刺槐蜂蜜的高特異性PCR檢測技術體系的建立

中圖分類號：R126.4 文獻標志碼：A文章編號：1674-5124（2025）07-0104-07

Abstract：Honey is rich in nutrientsand widely cherished.As the world's largest honey producerand consumer， China faces a growing issue with adulterated honey entering the market due to increased demand. Existing nucleic acid detection systems for honey plants often fail to distinguish related species due to the lack of target specificity. This study employed bioinformatics methods to addressthis isue by comparing the highthroughput sequencing data of Robinia pseudoacacia with the genomes of related species and the NCBI NT nucleic acid database. We successfully identified a 3141 bp genome-specific DNA fragment of R. pseudoacacia. Based on this DNA fragment， we designed a PCR primer pair， RpsF1/RpsR13，with an amplification length of 257 bp. We then established a PCR system for the qualitative detection of locust honey. This system effectively distinguishes R. pseudoacacia from related Leguminosae species，such as Erythrina variegata. The system's sensitivity is notable， detecting a minimum template amount of 8.55 ag in a 20μL （2號 reaction， equivalent to 2.0 DNA copies. Testing of 20 locust honey samples yielded a 100% positive detection rate，demonstrating the system's high specificity and sensitivity.This new PCR detection assay ofers a robust technical solution for identifying authentic honey，thus helping to address the issue of adulterated honey in the market.

Keywords： honey; Robinia pseudoacacia; specific DNA fragment; PCR; detection assay

0 引言

蜂蜜是由蜜蜂采集植物的花蜜或蜜露與自身分泌物結合后釀造而成的天然甜味物質，是我國家庭常備食品，富含葡萄糖、果糖和蔗糖等多種營養素，及豐富的氨基酸、維生素、活性酶、類黃酮、多酚類、類胡蘿卜素等活性物質及多種礦物質[1]。蜜蜂采蜜時會吸人一部分花粉到蜜囊中，蜂蜜中不可避免地混人了蜜源植物的花粉，因此根據蜂蜜中花粉的種類可區分蜂蜜的品種。由于市場供需關系和追求利益的驅使，大量人造蜂蜜、摻假蜂蜜涌入市場。蜂蜜摻假方式很多，如借以葡萄糖、果糖糖漿等作為原料添加各種食品添加劑如色素等；用白糖熬制糖漿或者通過硫酸裂解白糖而成的假蜂蜜；在蜂蜜中添加甘蔗糖漿、玉米糖漿、木薯糖漿、甜菜糖漿，以低價單（雜）花蜜冒充或摻入到高價單花蜜中等[2-3]。研究表明多種摻假蜂蜜會增加消費者患糖尿病、肥胖、高血脂、高血壓等疾病的風險，影響肝臟、腎臟、心臟和大腦健康[4]。2021年9月1日，美國藥典（USP）正式發布了蜂蜜鑒別標準，其在對食品造假的分析中發現蜂蜜在最常見的摻假食品中排名第3至第5位。

目前已報道的蜂蜜鑒定技術包括傳統鑒定技術、化學鑒定技術、核酸鑒定技術。傳統鑒定技術包括感官鑒別、花粉鑒別等，感官鑒別法通常由經驗豐富的專家依據蜂蜜的色澤、狀態、氣味、滋味等感官特性來進行品質鑒別[5]，花粉鑒別法是通過對蜂蜜進行稀釋、離心，再利用顯微技術對蜂蜜中的花粉類型、含量等進行鑒定[5]；化學鑒定技術包括色譜鑒定法和光譜鑒定法兩大類，主要是通過檢測蜂蜜當中的特定化合物以鑒別蜂蜜的真假[6-7；核酸鑒定技術主要通過檢測蜂蜜中的蜜源植物成分來鑒別蜂蜜的真假，包括多重PCR技術[8]、實時熒光PCR技術[9]、液滴數字PCR技術[10]等。其中核酸檢測技術是一種通過DNA判定物種類型的檢測技術，靈敏度高、操作簡便，是物種判別的\"金標準”，已在物種分類、疾控、食品等眾多領域得到廣泛應用。我國出入境檢驗檢疫行業標準SN/T4848即規定使用核酸檢測方法（實時熒光PCR）對出口蜂蜜中常見蜜源植物進行定性檢測，該標準中的檢測靶標多為特定功能基因或轉錄間隔區。但基于轉錄間隔區、特定功能基因等靶標的分子檢測技術受限于序列差異小等原因，難以將靶標物種與其近緣物種區分開。因此，發掘新的分子檢測靶標開發方便快捷的核酸檢測技術，對于真假蜂蜜的鑒別乃至國家和行業標準的更新升級均具有重要意義。

本研究基于生物信息學方法挖掘刺槐物種特異的基因組DNA片段，并以此作為分子檢測靶標，開發了一套高特異性的刺槐蜂蜜分子檢測技術體系。

1材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試菌株

大腸桿菌（Escherichiacoli）Transl0感受態細胞（Transgen，CD101-01）購自北京全式金生物技術股份有限公司。

1.1.2 蜂蜜樣品

從沃爾瑪、永輝、京東及紅旗連鎖等大型商超或電商平臺購買20款不同品牌的槐花蜂蜜，并記錄各樣品的品牌、配料、生產廠家、產地、執行標準等信息。

1.2 實驗方法

1.2.1 刺槐物種特異的基因組DNA片段挖掘與引物設計

1）從 https：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/中 下載刺槐近緣種的基因組。

2）近緣篩選： ① 從NCBI的SRA數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/sra. cgi？）下載刺槐的高通量測序數據，并比對到刺槐的近緣種基因組上； ② 提取未能比對到近緣種基因組上的測序數據； ③ 未比對的測序數據進行denovo組裝（候選特異序列）。

3）NT篩選： ① 下載NCBI的NT數據庫； ② 候選特異序列與NT數據庫比對，刪除比對上的序列。4）GC篩選：計算候選序列的GC含量，篩除GC含量異常的序列，剩余序列即為物種特異序列。5）依據刺槐特異的基因組DNA序列片段，以PrimerPremier5.0軟件設計PCR引物（引物長度20bp ，GC含量 40%60% ，退火溫度 60^°C ，擴增長度 200～500bp ），并由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2.2 DNA的提取

采摘新鮮的植物葉片，利用植物DNA提取試劑盒（EasyPure Plant Genomic DNA Kit， Transgen，EE111-01）提取基因組DNA，并通過 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量。

1.2.3 DNA片段的TA克隆

基于1.2.1中所設計的PCR引物，利用2× EasyTaq？ PCR SuperMix（Transgen，AS111-11）對刺槐基因組DNA進行擴增，以EasyPure QuickGelExtractionKit（Transgen，EG101-01）純化目的片段，參照pEASY -T1 Simple Cloning Kit（Transgen，CT111-01）說明書進行TA克隆，挑選單克隆通過菌落PCR初步鑒定，陽性克隆送北京擎科生物科技有限公司測序鑒定，測序結果與預期序列一致的陽性菌落經液體LB培養基培養至 OD600≈1.0 ，參照EasyPure？ Plasmid MiniPrep Kit（Transgen，EM101-02）說明書提取質粒，作為后續PCR體系優化和靈敏度檢測的模板。

1.2.4PCR模板用量和退火溫度的優化

根據 2× EasyTaq？PCRSuperMix說明書設計PCR初始體系： 2× EasyTaq PCR Super Mix 10μL 正向引物 1μL ，反向引物 1μL ，重組質粒 1μL ddH₂O7 μL。初始反應程序為： 94^9C 預變性 3min 94^°C 變性 30s，58^qC 退火 延伸 20s. 循環30次； 72^°C 補充延伸 5min 。測定重組質粒溶液的濃度，以重組質粒10倍梯度稀釋液進行PCR擴增，擴增產物用 1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

基于上述PCR初始體系和模板用量優化結果，進一步對PCR的退火溫度進行優化：1）在52.0～67.0^qC 之間設置8個不同的退火溫度，以重組質粒pEASY-Rps257為模板，對引物RpsF1/RpsR1的退火溫度進行初步優化；2）基于初步優化結果，設置 57.0，57.7，58.9，60.8，63.1，65.0， 66.3，67.0°C 共8個退火溫度進行PCR擴增，擴增產物用 1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 PCR靈敏度測定

以梯度稀釋的重組質粒為模板，在 20μL 的PCR反應體系中，以優化后的退火溫度進行42個循環的PCR擴增，擴增產物用 1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測，找到能檢測到擴增條帶的最低質粒模板濃度。

1.2.6 PCR特異性檢測

以刺槐、刺桐、龍爪槐、羊蹄甲、皂莢、豌豆、野豌豆、四季豆、蠶豆、紫荊等豆科植物的基因組DNA為模板，以優化后的退火溫度進行PCR擴增，擴增產物用 1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析引物的物種特異性。

1.2.7 市售蜂蜜樣本的檢測

取蜂蜜樣 20g 至 50mL 離心管，于 55^°C 水浴至完全融化；離心管中加入提前預熱的 55^°C 蒸餾水 30mL ，振蕩混勻，分裝為2管，分別在4500r/min 離心 10min ，去上清;加入 1mL 蒸餾水重懸沉淀，移至 2mL 離心管， 4500r/min 離心 10min 去上清，重復清洗1次；所得沉淀首先用液氮速凍10s. ，隨后于離心管中加入直徑 0.3cm 的鋼珠，在渦旋振蕩儀上研磨 20s. ，重復速凍和研磨步驟3次；用EasyPure Plant Genomic DNA Kit，（Transgen，EE111-01）提取花粉的DNA。將提取出的花粉DNA作為模板，使用優化后的PCR體系對20份市售槐花蜂蜜進行PCR擴增（模板用量 8μL ），擴增產物用 1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1刺槐物種特異的基因組DNA片段挖掘

從NCBI的SRA數據庫下載刺槐的高通量測序reads數據，并進行多輪DNA序列相似性比對分析，發現刺槐基因組DNA中存在1個長3141bp的物種特異DNA片段。以該片段為分子檢測靶標，設計得到PCR引物RpsF1（ 5' -ACCAGCGAGTCTGCTATTCC-3'）和RpsR1（ 5' -GGTAACAACTGGCACGAACA-3'），該引物對的擴增片段長度為 257bp 。

2.2 PCR的模板用量的優化

以RpsF1/RpsR1為引物進行PCR擴增，對擴增得到的刺槐基因組DNA片段（ 257bp 進行TA克隆，構建重組質粒pEASY-Rps257，重組質粒濃度為 10.26ng/μL ，對應的拷貝數為2429817201copies /μL ，稀釋5/6倍后濃度為的2024847667copies /μL ，約 2×109 copies/μL。對該模板進行10倍梯度稀釋，構建 2×10⁹ ！ 2×10⁸ 、 2×10⁷ 、 2×10⁶ 2×10⁵ 、 2×10⁴ 、 2×10³ 、 2×10² ！ 2×10¹ copies /μL 的重組質粒梯度稀釋液，并作為模板進行30個循環的PCR擴增：隨著質粒模板拷貝數的降低，RpsF1/RpsR1擴增產物的凝膠電泳條帶亮度不斷降低，當模板濃度降低至 2×10⁴ copies/ μL 時條帶亮度明顯降低，如圖1所示。因此初步選擇 2×10⁴ copies 'μL 作為后續PCR體系優化時的模板用量。

1：陰性對照（ ）；2-5：質粒模板濃度依次為 2×10⁵ 2×10⁴ ，2×10³ 2×10² copies/μL。

2.3 PCR的退火溫度的優化

在 52.0～67.0^°C 之間設置8個不同的退火溫度（52.0、53.1、54.9、57.7、61.1、64.0、65.9、 67.0°C ），以 2×10⁴ copies /μL 的重組質粒pEASY-Rps257為模板，對引物RpsF1/RpsR1的退火溫度進行初步優化，以 1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，發現退火溫度過低（ 52.0C，53.1C 和 54.9‰ ）時出現非特異性擴增，退火溫度設置為 67.0‰ 依然有清晰單一的目的條帶。進一步以57.0、57.7、58.9、60.8、63.1，65.0，66.3，67.0^°C 為退火溫度進行PCR擴增，結果顯示以8個不同退火溫度進行PCR擴增均獲得了單一的擴增條帶，其中退火溫度為58.9、60.8、63.1⁶C 和 65^°C 時，條帶亮度最高，如圖2所示。條帶6與條帶7亮度一致且都較為明亮，故選擇63.1°C 作為引物RpsF1/RpsR1的退火溫度。

2.4PCR體系的靈敏度

以重組質粒pEASY-Rps257梯度稀釋液為模板，在 20μL 的PCR反應體系中以優化后的退火溫度下進行42個循環的PCR擴增，當模板濃度高于

1：陰性對照（ ；2-9：退火溫度依次為57.0、57.7、58.9、60.8、

63.1、65.0、66.3、67.0℃。

2×10⁵ copies /μL 時候，模板量飽和，擴增產物的電泳條帶亮度沒有明顯區別。隨著模版濃度的降低，擴增產物電泳條帶的亮度不斷降低，當模板拷貝數降低至2copies μL 時依舊可以擴增出目的片段，如圖3所示。因此， 20μL 的PCR反應體系中，引物RpsF1/RpsR1可檢測出的最低質粒模板量為 8.55× 10^-9ng ，即8.55ag，對應拷貝數為2.0copies。

1-10：質?？截悢狄来螢?2×10⁹ 2×10⁸ / 2×10⁷ ， 2×10⁶ 2×10⁵ 2×10⁴，2×10³，2×10²，2×10¹， 2×10⁰ copies/uL。

2.5 PCR體系的特異性檢測

為分析基于刺槐基因組特異DNA片段設計的PCR引物的特異性，分別提取刺槐、刺桐、龍爪槐、羊蹄甲、皂莢、豌豆、野豌豆、四季豆、蠶豆、紫荊等豆科植物的基因組DNA，以RpsF1/RpsR1引物進行PCR擴增。結果表明引物RpsF1/RpsR1具有良好的特異性：除刺槐DNA外，其余DNA樣品均未能擴增出預期大小的目的DNA；雖然以龍爪槐DNA為模板同樣檢測到擴增條帶，但其大小與預期大小不一致，如圖4所示。

1-10分別為以刺槐、蠶豆、皂莢、龍爪槐、刺桐、豌豆、羊蹄甲、野豌豆、紫荊、四季豆基因組DNA為模板的擴增產物。

2.6 市售蜂蜜樣本的PCR檢測

從沃爾瑪、永輝、京東及紅旗連鎖賣場購買20份刺槐（洋槐）蜂蜜，如表1所示。其中19份蜂蜜的執行標準為GB14963，1份執行德國瑯尼斯企業標準。從蜂蜜中分離花粉并提取DNA，以前述PCR體系進行擴增，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。結果顯示：從四川健生、江西景福和江西偉多利購買的3份洋槐蜂蜜樣本擴增得到2個

DNA片段，其中較大的DNA片段與預期的擴增產物大小一致，另一較小的DNA片段與龍爪槐的擴增產物大小一致，說明該蜂蜜中含有龍爪槐花粉;其余17款刺槐蜂蜜樣品均成功擴增得到單一、明亮的目的DNA條帶，說明這17款蜂蜜中均含有刺槐花粉，如圖5所示。

3分析與討論

刺槐（RobiniapseudoacaciaL.）也被稱為洋槐，是豆科刺槐屬落葉喬木，具有很高的園林綠化觀賞價值，其花香濃郁，花粉在醫藥上用作健胃劑和鎮靜劑。洋槐蜂蜜具有洋槐特有的清香，在我國出口的蜂蜜品種當中，洋槐蜂蜜的出口量很大，深受國外消費者喜愛。我國出人境檢驗檢疫行業標準SN/T4848規定的洋槐蜂蜜實時熒光檢測方法和季小榮等[11]所用檢測靶標為葉綠體matK基因，該基因序列保守，標準中所用引物（F：GCTCAACCAGGA ACGATC; R： GCAGCATTTGACTACGTACCA）與毛洋槐（Robiniahispida）、毒鼠豆（Gliricidiasepium）、朝鮮槐（Maackiaamurensis）、多枝棘豆（Oxytropisramosissima）等近緣種及阿薩姆蓼（Persicariaassamica）、春蓼（ P. maculosa）等遠緣種基因組的特定區段 100% 匹配，無法有效區分這些近緣種和遠緣種。將李紅亮[12]和劉桐羽[13]所設計的引物和探針提交NCBI的核酸序列數據庫進行序列相似性比對，均能與多個植物甚至動物物種的核酸序列高度匹配，說明這兩種核酸檢測方法的物種特異性均沒有保障。陳誼[14]、楊術鵬[15]等開發的洋槐蜜鑒別方法，均未對檢測方法的特異性進行評價。本研究將 SRA 數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/sra.cgi？）下載的刺槐高通量測序read與近緣種基因組比對后淘汰比對上的數據，未比對上的數據進行組裝并提交NCBI的NT數據庫進行序列相似性比對，選擇未能與NT數據庫任何核酸序列比對上的DNA片段作為刺槐物種特異的DNA片段，成功挖掘到1條長度為3141bp的物種特異DNA片段。因目前刺槐基因組尚未公布，該序列未能定位至刺槐基因組的任何一條染色體上，且將其提交NCBI數據庫比對不上任何基因序列。因此，本研究所用的分子檢測靶標序列挖掘方法即對后續所設計引物的特異性奠定了良好基礎。隨后我們選擇了刺桐、龍爪槐、羊蹄甲、皂莢、豌豆、野豌豆、四季豆、蠶豆、紫荊等豆科近緣種的基因組DNA作為模板進行PCR擴增，也證實了我們所設計的引物具有良好的物種特異性，能有效區分刺桐等豆科近緣種。

因刺槐基因組尚未公布，在對檢測體系的靈敏度進行分析時，直接使用刺槐基因組DNA溶液作為模板無法計算DNA靶標的拷貝數，因此本研究通過TA克隆構建檢測靶標的重組質粒，測量其濃度并精確換算得到模板的拷貝數。分析確定本研究所建立檢測體系的靈敏度達到8.55ag，對應拷貝數為2.0copies（ 20μL 的PCR反應體系）。而行業標準SN/T4848和季小榮等所述桉樹花蜜檢測體系的靈敏度為 10fg^[11] ，楊艷歌等報道的麥盧卡蜂蜜核酸檢測體系的靈敏度為 1pg/μL^[16] ，與本研究類似，2套檢測體系在進行靈敏度分析時所用DNA模板均為重組質粒（DNA標準品），但檢測靈敏度均不如本研究所建立的檢測體系，這可能與我們所設計引物的特異性更好有關，這與我們前期基于相同策略建立的馬鈴薯晚疫病檢測技術體系和釀膿鏈球菌檢測技術體系的靈敏度較已報到的檢測體系靈敏度更高是一致的[17-18]。

基于上述刺槐蜂蜜檢測技術體系對市售洋槐蜂蜜進行檢測，陽性檢出率達到 100% 。但因為蜂蜜DNA濃度較低，檢測過程中模板用了達到了 8μL 。雖然已有多種蜂蜜中花粉DNA提取方法的報道，但提取效果仍不夠理想，未來的蜂蜜檢測技術體系開發過程中還應更多關注高質量DNA提取方法的研發。

4結束語

本研究結合生物信息學成功挖掘到一條刺槐物種特異的基因組DNA片段，并基于該片段開發了一套刺槐蜂蜜定性檢測技術體系，該體系具有良好的物種特異性，能有效區分龍爪槐、刺桐、羊蹄甲等豆科近緣種， 20μL 檢測體系中，可檢測出的最低質粒模板量為2.0拷貝，能有效檢出市售蜂蜜中的刺槐成分。

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（編輯：徐柳）