急性氨影響副溶血弧菌的基因表達譜

DOI：10.16424/j.cnki.cn32-1807/r.2025.04.011

[關鍵詞]副溶血弧菌；急性氨；RNA-seq；基因表達；功能表型 [中圖分類號]Q933 [文獻標志碼]A [文章編號] 1674-7887（2025）04-0362-08

Thegene expression profile of Vibrioparahaemolyticus exposed to acute ammonia*

WANGJian*，LUOXi*，LIXue，ZHANGYiquan，LURenfet** （Department of Clinical Laboratory，Nantong Third People's Hospital，AffiliatedNantongHospital3ofNantong University，Jiangsu 226006）

[Abstract]Objective：To investigatetheefectsofacuteammoniaonthegeneexpressonandfunctionalphenotypesof Vibrio parahaemolyticus（VP）.Methods：Usingacontrol groupwithcultureconditionsthatdidnotincludeNH4Clandanexperimental group with NH4Cl added at a final concentration of 71.68mg/L （simulating acute ammonia exposure），the RNA-seq assay was employedtoanalyzethegeneexpressionprofileofVP.Additionall，aseriesofphenotypicexperiments-includingcrystal violetstaining，motilityrelatedphenotpeassessment，andcyclicdiguanylate（c-di-GMP）contentmeasurement-werecoucted toexploretheimpactofacuteammoniaonthesefunctionalphenotypes.Results：Acuteammoniaexposureled to significant alterations inthetranscription levelsof 661 genes，including 379downregulated genesand282upregulatedgenes.These geneswereprimarilyconcentrated incellularmetabolicpathways，particularlythosecloselyrelated toaminoacidtransport andmetabolism，as wellasenergyproductionandconversion.Furthermore，acuteammoniaalsoregulatedthetranscriptionof several genes associated with biofilm formation， c -di-GMP metabolism，flagellar function，and key virulence factors.However， acuteammoniadidnotexhibitregulatoryefectsonthefunctional phenotypesthatcorrespond tothesegenes.Conclusion： Acuteammonia induced extensivetranscriptional changes inalargenumberof genes within VP，especiallthoserelated to metabolism.However，ithadnoregulatoryefectonfunctional phenotypessuchasbiofilmformation，c-di-GMPmetabolism， or motility.

[Key words] Vibrio parahaemolyticus;acute ammonia; RNA-seq; gene expression; functional phenotype

副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus，VP）廣泛存在于海水和海洋生物中，是引起沿海地區細菌性食物中毒的\"頭號元兇\"。人們通常因食用了被其污染的海產品而感染該菌，從而引起以發熱、腹瀉、嘔吐等為主要癥狀的急性腸胃炎。VP能表達多種致病性毒力因子，如耐熱直接溶血素（thermostabledirecthemolysin，TDH）、TDH相關溶血素（TDH-related hem-olysin，TRH）、I型分泌系統（type III secretion system，T3SS）和VI型分泌系統（typeVI secretionsystem，T6SS）等。其中，TDH和TRH主要具有溶血活性和腸毒性，是其致病的關鍵因素之一。VP能表達T3SS1和T3SS2，T3SS1主要具有細胞毒性和小鼠致死毒性，而T3SS2則主要與腸毒性密切相關5。此外，VP還能表達T6SS1和T6SS2，T6SS1主要發揮抑菌作用，而T6SS2則主要具有細胞黏附活性，且與生物膜形成呈正相關[6-8]。

生物膜是細菌在固體表面生長時所形成的具有一定3D結構的菌落聚集體，是細菌抵御不利生長環境的一種重要策略。VP生物膜的形成需要胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）、IV型菌毛、鞭毛等結構的參與[。操縱子 cpsA-K 和 scvA-O 與EPS的合成密切相關，二者均與生物膜形成呈正相關[。VP表達的甘露糖敏感血凝素（編碼基因為VP2692-2707）和受幾丁質調節的菌毛（由操縱子 pilABCD 編碼）均屬V型菌毛，是黏附因子，也與生物膜形成呈正相關。VP具有極鞭毛和側鞭毛，極鞭毛介導菌體在液體中游動（swimming），而側鞭毛則與菌體在固體表面群集性爬動（swarming）相關，二者均參與生物膜3D 結構的生成[9.12]。此外，胞外DNA、胞外蛋白質、莢膜多糖（capsularpolysaccharide，CPS）等成分也對生物膜形成產生影響[13-14]。

毒力因子表達、生物膜形成、運動性等關鍵通路受第二信使分子環二鳥苷酸（cyclic diguanylate，c-di-GMP的緊密調控15。該分子的合成受鳥苷酸環化酶所催化，而其降解則依賴于磷酸二酯酶的催化[5]。鳥苷酸環化酶的酶活性存在于GGDEF結構域，而磷酸二酯酶的酶活性存在于EAL或HD-GYP結構域之中[5]。有些酶蛋白僅含有這3種結構域之一，而有些酶蛋白則可能同時具有GGDEF結構域和EAL結構域。以VP為例，其能夠表達28種含有GGDEF結構域的蛋白質、14種含有EAL結構域的蛋白質、16種同時含有GGDEF和EAL結構域的雜合蛋白質，以及5種含有HD-GYP結構域的蛋白質。然而，在這些眾多的蛋白質中，僅少部分如VPA0198[7]、GefA[18]、TpdA[19] ScrC^[20] 和ScrG等得到了相對深人的研究。

VP是凡納濱對蝦、中國對蝦、斑節對蝦等重要的養殖蝦種急性肝胰壞死病的病原體，感染后發病率和死亡率均極高，給蝦類養殖業帶來了極為嚴重的經濟損失22。甲殼類動物，包括蝦類，其代謝蛋白質的終產物主要為氨，這使高密度養殖的蝦場中，氨容易大量積累，進而嚴重危害蝦類健康[23-24]。此外，氨的積累還可以塑造蝦類的腸道菌群多樣性和組成[25]。然而，盡管氨是一種有害物質，但目前關于氨是否對蝦場中常見的病原菌（如弧菌等）產生影響，還鮮有文獻報道。氨是否影響VP毒力因子表達、生物膜形成、運動性及 c-di-GMP 代謝等細胞途徑值得進一步研究，這有助于了解在高氨環境下VP的生長、繁殖、致病和傳播規律，從而采取針對性措施減少疾病的發生，提高蝦的成活率和生長速度，提高經濟效益。本研究通過向培養液中添加終質量濃度為71.68mg/L 的 NH₄Cl 凡納濱對蝦 48h 致死濃度），以此模擬急性氨暴露的環境條件，進而探究了氨對VP基因表達譜以及功能表型所產生的影響。結果表明，急性氨能對VP的全局性基因表達產生顯著影響，尤其是在代謝相關基因的表達方面影響尤為突出。不過，急性氨對于VP的生物膜形成、運動性等重要功能表型卻并未產生影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株VP RIMD2210633（O3：K6型，高毒力，具有生物膜形成能力）由南通市第三人民醫院檢驗科保存。

1.1.2主要試劑 2.5% BactoTM Heart Infusion（HI）肉湯培養基購自BDBioscience;氯化銨 （NH₄Cl） 購自北京索萊寶科技有限公司;TRIzolReagent 購自Invit-rogen公司； 2× TaqPCRMastermix、FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預混試劑以及SuperReal熒光定量預混試劑彩色版（SYBRGreen）等購自天根生化科技（北京）有限公司;微生物環二鳥苷酸（c-di-GMP）ELISA試劑盒購自Mskbio公司。

1.1.3主要儀器NanoDrop 200 分光光度計購自Thermo公司；實時熒光定量PCR儀購自Roche公司；細菌培養箱購自北京六一生物科技有限公司。

1.2培養方法取 15μL 甘油菌種，接種于 5mL HI肉湯中，隨后置于 37°C.200r/min 的搖床中連續培養 12h 。按1：50的比例，將培養產物轉接至 5mL 新鮮的HI肉湯中，在相同的溫度和轉速下連續培養至 0D₆₀₀ 值達到1.4。按 1：1000 的比例稀釋，轉接至5mLHI 肉湯或含有 71.68mg/LNH₄Cl 的HI肉湯中[25]，置 37°C.200r/min 條件下連續培養至對數中期 （OD₆₀₀≈1.4） ，收集菌體細胞。

1.3VP生長曲線分析按1：2000的稀釋比例，將VP的預培養物接種至 10mL 的HI肉湯或含有71.68mg/LNH₄Cl 的HI肉湯中。充分混勻后，將菌液分裝至96孔細胞培養板中，每孔 200μL ，每組設置12個生物學重復。采用寧波新芝生物科技股份有限公司生產的MGC-200型微生物生長曲線分析儀，測量VP在 37°C.800r/min 條件下的生長曲線。

1.4轉錄組測序（RNA-seq）分析 收集在HI肉湯以及添加了 71.68mg/L （20號 NH₄Cl 的 HI肉湯中培養的菌體，將其分別溶解于 1mL 的TRIzol中。隨后，送至蘇州金唯智生物技術有限公司開展后續處理，包括RNA提取 Ω，cDNA 文庫構建、文庫純化以及文庫測序等步驟，測序采用 Ilumina Hiseq 300PE平臺進行。以在HI肉湯中培養的菌體基因表達水平作為對照組，標記為 ；以在含有 71.68mg/L （204號 NH₄Cl 的HI肉湯中培養的菌體基因表達水平作為實驗組，標記為“ 71.68mg/L^′ 。為保證結果的可靠性，每組均設置了3個生物學重復。測序數據質量評估和序列比對以及差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）分析按之前的描述開展2。DEGs的篩選標準為基因表達水平變化倍數達到2倍以上，同時 q?0.05. 。對DEGs進行GO、KEGG以及同源蛋白簇（clusteroforthologous groups of proteins，COG）通路分析。

1.5實時定量 PCR（quantitative real-time PCR， qRT-PCR）收集在HI肉湯以及添加了 71.68mg/L NH₄Cl 的HI肉湯中培養的菌體，并采用TRIzol法提取總RNA。采用FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預混試劑盒，將總RNA逆轉錄成cDNA。隨后，以cDNA為模版，采用SuperReal熒光定量預混試劑彩色版（SYBRGreen）進行qRT-PCR分析。以16SrRNA的表達量為內部參照，采用 2^-ΔΔα 法定量分析靶基因的轉錄水平27，引物序列見表1。

1.6生物膜結晶紫染色實驗按 1：2000 的稀釋比例，將VP的預培養物 （OD₆₀₀≈1.4 接種至 10mL 的HI肉湯或含有 71.68mg/LNH₄Cl 的HI肉湯中，充分混勻后，分裝至24孔細胞培養板中，每孔 1.5mL 每組至少4個生物學重復。將24孔細胞培養板置 的條件下連續培養 12h 。測量游離菌液的濁度 （OD₆₀₀） ，并去除游離菌液。用去離子水洗滌生物膜，加入 2mL 0.1% 結晶紫溶液染色 30min 。隨后，用去離子水洗去未結合的結晶紫，加人 2mL15% 冰乙酸溶解結晶紫，并測量 OD₅₇₀ 的值。生物膜生成量用 OD₅₇₀ 除以 0D₆₀₀ 表示。

1.7菌落褶皺實驗將VP的預培養物 （OD₆₀₀≈1.4） 點種于HI平板或含有 71.68mg/LNH₄Cl 的HI平板上，而后在 37^°C 孵箱中靜置培養 12～36h ，觀察菌落形態，拍正面照。

1.8 c -di-GMP測定收集在HI肉湯以及添加了71.68mg/L （2號 NH₄Cl 的HI肉湯中培養的對數中期（20 （OD₆₀₀≈1.4） 的菌體細胞，并重懸于預冷的PBS中。冰水浴條件下，充分裂菌。 4^°C 下 12 000g 離心 5min 。用微生物c-di-GMPELISA試劑盒測定上清液中的c-di-GMP含量;用BCA蛋白定量試劑盒測定上清液中的總蛋白含量。

1.9動力表型實驗取 2μL 預培養物 （OD₆₀₀≈1.4） 接種至HI半固體平板（含有 0.3% Difco noble agar）內部或點種于HI固體平板（含有 2% Difco noble agar）平板表面，于 37°C 下靜置培養特定時長，通過測量菌苔直徑研究VP的 swimming 和 swarming表型。其中，對照組不添加 ΔNH₄Cl ，而實驗組添加 71.68mg/L 的 NH₄Cl ，每組至少5個生物學重復。

1.10透明度表型檢測將VP的預培養物 （OD₆₀₀≈ 1.4）劃線接種至HI平板或含有 71.68mg/L （204 NH₄Cl 的HI平板上，而后在 37°C 孵箱中靜置培養 24h ，觀察菌落形態，拍正面照。

1.11HeLa細胞毒活性檢測按 1：1 000 的稀釋比例，將VP的預培養物接種至 5mL 的 HI 肉湯或含有71.68mg/LNH₄Cl 的HI肉湯中，置 37°C.200r/min 的條件下連續培養，直至對數中期 （OD₆₀₀≈1.4） 。收集菌體細胞，并用無酚紅的DMEM洗滌3次，而后重懸于無酚紅的DMEM中。按2.5倍的感染復數感染HeLa細胞，置 37^°C，5%CO₂ 孵箱中孵育 ³h 。采用乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒，按照說明書步驟操作，測定被感染的HeLa細胞的LDH釋放量，以評估VP的HeLa細胞毒活性。

1.12統計學方法除RNA-seq外，其他每種實驗都至少重復3次，每次至少設置3個生物學重復，采用Excel軟件進行數據處理，計量數據以 表示，并運用Student'st檢驗， Plt;0.01 為差異有統計學意義。

2結果

2.1急性氨不影響VP的生長由圖1可見，VP在HI 肉湯培養基中的生長速率，與在含有 71.68mg/L NH₄Cl 的HI肉湯中的生長速率相比差異無統計學意義。因此，急性氨對VP的生長無影響。

2.2急性氨引起VP全局性基因表達本研究共計測定了6個Illumina文庫，每個文庫包含的原始測序片段（raw read）均超過1444萬條。原始數據（Raw data）已上傳至美國國立生物技術信息中心（NationalCen-terforBiotechnologyInformation，NCBI）數據庫，對應的查詢號為PRJNA1164955。原始測序片段經過濾，獲得合格序列Cleanreads）。合格序列與VPRIMD2210633的基因組總匹配率和單一匹配率均在 96% 以上，說明數據良好，滿足進一步分析需求。

以“ ”組細菌的基因表達水平為參照，分析“ 71.68mg/L^′ 組中菌的基因表達水平，如圖2A所示，共鑒定出661個DEGs，其中379個基因下調，282個基因上調。利用KEGG數據庫對DEGs參與的信號通路進行注釋，如圖2B所示，DEGs只注釋到細胞代謝（metabolism）和人類疾?。╤umandiseases）信號通路上，分別包含671和3個基因。利用COG數據庫對DEGs編碼的蛋白質進行注釋和分類，如圖2C所示，位于前5的富集依次集中在氨基酸轉運與代謝（amino acid transport and metabolism） 能量產生與轉換（energy production and conversion）、無機離子的轉運與代謝（inorganic ion transport and metabo-lism）、一般功能預測基因（general function predictiononly）和未知功能基因（functionunknown）。利用GO數據庫對DEGs功能進行分類，如圖2D所示，共有153個DEGs被富集到分子功能（molecular function），147個DEGs 富集到細胞組分（cellular component）以及94 個DEGs 富集到生物過程（biological process）。此外，DEGs包含24個假定調控子蛋白基因、5個c-di-GMP代謝相關基因、5個T3SS2相關基因、4個T6SS1相關基因、10個T6SS2相關基因、2個Mfp蛋白基因、1個EPS合成基因、2個CPS多糖基因、1個極鞭毛相關基因以及7個側鞭毛相關基因（表2）。

2.3轉錄組數據驗證 本研究共挑選了7個已知功能或具備進一步研究價值的DEGs進行qRT-PCR驗證。如圖3所示，qRT-PCR證明的調控關系和RNA-seq證明的調控關系是一致的，說明RNA-seq結果可靠。

2.4急性氨不影響VP生物膜相關表型DEGs中包含生物膜形成相關的基因，如VPA1405、mfpA、VP2523等，提示急性氨可能調控VP的生物膜形成。然而，結晶紫染色結果表明，無論培養基中是否添加NH₄Cl ，VP的生物膜形成能力均無顯著差異（圖4A）。菌落褶皺實驗也顯示，在 0mg/L 和 71.68mg/L 的NH₄Cl 條件下，VP形成的菌落形態相同（圖4B）。這表面添加 71.68mg/LNH₄Cl 對VP的生物膜形成能力并無影響。此外，DEGs中還涵蓋了5個c-di-GMP代謝相關基因，即tpdA、VP2366、scrM、VPA1429和VPA1547，以及2個CPS合成相關基因VP0220和VP0228。然而，表型實驗結果證實，在添加 71.68mg/L NH₄Cl 的條件下，VP的c-di-GMP代謝（圖4C）和CPS合成（圖4D）均未受到顯著影響。

2.5急性氨不影響VP的運動能力DEGs中包含1個極鞭毛相關基因（VP2252）和7個側鞭毛生成相關基因，暗示急性氨可能調控VP的運動能力。然而，表型實驗結果證實，在添加 71.68mg/LNH₄Cl 的條件下，VP的 swimming 和 swarming 表型均未受到顯著影響（圖5），說明急性氨不影響VP的運動能力。

注：A，結晶紫染色實驗；B，菌落褶皺實驗；C，胞內c-di-GMP濃度;D，CPS相位轉換;ns， Pgt;0.01 。

3討論

VP是咸水蝦養殖場中常見的病原體，能引起蝦類急性肝胰壞死病，給蝦類養殖業帶來了極大的危害。蝦類分解蛋白質產生氨，使高密度養殖場中的氨大量積累，進而影響蝦類健康和其腸道內的菌群多樣性和組成[25。然而，氨是否會對蝦場中常見的病原菌，如VP產生影響，還未見報道。本研究通過RNA-seq研究了模擬急性氨的生長環境對VP基因表達譜的影響。結果表明，急性氨共導致661個基因的轉錄水平顯著性改變，包括379個下調基因和282個上調基因。DEGs主要集中在細胞代謝方面，尤其是涉及氨基酸轉運與代謝以及能量產生與轉換方面，說明VP可能利用 NH₄⁺ 作為氮源。

DEGs 中包含2個Mfp蛋白基因（mfpA 和 mfpB）. 1個EPS合成相關基因（VPA1405）以及1個受幾丁質調節的菌毛基因 （pilA） ），這些基因的表達水平均呈現下調趨勢。當Mfp相關基因發生突變時，菌株在固體表面上的生物膜形成能力會減弱，且形成的生物膜更容易脫落[28；受幾丁質調節的菌毛是黏附因子，與生物膜形成能力呈正相關；而EPS合成相關基因發生突變的菌株，不僅生物膜形成能力降低，而且在固體表面上僅能形成光滑型的菌落\"]。DEGs中還囊括5個c-di-GMP代謝相關基因，其中包括tdpA 和scrM。TpdA是一種觸發式磷酸二酯酶，即當c-di-GMP水平低或其自身缺乏磷酸二酯酶活性時，TpdA能夠促進其自身基因的表達[19]。若TpdA缺失，VP的swimming能力降低;而TpdA過表達時，VP的swim-ming和swarming能力均會增強，但生物膜形成能力則會下降[。scrM是操縱子scrMNO操縱子的首基因，而 Scr0 正向調控生物膜形成，然而 ScrM 的具體功能還未被研究[29]。此外，DEGs中還包括了2個CPS合成相關基因、1個極鞭毛合成相關基因以及7個側鞭毛合成相關基因。鞭毛介導的細菌運動有利于生物膜3D結構的生成12，而CPS高表達則使菌落呈不透明狀且抑制生物膜的形成[13.30]。這些結果似乎提示急性氨可能對VP生物膜形成 ?c -di-GMP代謝以及運動性等功能表型具有調控作用。然而，表型實驗結果顯示，急性氨對VP的這些表型并無顯著影響。這可能是因為這些表型受到多基因網絡的調控，而單一環境刺激（如急性氨暴露）可能僅部分擾動了該網絡，未能觸發表型變化的閾值。此外，本研究采用的氨質量濃度 （71.68mg/L） 模擬了急性暴露，但未涵蓋長期暴露或梯度濃度處理，因此可能未達到引發表型變化的臨界條件。最關鍵的是，氨基酸代謝和能量轉換通路的富集提示VP可能將 NH₄⁺ 作為氮源，進行代謝重塑以適應高氨環境。

DEGs中包含4個T6SS1相關基因（均被下調）、10個T6SS2相關基因（3個上調、7個下調）以及5個T3SS2相關基因（2個下調、3個上調）。T6SS1主要具有抑菌功能，與VP的競爭作用有關;T6SS2則主要具有細胞黏附活性，并能促進生物膜形成[6-8]。此外，T3SS2與腸毒性有著密切的關聯[5。然而，T6SS1、T6SS2以及T3SS2均為多基因編碼產物，急性氨僅能調控其中的部分基因，且對同一位點內的基因調控關系也有差異。因此，急性氨是否能夠調控T6SS1、T6SS2以及T3SS2相關的功能表型，仍需進一步研究。此外，DEGs中還有24個調控子基因，包括一些編碼 _{GntR，MarR，LysR} 等家族的全局性調控子的基因。其中， cpsQ 是 依賴性的全局性調控子，必須結合c-di-GMP才能調控基因轉錄[29]。CpsQ對生物膜形成相關基因以及T6SS2合成相關基因均具有調控作用[29.31]。CpsR 是霍亂弧菌 VpsR 的同源蛋白，參與調控EPS合成相關基因的表達，但并不是必需的，其僅在CPS不表達的情況下，促進EPS的表達[32。然而，其他22個調控子基因的功能還完全未知，有必要進一步深入研究。

總之，本研究利用RNA-seq技術研究了急性氨對VP基因表達的影響，結果顯示，急性氨共導致661個基因出現顯著性差異表達，主要集中于細胞代謝通路，特別是與氨基酸轉運與代謝、能量產生與轉換密切相關的基因。此外，急性氨還對一些生物膜形成相關基因、c-di-GMP代謝相關基因、鞭毛基因以及一些關鍵毒力因子基因的轉錄發揮調控作用。然而，對于這些基因所對應的功能表型，急性氨卻未表現出調控作用。本研究的開展，有利于人們理解VP對急性氨刺激的響應機制。

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