基于形態和DNA條形碼的小火蟻檢疫鑒定

摘要

小火蟻Wasmannia auropunctata原產于新熱帶地區，被世界自然保護聯盟（International Union for Conservation of Nature，IUCN）列為全球最具威脅的入侵物種之一。2022年，小火蟻在廣東汕頭地區首次被發現，成為中國大陸一種新發現的重大外來入侵有害生物。為實現快速、準確鑒定小火蟻，本研究采用形態學方法對小火蟻標本進行分析，編譯了沃氏蟻屬Wasmannia 10種工蟻和10種蟻后的檢索表，并利用DNA條形碼技術對形態學鑒定結果進行了驗證。本研究為小火蟻的準確鑒定提供了重要的技術參考。

關鍵詞

小火蟻; 形態特征; DNA條形碼; 鑒定; 入侵種

中圖分類號：

S 4130

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2024482

Quarantine identification of the little fire ant Wasmannia auropunctata based on morphology and DNA barcoding

HE Xunuo1， HUANG Jiaofen2， HU Shuqing1， LIN Li1， LI Xianfeng1， WEI Shuang1，XU Qiang1， WU Mutao1， LIU Haijun1*

（1. Guangzhou Customs Technology Center， Guangzhou 510623， China; 2. Foshan Customs

Integrated Technology Center， Foshan 528000， China）

Abstract

The little fire ant Wasmannia auropunctata， originally native to the Neotropical region， has been listed by the International Union for Conservation of Nature （IUCN） as one of the world’s most threatening invasive alien species. In 2022， W.auropunctata was detected for the first time in Shantou， Guangdong province， marking its emergence as a newly identified major invasive pest species in China’s mainland. To enable rapid and accurate identification of this species， a morphological method was employed to examine W.auropunctata specimens and dichotomous keys were compiled for workers and queen ants of 10 species within the genus Wasmannia. Additionally， DNA barcoding was subsequently used to verify the morphological identification. This study provides a valuable technical reference for the precise quarantine identification of W.auropunctata.

Key words

Wasmannia auropunctata; morphological identification; DNA barcoding; identification; invasive species

小火蟻Wasmannia auropunctata（Roger， 1863），又稱金刻沃氏蟻、小紅火蟻、電蟻、西印度毒刺蟻、可可樹蟻、光點小火蟻等［12］，隸屬于膜翅目Hymenoptera，蟻科Formicidae，切葉蟻亞科Myrmicinae，沃氏蟻屬Wasmannia Forel，1893。該蟻原產于中南美洲熱帶地區，可生存于熱帶和亞熱帶的廣大地區［34］，現已在北美洲、大洋洲、亞洲、非洲的多個國家和地區廣泛分布［1， 59］。小火蟻主要借助人類活動特別是跨境貿易進行遠距離傳播［1011］。2021年，中國臺灣地區首次報道發現小火蟻［2］，2022年，廣東汕頭發現其自然種群［12］，小火蟻成為我國新發重大外來入侵有害生物。

在入侵地，小火蟻可形成種群數量達數百萬頭的多蟻后型超級蟻群［13］，對人類社會和生態系統構成巨大威脅。人類被其蜇咬可引起劇烈疼痛，甚至導致過敏反應，嚴重時可能引發休克［1， 1416］。家畜和寵物眼部遭其蜇咬可能導致失明或角膜病變［15， 17］。在農業生產上，小火蟻與蚧蟲、蚜蟲等半翅目害蟲形成共生關系，不僅增加了害蟲種群數量，還可能傳播植物病毒和真菌，間接加重農作物病害發生，影響農業產量［1820］。小火蟻還會對生態系統造成破壞，它通過掠奪食物資源和侵占棲息地，導致本地節肢動物、爬行動物和鳥類種群數量下降，破壞生態平衡，威脅生物多樣性［2122］。小火蟻具有繁殖能力強、擴散速度快、適應能力強、生態危害大等特點［23］，世界自然保護聯盟（International Union for Conservation of Nature，IUCN）將其列為全球100種最具威脅的入侵物種之一。

我國東南、華南及西南的大片區域均是小火蟻的適生區，潛在適生區面積達195.43萬 km2，涵蓋海南、廣東、廣西、云南、臺灣等省區［2425］，為防止小火蟻在我國進一步擴散蔓延，及早發現并準確鑒定小火蟻顯得尤為重要。本研究旨在通過形態學和分子生物學方法提高小火蟻的鑒定準確性。研究采集了小火蟻的形態學特征照片，豐富了其形態特征圖譜。同時，利用線粒體COⅠ基因的DNA條形碼技術對形態學鑒定結果進行驗證，從而建立一套綜合的小火蟻檢疫鑒定方法。這為小火蟻的預警監測和口岸檢疫鑒定提供了重要的技術支持，有助于及時發現和準確鑒定，對防止其進一步擴散，保護我國生態環境安全具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 供試蟲樣

本試驗所用小火蟻樣品（卵、幼蟲、蛹、工蟻和蟻后）于2022年6月采集自廣東汕頭，所有樣品均浸泡于無水乙醇中，放置在-30℃冰箱保存備用。

1.2 主要儀器和試劑

DVM6超景深數碼顯微鏡（德國徠卡公司）、Stemi508體視顯微鏡（德國卡爾蔡司公司）、PowerCycler SL96 PCR儀（德國耶拿公司）、ChemiDoc XRS+凝膠成像系統（美國伯樂公司）、Dneasy血液及組織核酸提取試劑盒（德國凱杰公司）、高保真Taq酶（日本寶生物工程公司）、無水乙醇等。

1.3 試驗方法

1.3.1 形態學鑒定

將待測蟲樣（卵、幼蟲、蛹、工蟻和蟻后）經75%乙醇清洗后，利用Stemi508體視顯微鏡進行整體形態觀察、解剖處理及樣本整姿，然后利用DVM6超景深數碼顯微鏡對蟲體關鍵形態結構進行測量和拍照，最后結合文獻資料［3， 2627］依據工蟻形態特征進行種類鑒定。

1.3.2 分子生物學鑒定

1.3.2.1 DNA提取和PCR擴增

取待測蟲樣工蟻3頭，按照凱杰公司血液及組織核酸提取試劑盒說明書分別提取單頭工蟻全基因組DNA。PCR擴增引物采用線粒體CO Ⅰ基因通用引物，LCO1490：5′GGTCAACAAATCATAAAGAT

ATTGG3′和HCO2198：5′TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA3′［28］。PCR反應體系為：去離子水21.8 μL，10×buffer 3 μL，dNTP mixture 2.5 μL，100 μmol/L上、下游引物各1 μL，DNA模板0.5 μL，LA Taq酶0.2 μL，共30 μL。擴增程序：94℃ 5 min;94℃變性40 s，50℃退火1 min，72℃延伸40 s，35個循環;72℃延伸10 min。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，將出現目標條帶的PCR產物送廣州天一輝遠生物科技有限公司進行雙向測序。

1.3.2.2 序列分析和鑒定

通過SnapGene 6.0.2軟件修正雙向測序結果中出現的異常峰型堿基并剔除兩端引物序列，獲得待測蟲樣線粒體COⅠ基因序列片段。將試驗獲得的核酸序列在NCBI（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov）的GenBank數據庫和國際生物基因條形碼網站（www.boldsystems.org）的BOLDSYSTEM數據庫中進行比對鑒定。

1.3.2.3 構建系統發育樹

下載NCBI數據庫中與待測蟲樣序列相似性排名前5的小火蟻COⅠ基因序列（登錄號為：MF925747.1、KR106300.1、KR106449.1、KR106448.1、KR106355.1），同屬另外2個近緣種W.rochai（登錄號為：EF459822.1、EF459824.1、MK767256.1、MK759603.1、EF459823.1）和W.scrobifera（登錄號為：MK767894.1、MK759135.1、MK769287.1、MK767750.1、MK767711.1），以及草地鋪道蟻Tetramorium caespitum（登錄號為：MK091886.1、JN294263.1、KT885054.1、MZ607404.1、HQ954639.1）的相應序列片段各5條，共20條COⅠ基因序列片段。以草地鋪道蟻作為外群，用MEGA 11.0.13的Clustal W模型對所有序列進行比對，剪除相似性較差的堿基區域后，采用鄰接法（neighborjoining，NJ）構建系統發育樹（檢驗方法選擇Bootstrap，檢驗次數選擇1 000，計算模型選擇pdistance，空位處理選擇部分刪除，刪除比例設置為50%，其他參數為系統默認）。

2 結果與分析

2.1 形態鑒定結果

2.1.1 沃氏蟻屬工蟻主要形態特征

根據Longino等［26］、Cuezzo等［27］的研究，將沃氏蟻屬工蟻形態特征歸納總結如下：小型蟻類，體具立毛。頭部和并腹胸具有發達的網狀刻紋。頭長略大于寬，頭寬大于并腹胸。頭頂緣中部微凹，額頂角鈍圓;復眼大，側生，復眼下緣平坦。上顎咀嚼緣具5齒或更少;須式為3∶2。唇基發達，分隔兩額葉。觸角窩被額葉遮蔽，額脊遠離復眼（除W.scrobifera）。觸角溝淺窄、未達頭側緣，觸角溝上緣呈脊狀隆起。觸角11節，柄節長度不超過頭頂緣，觸角末2節膨大形成觸角棒。并腹胸肩角明顯，中并胸腹節縫不明顯，并胸腹節刺發達。前足基節稍大于中、后足基節，前足脛節刺呈梳櫛狀。腹柄節2節，前腹柄節具結前柄，腹柄結刻點明顯，側面觀前腹柄結高于后腹柄結，背面觀后腹柄結寬于前腹柄結，前腹柄節具腹柄下突。后腹部橢圓形，具立毛（除W.iheringi），第1節最長，超過后腹部長度的2/3，腹末具螫針。

2.1.2 小火蟻形態特征

2.1.2.1 工蟻

體長1.0～1.5 mm。頭部具縱紋（在近后頭緣處交織成網狀），額區具刻點，覆蓋不規則橫紋，唇基具數條淺縱紋（圖1h）;并腹胸具復雜網狀刻紋和刻點（圖1e），腹柄節具鱗狀刻點（圖1g），觸角溝內具淺刻紋和1條短縱紋（圖1d）。復眼位于頭兩側近中部，大而凸出（圖1d）;無單眼。額脊發達呈脊狀延伸至后頭緣，形成觸角溝上緣，觸角溝淺而明顯（圖1h）。觸角11節，柄節細長，未達后頭緣，鞭節具豐富的毛狀感受器，觸角棒2節（圖1c）。唇基前緣弧形，后緣中央深凹（圖1h）。上顎咀嚼緣具5齒（端齒最大，基齒最小），基緣無齒突（圖1i）。前胸背板肩角明顯，無前中胸背板縫（圖1b）。并胸腹節具1對直立毛，短于前中胸立毛;并胸腹節刺長而尖銳，背面觀略內彎（圖1f）;并胸腹節氣孔圓形，位于刺基下方（圖1a）。腹柄節2節，具深棕色塊狀斑。前腹柄結側面觀強烈呈矩形（圖1g），高于后腹柄結，具1～2對與并胸腹節長度相近的立毛;腹柄結的前、后面均明顯，前面幾乎垂直于結前柄和背面，呈明顯的階梯狀輪廓（圖1g）;結前柄與結近等長，其腹前緣具短銳刺。后腹柄結背面觀寬于前腹柄結（圖1g）。后腹部刻點微弱，各節散生細長彎曲立毛（圖1b）;第1節背板具近圓形毛基片，均勻分布（圖1f）;腹末螫針發達。體淺棕色至褐色，全身具稀疏針狀立毛，后腹部光亮（圖1a）。

2.1.2.2 蟻后

體長 4.5～5.0 mm，顯著大于工蟻（圖2b）。體色呈棕褐色，顏色深于工蟻，并腹胸發達，背面觀，前中胸寬闊，表面密布細直條狀縱刻紋（圖2d）。頭近三角形，具2個復眼及3個單眼，復眼大而明顯，在頭近中部側緣凸出（圖2a）。前腹柄節結前柄與結近等長（圖2c）。并胸腹節刺略尖，長約等于基寬。雌蟻具兩對翅，產卵后翅折斷脫落，留有殘基（圖2b）。后腹柄結所占身體比例明顯小于工蟻。后腹部寬橢圓形;第1節被板無毛基片，近端部2/3深棕色（圖2d）。其余類似工蟻。

2.1.2.3 雄蟻

體長接近蟻后，并腹胸發達（圖3a）。頭小，近圓形，具2個復眼及3個單眼，復眼大而凸出，在頭部占有較大比例，且顯著大于工蟻和蟻后（圖3c）。觸角13節;柄節很短，不抵前單眼（圖3c）;鞭節末端不膨大成觸角棒（圖3b）。觸角溝短、淺，極不明顯（圖3c）。具兩對翅，無并胸腹節刺，前腹柄結不呈矩形（圖3b）。腹末無螫針，而是特化成發達的外生殖器，呈細長指狀，向腹部彎曲，末端寬約0.05 mm（圖3b）。

2.1.2.4 卵、幼蟲和蛹

卵乳白色，橢圓形，長約0.18 mm，寬約0.12 mm（圖4a）。幼蟲乳白色，呈蠕蟲狀，腹部微弱分節，體柔軟，體表具稀疏短毛，無附肢（圖4b）。蛹白色，蛹體通透，離蛹，復眼紅褐色，形態似工蟻（圖4c）。

2.1.3 沃氏蟻屬工蟻和蟻后分類檢索表

沃氏蟻屬目前共報道有11種。Longino等［26］于2007年首次發表了沃氏蟻屬工蟻（9種，不含W.villosa）和蟻后（10種）的形態分類檢索表。Cuezzo等［27］于2015發表了新種W.longiseta，并將工蟻檢索表擴充至10種（新增該物種）。本文對Longino等的蟻后檢索表進行了翻譯，工蟻檢索表是在Cuezzo等的基礎上，結合AntWeb官網（www.antweb.org）相關資料進行了譯校修訂。因W.villosa工蟻、W.longiseta蟻后形態數據缺失，本文工蟻檢索表不含W.villosa，蟻后不含W.longiseta。

2.1.3.1 沃氏蟻屬工蟻分類檢索表

2.2 DNA條形碼鑒定結果

2.2.1 PCR擴增及比對

以3頭供試昆蟲樣品DNA為模板的PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測所得產物約為700 bp（圖5）。將雙向測序后的序列經過堿基校對并剔除上下游引物后獲得658 bp的DNA片段，通過SnapGene比對分析，3頭供試昆蟲堿基序列完全一致（序列已上傳至NCBI數據庫，登錄號為：PQ217979）。將測得的COⅠ基因序列在NCBI數據庫中進行BLAST比對，與登錄號為MF925747.1的小火蟻樣品［29］序列相似性為99.54%。在國際生物基因條碼網站（www.boldsystems.org）的BOLDSYSTEM數據庫進行比對，結果同樣顯示為小火蟻。綜上所述，供試昆蟲為小火蟻。

2.2.2 系統進化樹分析

系統進化分析結果表明（圖6），供試昆蟲序列與5條小火蟻序列聚為一支，進一步說明供試昆蟲樣品為小火蟻，同時這6條序列又與W.rochai和W.scrobifera聚為更大的一支，說明供試昆蟲隸屬沃氏蟻屬，上述16條序列和草地鋪道蟻T.caespitum分屬不同的兩個分支，系統進化樹的屬級分類結果也和現有分類結果一致。

3 結論與討論

沃氏蟻屬是新大陸熱帶地區的特有屬［26］，該屬主要特征是觸角棒節2節，觸角溝明顯、并胸腹節刺發達，頭部有縱刻紋，體表有刻點，無中并胸腹節縫。與沃氏蟻屬形態相近的有火蟻屬Solenopsis、重頭蟻屬Carebara、Ochetomyrmex和睫蟻屬Blepharidatta，這些屬和沃氏蟻屬主要的相似特征是觸角棒節2節，但其他特征差異巨大，如火蟻屬無并胸腹節刺和觸角溝［30］，重頭蟻屬無觸角溝、頭部也無刻紋［3132］，Ochetomyrmex屬有明顯的中并胸腹節縫［3334］，睫蟻屬觸角溝上緣持續向后延伸并凸出后頭緣［35］，這些特征均與沃氏蟻屬不同，比較容易區分。鋪道蟻屬與沃氏蟻屬也有一些相似特征，Roger 1863年在古巴首次發現小火蟻時甚至將其命名為T.auropunctata［36］，該屬工蟻也具有頭部有縱脊紋、并胸腹節刺發達、觸角末端有膨大的棒節等特點，特別是雙隆骨鋪道蟻T.bicarinatum甚至具有和小火蟻一樣的矩形前腹柄結，但是鋪道蟻屬觸角棒節為3節，觸角溝更淺、觸角溝上緣脊更短，體表被毛更加豐富，體表刻點更深，體表顏色更深［37］，這些特征也和沃氏蟻屬比較容易區分。準確掌握沃氏蟻屬的形態特征可以很容易地將其和其他屬的蟻類進行區分。

沃氏蟻屬共報道有11種，只有小火蟻在世界范圍內廣泛分布，其他種在原產地也不常見［27］。小火蟻與該屬其他種的區別主要是小火蟻前腹柄結強烈呈矩形，且結的前面幾乎垂直于結前柄和結的背面，呈明顯的階梯狀輪廓，

同時結前柄與結近等長（圖1g），雖然W.scrobifera、W.sulcaticeps和W.longiseta前腹柄結也近似方形，但結的前面不垂直于結前柄，且結前柄長度明顯長于或短于腹柄結。小火蟻的體色與其他近緣種也有明顯的差異，如W.longiseta、W.lutzi、W.sulcaticeps和

W.williamsoni的體色要遠深于小火蟻。小火蟻的蟻后體型要遠大于工蟻（圖2b），是該屬中蟻后和工蟻體型差異最大的［2627］。另外小火蟻工蟻是單型蟻，沒有特化的大型兵蟻，可以利用這個特征很容易地將其與大頭蟻屬Pheidole進行區分。

盡管形態學方法在小火蟻鑒定中具有直觀性優勢，但其實際應用中仍面臨多重挑戰。首先，受限于該類群個體微小，需依賴體視顯微鏡進行精細解剖觀察，這對分類學經驗不足的技術人員構成巨大挑戰。其次，形態鑒定高度依賴工蟻，存在蟲態受限的問題。最后，口岸檢疫場景下的時效性壓力與設備條件限制，使傳統形態鑒定難以滿足快速通關需求。DNA條形碼技術為物種識別提供了標準化解決方案，通過建立COⅠ基因等標準片段數據庫，可顯著降低技術推廣門檻，但需規范小火蟻無水乙醇低溫保存流程以防止核酸降解。值得關注的是，新興快速檢測技術［38］的引入，可顯著縮短分子鑒定周期，為實現小火蟻的快速鑒定提供了新思路。

小火蟻的早期監測是阻斷其傳播的關鍵環節。研究表明，花生醬和火腿腸在野外誘集小火蟻中表現最好［39］，這為野外監測提供了有效方法。據筆者實地調查，小火蟻巢穴多分布于枯枝落葉層、喬木樹干裂隙及巖石縫隙等蔭蔽潮濕生境，尤其偏好粗大樹干等穩定微環境。針對該蟻的隱蔽特性，環境DNA（eDNA）檢測技術為其快速發現提供了新途徑［40］。小火蟻的行為特征亦具一定辨識性，工蟻移動速率顯著低于常見的大頭蟻、鋪道蟻和紅火蟻等，即使在誘集過程中受到干擾，仍表現出明顯的逃逸遲滯現象，這一特性可作為初步野外識別的行為學指標。

隨著2024年小火蟻被正式列入我國進境檢疫性有害生物名錄，其跨境擴散風險已成為生物安全防控的重點領域。鑒于此，亟須構建“監測鑒定防治”集成化技術體系：通過物聯網技術實現高風險區域實時動態監測，結合分子鑒定與誘集技術提升入侵位點篩查效率，同時開發低毒高效的靶向生物防治劑以平衡防控效力與生態安全。精準的小火蟻鑒定技術不僅是實施早期攔截的核心保障，更是踐行國家生物安全戰略的關鍵技術支撐。

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（責任編輯：田 喆）