離心、過濾、減壓濃縮和真空冷凍干燥操作后，得水提取干粉，加干燥劑密封至于干燥器保存備用.

DPPH自由基清除能力的測定．藥液對DPPH自由基清除能力參照黃四新等[16]人的方法并加以改進后，分別測定深綠卷柏生品及其三種不同炮制品水提物的DPPH自由基清除能力.

1.3.5 體外止血作用的測定

玻片法測凝血時間．滴加牛血于清潔的培養皿上，血滴直徑約為 5～10mm ．依次分成3組，用于進行平行實驗三次，每組4份．分別加入深綠卷柏生品及其炮制品的水提物，以云南白藥水提物和生理鹽水分別作為陽性對照和空白對照，準確地記錄凝血時間．實驗時使用針頭挑動牛血并觀察，能夠挑起纖維蛋白絲時停表，計為凝血時間．依照下列公式計算凝血時間縮短率.

凝血時間縮短率 （%）= （空白組凝血時間-給藥組凝血時間）／（空白組凝血時間 ×100% ）．計算完畢后，根據所得結果對樣品的體外止血作用進行比較分析[17].

1.4 數據處理

每個指標的測定重復三次實驗，取均值．用SPSS 25.0軟件對測定結果進行顯著性差異分析，應用Origin2024軟件對試驗所得結果進行圖形分析處理.

2 結果與分析

2.1炮制程度對深綠卷柏pH值及吸附力的影響

由圖1可知，深綠卷柏的炮制品的 pH 值均比生品大，且隨著炒炭程度的增加pH值逐漸升高，且四個樣品之間的 pH 值之間存在顯著性差異.可能是深綠卷柏中含有機酸成分和弱酸性多酚類物質（如雙黃酮等），炒制后有機酸因分解或揮發，含量降低；多酚類物質因氧化成醌，導致樣液的 pH 增大[7]．高溫加熱使炭藥的化學成分發生變化，毛維倫等[18]將 pH 作為炭藥“存性”的一個質量控制指標.

由圖2可知，藥樣的吸附力隨著深綠卷柏炒

制程度的增加而增大，炭品和炒焦品的吸附力均比生品和炒黃品大（ Plt;0.05 ）．吸附是表面的物理過程，樣品的比表面積越大，則吸附能力越強[19]．炒黃的深綠卷柏藥樣的吸附力與生品之間沒有差異性，表明炮制初期吸附力變化不大，炭素生成量極少．隨著炮制程度的增加，其吸附力顯著上升，炭品達到最大值，炭品和炒焦品的吸附力與炒黃品和生品存在顯著性差異，此結果表明炮制程度的“不及”可使吸附力相對降低．許臘英[20]等提出炭吸“吸附力”作為控制炒炭存性質量標準控制指標.

2.2 炮制程度對深綠卷柏總色差的影響

肉眼觀察深綠卷柏生品為其植物本身的深綠色，隨著炮制程度的加深，深綠卷柏炮制品粉末的顏色也隨之加深，深綠卷柏炒黃品為黃綠色，深綠卷柏炒焦品為焦褐色，深綠卷柏炭品為焦黑色.

色差儀測定深綠卷柏炮制品和生品的色度值見表1和圖3．由表1可知，隨著炒炭程度的增加深綠卷柏的 L^* 值減小、 ?a^* 值增加、 b^* 值先減而后增，而炒炭樣的 L^* 值、 a^* 值和 b^* 值均變為0．此外 ΔE= [（ΔL^*）^?2+（Δa^*）^?2+（Δb^*）^?2]^?0.5 計算值表明： ΔE_###gt;ΔE_###gt;ΔE_## ，深綠卷柏的炮制品與生品的總色差值隨著炒炭程度的加深而增加，借助樣品的色差特征值能明顯區分生品及其三種炮制品，色差儀測定的結果與人眼觀察的結果一致.

2.3炮制程度對深綠卷柏揮發性成分種類和含量的影響

SPME-GC-MS測定樣品揮發性成分的統計結果見圖4與圖5．深綠卷柏生品、炒黃品和炒焦分別共檢出23、59和17種化合物，炭品未檢測到揮發性成分．由圖4與圖5可知隨著炮制程度的加深，炒黃品揮發性化合物的種類達到最大；揮發性烷烴和酮類的含量在生品中最高，醇類的含量在炒黃品中最高，而酯類含量在炒黃品和炒焦品中最高．炮制過程的高溫會不斷破壞次生代謝產物的結構，導致其中的有些成分含量增加、減少或消失，同時在高溫炮制下也會產生新的物質[21].

2.4炮制程度對深綠卷柏香氣特征的影響

2.4.1深綠卷柏生品及其炮制品的傳感器陣列分析

圖6所示為對樣品氣味響應值構建的氣味指紋雷達圖，這10個傳感器氣味響應值為一定差異值，其中傳感器6號W1S、7號W1W、9號W2W和2號W5S響應強度明顯，其它傳感器響應較弱．四種樣品在10個傳感器上總響應強度值的順序為：深綠卷柏炒焦品（26）gt;炒黃品（22） gt; 生品（20）gt;炭品（18），深綠卷柏炒焦品和炒黃品高于生品，而深綠卷柏炭藥的氣味響應強度值最小.

2.4.2 深綠卷柏不同炮制品的主成分分析 （PCA）

由圖7顯示，深綠卷柏生品、炒黃深綠卷柏、炒焦深綠卷柏和炒炭深綠卷柏這四個樣品在PC1（第一主成分）和PC2（第二主成分）的貢獻率之和為 99.72% ，貢獻率的數值接近于1，表明樣品的區分顯著，其中PC1（第一主成分）的貢獻率為 79.63% ，PC2（第二主成分）的貢獻率為 20.09% ．深綠卷柏生品、炒黃深綠卷柏和炒焦深綠卷柏在第一主成分和第二主成分上，均有不同程度的重迭，炒炭深綠卷柏在第一、第二主成分上明顯區別于其它三個樣品，PCA分析能夠很好地將深綠卷柏炭藥與其它三種樣品明顯區別開[22].

2.4.3 深綠卷柏不同炮制品的線性判別分析（LDA）

將深綠卷柏生品、炒黃深綠卷柏、炒焦深綠卷柏和炒炭深綠卷柏電子鼻氣味響應值進行線性判別LDA分析，其結果如圖8顯示，累計方差貢獻率為 99.42% ，接近1．第一主成分貢獻率為 97.29% ，第二主成分貢獻率為 2.13% ．這兩個主成分已經基本上代表了深綠卷柏生藥及其炮制品的氣味主要信息特征．在第一主成分貢獻率中，四個樣品相距較遠，在第二主成分中，深綠卷柏生品、炒焦深綠卷柏和炒炭深綠卷柏之間較為接近，但深綠卷柏生品及其炮制品可以被電子鼻顯著區分[22].

2.5炮制程度對深綠卷柏總黃酮含量的影響

由圖9可知，與深綠卷柏生品比較，炒黃、炒焦和炒炭深綠卷柏中總黃酮含量分別減少了 41.75% /56.04% 和 74.73% ：

深綠卷柏各樣品的總黃酮含量會隨炮制程度的加深而逐漸明顯減少，而且各樣品的總黃酮含量存在顯著性差異（ Plt;0.05） ：

2.6炮制程度對深綠卷柏抗氧化活性的影響

炮制程度對深綠卷柏抗氧化活性的影響由圖10可見，深綠卷柏生品的DPPH自由基清除能力達到

95.48% ，明顯高于深綠卷柏炭品的清除能力 31.72% 0 （Plt;0.05） ．體外抗氧化活性：深綠卷柏生品 gt; 深綠卷柏炒黃品 gt; 深綠卷柏炒焦品 gt; 深綠卷柏炭品，其變化趨勢與總黃酮相似．與深綠卷柏生品相比較，深綠卷柏炭品的DPPH自由基清除能力和黃酮含量分別降低了 57.65% 和 74.73% ．深綠卷柏中含的雙黃酮類是具有較強的清除自由基作用的天然多酚類物質產物[4]，但是炮制所導致的藥樣的抗氧化活性降低與黃酮類受熱后的結構破壞相關[23-24].

2.7炮制程度對深綠卷柏鞣質含量的影響

炮制對深綠卷柏中鞣質含量的影響見圖11.深綠卷柏各樣品的鞣質含量會隨炮制程度的加深而逐漸明顯增大，深綠卷柏生品的鞣質含量與炮制品存在顯著性差異（ Plt;0.05 ），多數止血中藥（如槐米、茅根、丹皮、卷柏等）經炒炭以后，鞣質含量增加[25].

2.8不同炮制程度的深綠卷柏的止血效果

止血是一個非常復雜的生理過程，本實驗是將新鮮牛血加入不同炮制程度的深綠卷柏粉末后與其空白組生理鹽水進行對比，深綠卷柏生品及其炮制品對體外牛血的凝血時間的影響見表2．數據分析表明：深綠卷柏炭品與深綠卷柏生品、炒黃品及炒焦品的體外凝血作用的差異性顯著（ Plt;0.05 ，表明了炭品的正血能力比生品及炒黃和炒焦卷柏均強，與文獻報道[3，26]結果一致.

3討論

炒法炮制是中藥炮制的常用方法之一，它對藥物性能功效及理化性質均產生直接的影響[27]，因此炮制程度的判別就顯得尤為重要，過去僅憑經驗鑒別往往主觀性強、重復性差；近些年來，許多學者將顏色、氣味等指標的量化技術（智能感官）運用到中藥炮制研究中[11，19]，可將主觀模糊的顏色、香味特征進行客觀化、數字化[12-13]，將炮制程度轉化為可量化的指標，實現精準量化控制及判別．這不僅可以為中藥炮制工藝的優化提供有力支持，還可以提高中藥炮制的標準化水平.

生深綠卷柏的外觀整體基調是綠色， ?a^* 值為負數； L^* 值最大，色澤最亮； b^* 值較小，綜合表現為深綠色．經炒制后， a^* 值也從負值變為正值、 b^* 值變化程度較小、 L^* 值降低明顯，綜合色澤先從綠色逐漸變黃色加深到棕褐色再到烏黑色，當深綠卷柏炒炭的 a^* 和 b^* 值均為0時，表明非彩色； L^*=0 時，對應明度黑色，與肉眼鑒別結果一致.

利用電子鼻獲取了不同炮制程度深綠卷柏氣味的整體信息，通過PCA和LDA構建基于氣味特征的判別模型，能較好對不同炮制程度的藥樣進行區分[12.19]．傳感器陣列分析中W1S、W1W、W2W和W5S是影響不同炮制程度樣品分類的重要因素．從深綠卷柏生品到焦品，隨著炒制過程中炮制程度加深，藥樣的內含物質所進行的美拉德反應[28]、氧化反應及熱分解等[18，27]使得藥樣的香氣增強．深綠卷柏不同炮制品的傳感器陣列分析趨勢與GC-MS所測定的揮發性化合物結果基本一致.

炮制過程中藥所經歷的色澤、氣味及關鍵藥物成分的數量和質量改變與其藥性的變化呈一定的因果關系．深綠卷柏生品為綠色、炭品為焦黑色．古人認為青（綠）屬木、紅屬火，黑屬水．五行相生相克規律中“木生火”即“青（綠）生紅”，與深綠卷柏生品具有活血通經之作用相對應；“水克火”即“黑克紅”，因此有“以黑勝紅”“紅見黑則止”，與深綠卷柏炒炭后可化瘀止血功效相對應[29-30].深綠卷柏生品中總黃酮（活血作用和擴血管作用）[31]和有機酸（活血作用和抑制血小板聚集、抗血栓作用）[32]含量最高．隨著炮制程度的加大，即從生品到炭品，深綠卷柏中總黃酮含量下降、鞣質含量上升、炭素增加（以炭吸附力評價）及有機酸降低（以 pH 值評價），止血作用逐漸增強．鞣質是具有收斂功效的結構較為復雜的多元酚類化合物，能在血管破裂處形成硬塊，通常被認為是中藥炒炭后產生止血作用的主要物質基礎[3，29-30]，其特性是易和蛋白質結合形成大分子物質，收縮微血管、在血管破損的地方形成硬塊，阻止血液外流，達到止血的目的[29-30]，而炭素為疏松多孔的內部結構，具有物理性吸附的作用，與血液接觸之后能夠激活其中的凝血因子，使血小板裂解并釋放血小板因子，從而促進血液凝固，也有助于止血[32]．中藥炒炭止血作用的增強并不單單是某一種成分含量的改變，可能與鈣離子、鞣質及炭素等多因子之間的協同作用有關[29，32].

本研究發現隨著炮制程度的加深，可見單純依靠個別指標成分的含量來對深綠卷柏炭“適中”進行確定，可能無法得到準確、客觀的結果．除了借助現代儀器手段跟蹤監測關鍵成分指標（黃酮、鞣質、 pH 和炭吸附力）的變化外，智能感官（電子眼和電子鼻）技術的應用可彌補傳統炮制程度肉眼鑒別的主觀性和模糊性，為炮制程度的質量控制研究提供新思路.

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A Study on the Physicochemical Properties and Hemostasis of Different Processed Products of Selaginella doederleinii Hieron

YANG Yong-li，YANG Dong-juan，LING Ya，GUO Ying-ying，GUO Shou-jun* （College of Life Sciences and Food Engineering， Hanshan Normal University，Chaozhou， Guangdong， 521041）

Abstract：The effects of processing on the physical properties （such as pH，carbon adsorption， and color），chemical components （including volatile compounds，total flavonoids，and tannins），antioxidant activity，and hemostasisof Selaginella doederleinii Hieron were investigated．The results indicate that the pH value，carbon adsorption，and chroma of the samples gradually increased with the rising processing temperature and duration，while the content of total flavonoids showeda decreasing trend and tannin content showed an increasing trend．Among the processed products，the fried Selaginella doederleinii Hieron possessed the richest variety of volatile compounds；specifically，the contents of volatile alkanesand ketones were highest in the raw samples，while alcohols were most abundant in the fried samples，and esters showed the highest content in both the fried and charred samples. The DPPH free radical scavenging activity was highest in the raw samples and lowest in the carbonizedsamples.The hemostatic efect was observed to gradually strengthen from raw to processed （charcoal） products. These changes in constituents also reflect the process of“charcoal processing” intraditional Chinese medicine．The quality of raw Selaginella doederleini Hieron and its processed products can be controlled notonly through their physicochemical indexes but alsovia non-destructive testing methods such as color diffrence meter and electronic nose.These methods overcome subjective and fatigue defects in sensory evaluation，enabling real time，rapid，and accurate identification of the original drug and its processed products of different degrees，thereby achieving standardization.

Key words： Selaginella doederleinii Hieron； processing； physical properties； chemical compo-nents；electronic nose；antioxidant activity；hemostasis