安羅替尼對(duì)卵巢透明細(xì)胞癌最適濃度探討

[摘要] 目的 探討安羅替尼對(duì)卵巢透明細(xì)胞癌的作用機(jī)制及最適濃度。方法 體外培養(yǎng)卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞，以腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞及腎乳頭狀細(xì)胞癌細(xì)胞為對(duì)照癌細(xì)胞，研究不同濃度安羅替尼（5、10、15、20μmol/L）對(duì)3種癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力的影響。通過與腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞及腎乳頭狀細(xì)胞癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比，考察安羅替尼對(duì)卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞的作用優(yōu)勢(shì)，將其在臨床中的地位提前。結(jié)果 安羅替尼在5、10、15、20μmol/L的濃度下均可有效抑制卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞、腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞及腎乳頭狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。其中，安羅替尼對(duì)3種癌細(xì)胞的最佳作用濃度均在5～10μmol/L范圍內(nèi)。然而，在3種癌細(xì)胞中，安羅替尼對(duì)卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞的抑制作用更顯著。結(jié)論 安羅替尼對(duì)卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞的作用相比于腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞及腎乳頭狀細(xì)胞癌細(xì)胞具有較明顯的作用優(yōu)勢(shì)，最適作用濃度為5～10μmol/L。

[關(guān)鍵詞] 安羅替尼；卵巢透明細(xì)胞癌；作用機(jī)制；最適濃度

[中圖分類號(hào)] R737" """"[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A """""[DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2025.21.009

Study of the optimal concentration of anlotinib for ovarian clear cell carcinoma cells

ZHU Tianyu¹， LI Shuxuan¹， MA Yuxuan¹， TANG Yi¹， ZHOU Yongjing²

1.School of Medical， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， Jiangsu， China; 2.Oncology and Chemotherapy Department， the First People’s Hospital of Zhenjiang， Zhenjiang 212000， Jiangsu， China

[Abstract] Objective To investigate the mechanism and optimal concentration of anrotinib on ovarian clear cell carcinoma. Methods Ovarian clear cell carcinoma cells were cultured in vitro， by using renal clear cell carcinoma cells and renal papillary cell carcinoma cells as control cancer cells， and the effects of different concentrations of anlotinib （5， 10， 15， 20μmol/L） on the proliferation， migration， and invasion capabilities of three cancer cell lines were investigated. Compared with the experimental results of renal clear cell carcinoma cells and renal papillary cell carcinoma cells， the advantages of anlotinib on ovarian clear cell carcinoma cells were investigated and advanced its position in clinical practice. Results Anlotinib at the concentrations of 5， 10， 15， and 20μmol/L can effectively inhibit the proliferation， migration， and invasion ability of ovarian clear cell carcinoma cells， renal clear cell carcinoma cells， and renal papillary cell carcinoma cells. Among them， the optimal action concentration of anlotinib on all three cancer cells fell in the range of 5-10 μmol/L. However， in the three cancer cells， anlotinib was more potent in ovarian clear cell carcinoma cells. Conclusion The effect of anlotinib on ovarian clear cell carcinoma cells has obvious advantages over renal clear cell carcinoma cells and renal papillary cell carcinoma cells， with the optimal concentration of 5-10 μmol/L.

[Key words] Anlotinib; Ovarian clear cell carcinoma; Mechanism of action; Optimal concentration

卵巢透明細(xì)胞癌（ovarian clear cell carcinoma，OCCC）是一種罕見且預(yù)后較差的卵巢上皮性腫瘤，發(fā)病率占所有卵巢癌的5%左右^[1]。OCCC的治療方法主要包括手術(shù)和化療。手術(shù)是核心方法，包括全子宮切除、雙側(cè)附件切除、大網(wǎng)膜切除及盆腔淋巴結(jié)清掃。化療常用順鉑、紫杉醇等藥物，但由于其生物學(xué)特性特殊，傳統(tǒng)化療手段效果不佳，預(yù)后較差，目前靶向治療和免疫治療成為研究重點(diǎn)。因此，開發(fā)治療OCCC患者有效且安全的靶向藥物具有十分重要的意義。

安羅替尼作為一種多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，在多種實(shí)體瘤中顯示出抗腫瘤活性。王煥煥等^[2]研究顯示安羅替尼在卵巢癌、子宮體癌及子宮頸癌治療中具有顯著優(yōu)勢(shì)。單藥治療時(shí)，安羅替尼患者的復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率和治療相關(guān)死亡率均低于其他單藥治療，顯示其良好的抗腫瘤活性，且對(duì)復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性婦科腫瘤也有較好的療效，安全性可控。聯(lián)合治療中，安羅替尼與化療聯(lián)用療效顯著，毒性較低，安全性良好。總之，多項(xiàng)臨床研究表明安羅替尼在治療婦科腫瘤方面有一定的優(yōu)越性。

1 "資料與方法

1.1" 實(shí)驗(yàn)材料

OCCC細(xì)胞、腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞、腎乳頭狀細(xì)胞癌細(xì)胞購(gòu)自南京潤(rùn)科生物科技公司；胎牛血清購(gòu)自鎮(zhèn)江高新區(qū)易科佰實(shí)驗(yàn)儀器經(jīng)營(yíng)部；McCoy’s 5A Medium、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）、青霉素/鏈霉素溶液、胰酶、多聚甲醛、結(jié)晶紫染色液、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑-8（cell counting kit-8，CCK-8）、細(xì)胞凍存管、培養(yǎng)瓶、移液槍、96/24/6孔板購(gòu)自南京市鼓樓區(qū)勵(lì)研生物科技中心。

1.2" 實(shí)驗(yàn)方法

用0、5、10、15、20μmol/L濃度梯度的安羅替尼處理OCCC細(xì)胞、腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞及腎乳頭狀細(xì)胞癌細(xì)胞3種細(xì)胞系。通過CCK-8實(shí)驗(yàn)和肉眼觀察實(shí)驗(yàn)確定適宜藥物濃度范圍。結(jié)合Transwell和劃痕試驗(yàn)評(píng)估藥物對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的影響，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析確定藥物最適濃度。

1.2.1" 細(xì)胞培養(yǎng)" ①細(xì)胞復(fù)蘇：將–80℃凍存的細(xì)胞于37℃水浴快速解凍，轉(zhuǎn)移至含10ml McCoy’s 5A完全培養(yǎng)基（含胎牛血清）的15ml離心管中，1000轉(zhuǎn)/min離心8min，棄上清液。用10ml新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，混勻后轉(zhuǎn)入T25培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。②細(xì)胞傳代：細(xì)胞長(zhǎng)到培養(yǎng)瓶表面積約90%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用1ml無菌PBS洗滌后加入1ml胰酶中消化。1min后加入2ml McCoy’s 5A Medium終止消化。收集細(xì)胞懸液，1000轉(zhuǎn)/min離心8min。棄上清液，加入5ml新鮮完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1∶4比例傳代（腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞按1∶3比例傳代）。③細(xì)胞凍存：將狀態(tài)良好的OCCC細(xì)胞按前述步驟收集，加入適量?jī)龃嬉海?0%胎牛血清+10%二甲基亞砜）。混勻后，每管分裝1ml細(xì)胞懸液，標(biāo)記后依次置于4℃ 30min、–20℃ 2h，最后轉(zhuǎn)入–80℃保存。長(zhǎng)期保存需移至液氮罐。

1.2.2" 實(shí)驗(yàn)藥物母液的配制 "先將安羅替尼膠囊按比例溶解于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，配制成2mmol/L母液。隨后用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，分裝后4℃保存。最后按實(shí)驗(yàn)需求分別稀釋至5、10、15和20μmol/L的工作濃度。

1.3" CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OCCC細(xì)胞以3000個(gè)/孔接種于96孔板（100μl/孔）。細(xì)胞貼壁后，分別加入0、5、10、15、20μmol/L安羅替尼溶液（100μl/孔，3復(fù)孔）。培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗，加入100μl基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每孔加10μl CCK-8溶液（避免氣泡），37℃孵育1.5h。待培養(yǎng)基呈橙紅色后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm吸光度并記錄數(shù)據(jù)。細(xì)胞存活率=[（As–Ab）/（Ac–Ab）]×100%，其中，As：實(shí)驗(yàn)孔吸光度（加培養(yǎng)基、藥物、CCK-8）；Ac：對(duì)照孔吸光度（加CCK-8和培養(yǎng)基，不加藥物）；Ab：空白孔吸光度（只加培養(yǎng)基）。

1.4" Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OCCC細(xì)胞、腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞及腎乳頭狀癌細(xì)胞以每孔10 000個(gè)接種于24孔板，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。隨后按0、5、10、15、20μmol/L濃度梯度給藥，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。48h后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至Transwell小室，繼續(xù)培養(yǎng)24h。之后用PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定15min。PBS再洗滌2次，結(jié)晶紫染色15min。蒸餾水沖洗，晾干后拍照記錄。

1.5" 安羅替尼對(duì)細(xì)胞的殺傷作用影響

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且狀態(tài)良好的OCCC細(xì)胞接種于6孔板，每孔10 000個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時(shí)，用無菌PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次，洗去漂浮細(xì)胞。向6孔板內(nèi)加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入濃度為0、5、10、15、20μmol/L的安羅替尼溶液，在給藥后0、48h同一視野拍照。

2" 結(jié)果

2.1" CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在5～10μmol/L濃度范圍內(nèi)，安羅替尼對(duì)OCCC細(xì)胞的存活率抑制效果最顯著，且呈劑量依賴性。CCK-8檢測(cè)證實(shí)安羅替尼在5～10μmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)OCCC細(xì)胞增殖具有顯著抑制作用，見圖1。

2.1.1" Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 "安羅替尼在5～10μmol/L濃度范圍內(nèi)顯著抑制細(xì)胞遷移（Plt;0.05），且抑制效果隨濃度增加而增強(qiáng)，見圖2。

A.0μmol/L安羅替尼組；B.5μmol/L安羅替尼組；C.10μmol/L安羅替尼組；D.15μmol/L安羅替尼組；E.20μmol/L安羅替尼組；F.細(xì)胞數(shù)隨安羅替尼變化曲線

2.1.2" 安羅替尼對(duì)細(xì)胞的殺傷作用影響" 細(xì)胞計(jì)數(shù)分析顯示隨著安羅替尼濃度的逐步提升，細(xì)胞數(shù)量表現(xiàn)出顯著下降趨勢(shì)，在5～10μmol/L范圍內(nèi)細(xì)胞數(shù)量下降最明顯（Plt;0.05），見圖3。

A.0μmol/L安羅替尼組；B.5μmol/L安羅替尼組；C.10μmol/L安羅替尼組；D.15μmol/L安羅替尼組；E.20μmol/L安羅替尼組

2.2" 3種癌細(xì)胞的CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

比較3種癌細(xì)胞的CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。雖然安羅替尼對(duì)3種癌細(xì)胞的最適作用濃度均為5～10μmol/L（第1組實(shí)驗(yàn)使用mg為單位，第2組實(shí)驗(yàn)使用μmol/L為單位），但CCK-8實(shí)驗(yàn)的光學(xué)密度（optical density，OD）值（表示樣本吸光度）明顯不同。在相同安羅替尼濃度作用下，OCCC細(xì)胞的OD值更小，表明在相同情況下OCCC細(xì)胞存活數(shù)及細(xì)胞活性最差，見圖4。

2.3" 細(xì)胞存活率隨末尾濃度變化趨勢(shì)

CCK-8實(shí)驗(yàn)中觀察到細(xì)胞存活率隨末尾濃度增加呈上升趨勢(shì)，見圖5。

3" 討論

OCCC作為卵巢上皮性癌的一種重要亞型，展現(xiàn)出獨(dú)特的生物學(xué)特性。OCCC不僅發(fā)病率較高，且其生物學(xué)行為與其他類型的卵巢上皮性癌有所不同，使其在臨床診斷和治療中具有特殊的重要性。卵巢癌的發(fā)病率在亞洲相比于東歐較低，但亞洲國(guó)家的透明細(xì)胞癌的比例較高^[3]。與卵巢高級(jí)別漿液性癌相比，OCCC患者中BRCA1/2胚系突變的發(fā)生率較低，僅2.1%～6.0%的患者存在該位點(diǎn)的突變。因此有研究認(rèn)為OCCC的發(fā)生與家族史無明顯相關(guān)性^[4-5]。OCCC臨床表現(xiàn)與其他卵巢癌相似，常見腹痛、腹脹及腹部腫塊等非特異性癥狀，多數(shù)患者確診時(shí)已進(jìn)展至晚期。CT和MRI等影像學(xué)檢查可評(píng)估腫瘤大小、位置及轉(zhuǎn)移情況。盡管目前的治療手段相對(duì)有限且療效不盡如人意，但隨著對(duì)其分子機(jī)制的深入探究，有望在未來研發(fā)出更有效的治療方案。早期的診斷與治療對(duì)提升患者的預(yù)后質(zhì)量具有至關(guān)重要的作用。

本研究通過一系列細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，包括細(xì)胞增殖、遷移及殺傷實(shí)驗(yàn)，深入探討安羅替尼對(duì)OCCC細(xì)胞的作用機(jī)制。細(xì)胞存活率隨末尾濃度增加而呈上升趨勢(shì)，該結(jié)果與理論預(yù)期相悖。經(jīng)排查，排除操作誤差和器材問題等系統(tǒng)誤差，并通過重復(fù)實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)查閱排除新趨勢(shì)的可能性，最終分析認(rèn)為，PBS清洗96孔板時(shí)，安羅替尼殺死的死細(xì)胞團(tuán)未被完全清除，殘留的無活力、但線粒體酶仍有活性的細(xì)胞導(dǎo)致OD值升高，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使存活率呈假性上升。

本研究利用CCK-8實(shí)驗(yàn)評(píng)估安羅替尼抑制OCCC細(xì)胞增殖的效果；Transwell實(shí)驗(yàn)探究其對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明安羅替尼可顯著抑制OCCC細(xì)胞的增殖，且對(duì)其遷移能力有顯著的抑制作用。因此得出結(jié)論，安羅替尼在體外通過抑制OCCC細(xì)胞的增殖和遷移，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用，其機(jī)制可能與抑制關(guān)鍵信號(hào)通路蛋白表達(dá)有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示安羅替尼對(duì)OCCC細(xì)胞的作用呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性特征。此外，鑒于多種限制因素，體外實(shí)驗(yàn)顯示安羅替尼在5～10μmol/L的濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出最顯著的抑制效果。相比其他細(xì)胞株，安羅替尼對(duì)OCCC細(xì)胞抑制作用尤為顯著，這一發(fā)現(xiàn)為OCCC的臨床治療提供新的藥物選擇和理論依據(jù)。

安羅替尼耐藥性機(jī)制可能與腫瘤微環(huán)境適應(yīng)性改變有關(guān)，如其他血管生成信號(hào)通路的激活或下游基因突變。據(jù)報(bào)道應(yīng)用微小核糖核酸和外源性趨化因子（C-X-C基序）配體2有可能增加安羅替尼的敏感度^[6]。在安羅替尼的生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)方面，Lu等^[7]發(fā)現(xiàn)血清激肽釋放酶相關(guān)肽酶5和L1細(xì)胞黏附分子水平與非小細(xì)胞肺癌對(duì)安羅替尼作為三線治療的反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)。ALTER0303研究提示激活的循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞最小計(jì)數(shù)/基線是安羅替尼治療非小細(xì)胞肺癌預(yù)測(cè)進(jìn)展生存期的潛在生物標(biāo)志物。基于該試驗(yàn)患者循環(huán)DNA的研究確立3個(gè)預(yù)測(cè)指標(biāo)：胚系和體系細(xì)胞突變負(fù)荷、非同義和同義突變負(fù)荷、循環(huán)DNA的不利突變?cè)u(píng)分，并建立預(yù)測(cè)模型。腫瘤突變指數(shù)越低安羅替尼療效可能越好^[8-9]。目前，安羅替尼治療惡性腫瘤仍缺乏明確的生物標(biāo)志物，深入研究對(duì)篩選適宜患者具有重要意義。后續(xù)開展裸鼠實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建裸鼠模型，并通過定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和基因芯片技術(shù)，從分子層面解析安羅替尼對(duì)OCCC細(xì)胞的作用機(jī)制，將更有利于為腫瘤患者提供個(gè)性化治療方案，改善患者的治療效果和預(yù)后。

基于現(xiàn)有的臨床研究數(shù)據(jù)和正在進(jìn)行的試驗(yàn)，安羅替尼有望在未來被批準(zhǔn)用于OCCC的治療。這一前景表明OCCC患者有可能從安羅替尼的聯(lián)合治療中獲益。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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