野生與栽培五味子葉際微生物群落多樣性和結構差異及功能預測分析

五味子[Schisandrachinensis（Turcz.）Baill.為五味子科（SchisandraceaeBlume.）五味子屬（SchisandraMichx.）多年生落葉藤本植物[]，屬于國家三級重點保護藥用植物品種[2]據《中華本草》記載，五味子屬植物用藥部位包括根、莖、葉和果實[3]，具有益氣生津、斂肺止咳、補腎寧心的功效?，F代研究揭示五味子在心血管類疾病、呼吸系統類疾病、抗腫瘤和增強免疫力方面具有廣闊應用前景[4]，是極具開發價值和經濟效益的中藥材。

五味子在中藥材市場需求量逐年增加，其成分與品質越來越受到重視。作為藥用植物，五味子次生代謝產物豐富，發揮藥理作用的化學成分主要是三萜類化合物、木脂素類、多糖類、揮發油類、黃酮類以及脂肪酸等[5]，化合物成分含量的高低可成為五味子質量優劣的評價指標之一。研究發現，五味子野生品種與栽培品種中次生代謝物存在一定差異，藥用活性也有所不同[。丁璞等[7評價五味子藤莖品質時發現，野生品種中木脂素含量高于栽培品種；貝雷等8比較伊春地區野生與栽培北五味子木脂素成分中醇甲含量差別，發現野生品種次生代謝物中醇甲含量高于栽培品種；侯冬巖等比較野生品種與栽培品種五味子脂肪酸成分時發現，野生五味子脂肪酸種類低于栽培五味子；陳舒妤9測定野生品種與栽培品種五味子中木脂素及有機酸成分的含量，數據表明野生品種木脂素含量較高，而栽培品種有機酸含量較高。李承范等[10]通過ICP-MS法測定五味子中微量元素含量，發現野生品種微量元素總量明顯高于栽培品種，且有害元素鉛、鎘和碑的含量明顯低于栽培品種。田進國等[11利用紅外光譜鑒別北五味子野生和栽培品種得出結論，二者主要成分的組成相似，但各主要成分相對含量有明顯差異。已有報道表明，五味子野生品種與栽培品種會因生態環境、采收時間等不同使其積累的代謝產物產生差異，導致品質參差不齊[12-14]。產地、藥用部位、采收與加工時間、貯存與運輸方式、炮制方法等均可成為影響五味子質量的因素[15]

近年來，隨著微生物組學技術的發展，研究發現微生物與宿主植物相互作用往往可以合成新的藥用先導化合物[16]。葉際微生物可直接或間接地通過調節植物次生代謝參與許多重要生理活動，如植物生長發育、先天免疫、趨避病蟲、防御反應和對環境脅迫的反應等[17]，葉際菌群不僅能夠獨立產生豐富的次生代謝產物，還能參與植物次生代謝產物的合成以及對植物次生代謝產物進行轉化[18]。葉際微生物作為一類前景廣闊的資源微生物受到越來越多的關注[19]。

目前，有關五味子的研究多集中在用藥規律、栽培技術、次生代謝產物成分以及微生物群落的相關研究[20]。但是，在五味子野生品種和栽培品種的微生物相關研究中，葉際微生物組的差異的研究尚不清楚。本研究通過高通量測序對比陜西地區野生品種和栽培品種北五味子葉際微生物群落組成結構、豐富度及多樣性差異，并對不同微生物群落進行功能預測。在全面了解野生品種與栽培品種葉際群落多樣性及差異性基礎上，聯系其與五味子次生代謝調控的關系，以期揭示葉際微生物在五味子野生品種和栽培品種次生代謝差異中的貢獻，為五味子科研實踐及生產提供理論參考。

1材料與方法

1.1 材料

五味子野生和栽培葉片樣品于2023年7月自陜西省商洛市柞水縣采集，分為野生組葉片（Wildleaves，WL）和栽培組葉片（Plantedleav-es，PL），每組各選擇形狀大小相近的樣品做5個重復處理，共10個樣本，分別標記為WL1、WL2、WL3、WL4、WL5、PL1、PL2、PL3、PL4、PL5。將葉片放入自封袋中，做好標記，冷凍保存至 -80°C 冰箱，備用。

1.2葉際微生物群落高通量測序

葉片樣品送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行DNA提取和擴增子測序。先提取收集到樣品的DNA，對目的片段進行擴增，擴增后對DNA進行質檢，隨后將目的片段回收并進行定量，構建文庫后上機測序。采用IluminaNo-vaseq測序平臺，以細菌16SrDNA V5～V7 區（通用引物： 5^′ -AACMGGATTAGATACCCKG，3^′ -ACGTCATCCCCACCTTCC）和真菌內轉錄間隔區ITS1-1F（通用引物： 5^′ -CTTGGTCATT-TAGAGGAAGTAA， 3^′ -GCTGCGTTCTTCA-TCGATGC）為靶點，對10組葉片樣品進行測序。測序所得的可信目標序列將用于后續分析。

1.3 信息分析

1.3.1測序數據處理根據所擴增的區域特點構建小片段文庫，基于IlluminaNovaseq測序平臺對文庫進行雙末端測序，再根據barcode進行拆分獲得每個樣品的原始數據。原始數據存在一定比例的干擾數據，為了使信息分析的結果更加準確可靠，首先去除barcode和引物，并通過Flash軟件對R1和R2序列原始數據進行拼接，對拼接的Tags進行質控，得到CleanTags，再進行嵌合體過濾，得到可用于后續分析的EffectiveTags。

1.3.2ASVs聚類和物種注釋根據質控后的EffectiveTags，使用QIIME2軟件中的DADA2模塊進行降噪[21]，不再以相似度聚類，只進行去重或者說相當于以 100% 相似度聚類22，使用DADA2降噪后產生的每個去重序列稱為ASV。過濾掉豐度小于5的序列，獲得最終的ASVs（AmpliconSequenceVariants）及特征表。使用QIIME2軟件中的classify-sklearn模塊[23]將得到的ASVs與數據庫比對，根據ASVs注釋結果和各樣品特征表，獲得界、門、綱、目、科、屬、種水平物種豐度表。16S區域使用Silva138.1數據庫注釋，ITS區域使用UNITEv8.2數據庫注釋。

1.3.3 樣本多樣性分析Alpha Diversity（Al-pha多樣性）用于分析樣本內微生物群落多樣性[24]。利用QIIME2軟件進行稀釋曲線的繪制和樣本多樣性分析，其中以Chao1稀釋曲線反映群落中ASVs豐度，以Chaol分析指數、Shannon分析指數反映Alpha多樣性，以評估各樣本中微生物群落豐富度和多樣性的差異。

1.3.4分組樣本間群落結構差異分析BetaDiversity（Beta多樣性）是對不同樣本的微生物群落結構進行比較和分析。首先根據所有樣本的物種注釋結果和特征序列豐度信息，將相同分類的特征序列信息合并處理得到物種豐度信息表，同時利用特征序列之間的系統發育關系計算Unif-rac（Unweightedunifrac）距離[25]，再利用特征序列豐度信息對Unweightedunifrac距離進一步構建Weightedunifrac距離[26]，最后通過Beta多樣性指數組間差異分析及主坐標分析（PrincipalCo-ordinatesAnalysis，PCoA）從中發現不同樣本（組）間的差異。通過SVG繪圖方法繪制出各樣本（組）對應的物種注釋結果在不同分類層級上的相對豐度柱形圖，分析分組樣本間的群落結構差異；根據所有樣本在不同分類水平的物種注釋及豐度信息采用R（Version3.1.O）pheatmap包繪制物種豐度聚類熱圖，從物種層面進行聚類，以便發現物種在各樣本中聚集含量的高低；最后通過R（Version3.5.3）軟件選用 χ_t -test統計分析方法對分組樣本的物種組成和群落結構進行差異顯著性檢驗。

1.3.5功能預測擴增子的注釋結果和相應的COG（Cluster of Orthologous Groups）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）功能數據庫相關聯，選用R（Version4.0.3）軟件對生態樣本中的微生物群落通過PICRUSt2（Phy-logenetic Investigation of Communities by Re-constructionofUnobservedStates）進行功能預測分析，包括 Ψ_t -test檢驗和功能豐度聚類熱圖展示。

2 結果與分析

2.1野生和栽培五味子葉際微生物多樣性差異分析2.1.1Alpha多樣性分析基于Chaol指數的稀釋曲線結果顯示，在測序初期，隨著橫坐標增大，各組曲線縱坐標均出現急劇上升。這表明在測序初期階段，樣本中發現大量物種，新物種集中涌現。當測序量高于10000后，各組曲線均已到達平臺期，縱坐標不再顯著上升，表明大部分微生物多樣性已產生，即使測序深度繼續增加也不會再發現新的物種，說明測序深度足夠，本次測序樣本量充足且測序結果可信，此時數據分析結果可靠（圖1）。

圖1葉際微生物群落Chao1指數稀釋曲線

Fig. 1 Rarefaction curves of leaf microbial community

對不同樣品的Alpha多樣性分析，結合不同類型的統計學分析指數，對微生物群落的豐富度和多樣性進行評估。Chao1指數表明相較于野生品種，栽培品種葉際微生物中細菌、真菌群落豐富度總體偏低（圖2-A，圖2-C）；群落多樣性及均勻度方面，Shannon指數反映野生品種細菌、真菌微生物群落多樣性總體高于栽培品種，且野生品種中物種均勻度更好（圖2-B，圖2-D）?？偟膩砜?，五味子野生品種葉際細菌、真菌微生物群落豐富度和多樣性均較栽培品種高，且差異較為顯著。此外，野生品種和栽培品種組間真菌群落豐富度和多樣性較細菌差異更大。

圖2葉際微生物群落AIpha多樣性指數差異統計

Fig.2Differences in Alpha diversity index of interleaf microbial communities

2.1.2ASVs（Amplicon Sequence Variants）聚類分析對細菌、真菌微生物群落進行Venn 圖分析，聚焦不同樣本中共有及獨有微生物數目。野生品種和栽培品種葉片中共發現的細菌ASVs總數為4041個，其中野生與栽培品種五味子細菌ASVs數量分別為2525和1516個，兩者共有的ASVs數目為408個，特有ASVs數量分別為2117和1108個（圖3-A）；野生和栽培品種葉片中共發現的真菌ASVs總數為1251個，其中野生五味子與栽培品種五味子真菌ASVs數量分別為883和368個，兩者共有的ASVs數目為105個，特有ASVs數量分別為778和263個（圖3-B）。分析發現葉際細菌分別占各自樣本所有物種的 16.16% （野生品種）和 26.91% （栽培品種），葉際真菌則分別占 11.89% 和 28.53% 。從各樣本中獨有微生物情況來看，野生品種獨有細菌及真菌ASVs數目均比栽培品種多，可以對獨有部分微生物進行進一步分析。

圖3葉際菌群韋恩圖

Fig.3Venn diagram of leaf microbiota

2.2野生和栽培五味子葉際微生物群落組成結構及差異分析

2.2.1主坐標分析顯示群落結構差異為探索野生品種和栽培品種葉際微生物的變異，在ASV水平上采用基于Bray-Curtis的PCoA對樣本進行Beta多樣性分析。葉際細菌群落分析顯示，野生品種樣本和栽培品種樣本各自聚集在一起，組間明顯分離（圖4-A）。基于UnweighteduniFrac距離的PCoA分析證實了這種現象（圖4-B）。葉際真菌群落分析發現野生品種樣本和栽培品種樣本分離更明顯（圖4-C）?；赨nweighteduniF-rac距離的PCoA分析表明這兩組樣品完全分離（圖4-D）。表明野生品種和栽培品種五味子葉際微生物群落存在顯著差異，真菌群落差異更顯著。

圖4葉際微生物群落PCoA分析圖

Fig.4PCoA analysisof leafmicrobial communities

2.2.2野生五味子與栽培五味子葉際細菌群落組成五味子葉際細菌群落在門水平上，野生品種的相對豐度占比處于前五的為變形菌門（Pro-teobacteria， 56.06%～80.18%） 、放線菌門（Acti-nobacteria， 13.13%～35.53%） 、厚壁菌門（Firmicutes，0. 15%～3 ： 30% ）、放線桿菌門（Acti-nobacteriota，O. 18%～2 一 66% ）和擬桿菌門（Bacteroidota，O. 20%～1.34%） ；栽培品種中細菌類群的優勢菌群是變形菌門，相對豐度占比最高達 89.64% ，隨后依次為放線菌門 （2.09%～ 7.32% ）、厚壁菌門 （3.07%～7.85%） 和藍藻菌門（Cyanobacteria， 0.00%～13.30%） （圖5-A）。野生五味子葉際細菌在門水平上的組成與栽培五味子相似，但野生品種放線菌門細菌相對豐度占比高于栽培品種，栽培品種變形菌門相對豐度占比略高于野生品種。進一步分析發現，PL4樣本相較于其他樣本藍藻菌門相對豐度較高，占比達13.30% ，且其余菌門相對豐度較低，推測藍藻菌門的存在會抑制其余優勢菌門的生長。

屬水平上，野生品種葉際細菌相對豐度占比處于前5的為甲基桿菌屬（Methylobacterium-Methylorubrum 4.47%～49.27% 、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas 8.29%～19.45%） 、假單胞菌屬（Pseudomonas， 0. 05%～19. 37%） 、金黃色單胞菌屬（Aureimonas， 2.13%～10.66%） 和動球菌屬（Kineococcus， 1.28%～9.75%） ；栽培品種葉際細菌類群的優勢菌屬為甲基桿菌屬1 （6，44%～65.24%） ，其次分別為弧菌屬（Vibrio，0.42%～21 ， 34% ）、假單胞菌屬（0. 33%～ 8.72% ）、鞘氨醇單胞菌屬 （0.31%～5.37%） 和鏈球菌屬（Streptococcus， 1. 17%～3. 90%） （圖5-C）。野生品種和栽培品種葉際細菌群落在屬水平上的組成存在差異，野生品種鞘氨醇單胞菌屬、假單胞菌屬、金黃色單胞菌屬、動球菌屬、Naka-murella、Variovorax、胺桿菌屬（Amnibacteri-um）、Klenkia、Friedmanniella和類諾卡氏屬（Nocardioides）細菌相對豐度明顯高于栽培品種。Georgenia是野生品種特有的一屬細菌，該屬為革蘭氏陽性菌，好氧或兼性厭氧，非產孢，能分泌氧化酶和過氧化氫酶；栽培品種葉際微生物群落中甲基桿菌屬、弧菌屬、氣單胞菌屬（Aeromonas）、假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）、Patulibacter、鏈球菌屬和氣球菌屬（Aerococcus）細菌相對豐度高于野生品種?？偟膩砜矗吧贩N相較于栽培品種葉際細菌群落豐富度更高，物種組成也更豐富。甲基桿菌屬為五味子葉際細菌優勢菌屬，在野生品種和栽培品種中相對豐度占比均為最高。

2.2.3野生五味子與栽培五味子葉際真菌群落組成野生品種和栽培品種葉片樣本經ITS高通量測序后，基于不同分類水平的物種注釋結果，繪制出各樣品在不同分類層級上對應的相對豐度柱形圖。

屬水平上，野生品種葉際真菌相對豐度占比處于前五的為枝孢屬（Cladosporiuml1. 27%～ 27.22% ）、外囊菌屬（Taphrina，0. 05%～ 22.58% ）Tricellula （1.47%～18.37%） 、鏈格孢屬（Alternaria， ）.12%～5.95%） 和Vishniaco-zyma（0，29%～2.92%） ;栽培品種中相對豐度占比處于前五的葉際真菌為外囊菌屬 （12.90%～ 68.55% 、枝孢屬 （20.51%～41.62%） 、Golubeu-ia（0，03%～31.36%） 、Vishniacozyma（1 .54%～ 15.38% 和鏈格孢屬 （0.47%～7.79%） （圖5-D）。野生品種和栽培品種葉際真菌群落組成在屬水平存在較大差異，優勢真菌外囊菌屬和枝孢屬在相對豐度占比方面表現為栽培品種顯著多于野生品種，此外，栽培品種Vishniacozyma和鏈格孢屬真菌相對豐度占比也略高于野生品種；野生品種Tricellula、亞隔孢殼屬（Didymella）、多臂菌屬（Trichomerium）線黑粉酵母屬（Filobas-idium）黑團孢屬（Periconia）、異莖點霉屬（ Pa- raphoma）真菌相對豐度占比略多于栽培品種。假牛肝菌屬（Pseudorobillarda）、Knufia、Di-atractium、Chaetosphaeronema、Microcyclospo-ra、Calloriaceae_gen_Incertae_sedis、杯梗孢屬（Cyphellophora）、黑埋核盤菌屬（Pyrenopez-iza ）、腋無柄孢屬（Alatosessilispora）、座囊菌屬（Dothidea）和殼月孢屬（Selenophoma）多達11種真菌菌屬為野生品種獨有；戈盧別夫氏菌屬（Golubeuia）在栽培品種葉際真菌中相對豐度最大占比高達 31.36% ，而在野生品種中未被發現。這些結果表明野生品種葉際真菌群落相較于栽培品種豐富度更高，物種組成更豐富。

2.2.4野生與栽培五味子葉際細菌差異分析為進一步探究野生品種與栽培品種葉際細菌群落差異，在 Plt;0.05 顯著性水平分析門和屬分類單元。門水平上，占細菌群落主要組成的放線菌門存在顯著差異，野生品種葉際細菌放線菌門相對豐度平均占比為 23.58% ，顯著高于栽培品種的4.34% （圖6-A）；屬水平上，野生品種與栽培品種存在顯著差異的主要有11屬細菌，其中野生品種相對豐度平均占比顯著高于栽培品種的有9個屬，分別為鞘氨醇單胞菌屬（ WL：13. 17% ，PL：5.13% ）、金黃色單胞菌屬 （WL：4. 99% ，PL：0.31% ）、Klenkia（WL：3. 46% ，PL： 0.56% ）、諾卡氏菌屬（Nocardioides，WL：2. 55% ，PL：0.05% ）、放線孢菌屬（Actinomycetospora，WL：0.67% ，PL： 0.02% ）、蛭弧菌屬（Bdellovibrio，WL：0. 21% ，PL：0. 03% ）、棒形桿菌屬（Claui-bacter， WL ：0. 16% ，PL：0. 11% ）、Pseudokineo-coccus （WL： 0. 15% ，PL：0. 00% ）和Jatrophi-habitans （WL：0.10% ，PL： 0.01% ），栽培品種葉際細菌屬相對豐度平均占比高于野生品種的為氣單胞菌屬（WL：1. 49% ，PL：6. 00% ）和鏈球菌屬（Streptococcus， WL：0.59% PL：2.35% （圖6-B）。

2.2.5野生與栽培五味子葉際真菌差異分析通過 t -test檢驗在 Plt;0. 05 顯著性水平對五味子葉際真菌在屬分類單元分析結果如圖7所示，共有7個屬的真菌在野生品種和栽培品種之間存在顯著差異，其中野生品種相對豐度平均占比高于栽培品種的有5屬，分別為亞隔孢殼屬 （Didy- mella， WL：3.98% ， PL：0.02%） 、節枝孢屬 （Ar^- ticulospora， ，PL：0. 04% ）、穴殼屬（Dothiora，WL：0. 78% ，PL： 0.00% ）、Boeremia（WL：0.36% ，PL： 0.00% 和Setophaeosphaeria（WL：0.19%，PL：0.00%） ，栽培品種中真菌相對豐度平均占比較高的屬有外囊菌屬（WL：6.63% ，PL：44. 67% ）和枝孢屬 WL：20.19% ，PL：32.34% 。

2.2.6物種豐度聚類熱圖揭示野生與栽培五味子葉際微生物群落結構差異關系為分析物種在各樣本中聚集含量的高低，選取豐度排名前35的屬繪制熱圖發現野生品種葉際細菌群落豐富度較栽培品種高，野生品種中相對豐度占比較高的屬于放線菌門，栽培品種中相對豐度占比較高的細菌群落屬于變形菌門和厚壁菌門（圖8-A）；野生品種5個重復樣本葉際真菌群落豐富度均較高，栽培品種中PL4、PL5葉際真菌群落豐度較高且主要集中于Vishniacozyma和Typhula（圖8-B）。

2.3野生與栽培五味子葉際微生物群落功能預測分析

2.3.1KEGG通路預測葉際微生物群落功能為探究五味子葉際微生物群落功能，使用

圖6葉際細菌不同分類水平差異分布

Fig.6Differential distributionof leaf boundarybacteriaat different taxonomic levels

圖7葉際真菌屬水平差異分布

Fig. 7 Genusleveldistributionoffungalinleafarea

PICRUSt2通過16SrDNA基因測序結果比對KEGG數據庫，結果表明五味子葉際微生物中具有碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝和脂質代謝功能的類群豐度最高。其中碳水化合物代謝（?????? ， Plt;0. 000 1; 、氨基酸代謝 （** ，P=0.008 9 、脂代謝 （????，Plt;0.000 1） 萜類和聚酮類化合物代謝 （??，P=0，002 5） 功能基因相對豐度顯示，葉際微生物群落相對豐度占比野生品種顯著高于栽培品種（圖9）。

2.3.2葉際微生物基因功能分類分析為進一步探究五味子葉際細菌群落中的功能基因，在COG數據庫對其進行功能分類分析。結果表明豐度占比較大的基因為DHRS3（COG1028），屬于短鏈脫氫酶家族（圖10）。研究表明短鏈脫氫酶可以通過參與植物次級代謝調控，如萜類、酚類、生物堿和類固醇等的生物合成來調節植物生理生化反應[27]。 χ_t -test 差異分析顯示，該類短鏈脫氫酶家族基因豐度占比野生品種顯著高于栽培品種 （P=0.003 ，圖10）。

2.3.3聚類熱圖揭示野生與栽培五味子預測功能差異進一步利用PICRUSt2分析比較野生品種和栽培品種葉際微生物功能差異。聚類分析結果顯示野生品種與栽培品種樣品各自生物學重復0 ?WL1～5，PL1～5） 聚集在一起，表明樣本具有較好的重復性。野生品種與栽培品種樣本在聚類分析樹中相互分開，表明不同樣本功能具有差異（圖11）。野生品種葉際菌群功能主要集中于次生代謝產物生物合成與分解代謝、脂類及萜類運輸與代謝、氨基酸運輸與代謝以及能量產生與轉換，上述功能較栽培品活躍；栽培品種葉際菌群功能主要集中于信號轉導和防御機制。

3討論

3.1高通量測序在葉際微生物組研究中的應用

近年來，高通量測序技術已廣泛應用于環境、化工、動植物及微生物群落多樣性的研究[28]。傳統的分離培養法耗時耗力，且有些在自然環境中生長繁殖的菌屬難以通過分離培養在營養血內獲得[18]，鑒定得到的菌屬不完全、多樣性較低[29]。第二代測序的出現一定程度上克服了上述缺點，使得不可培養微生物的研究成為可能[30]，使葉際微生物組的分析較為全面完善。本研究對野生和栽培五味子葉際微生物群落16SrDNA V5～V7 段以及ITS1-1F段進行擴增子測序，構建小片段文庫，并基于IlluminaNovaseq測序平臺對文庫進行雙末端測序。DADA2方法比傳統的OTU方法更加敏感和特異，能夠檢測到OTU方法遺漏的真實生物變異，輸出的假序列更少[31]。同時，ASVs替代OTU提高了標記基因數據分析的準確性、全面性和可重復性[32]。經過Reads拼接過濾、ASVs降噪，對得到的有效數據進行物種

圖9KEGG代謝通路預測圖

Fig.9 KEGG metabolicpathway prediction diagram

注釋及豐度分析，從而揭示野生品與栽培品葉際微生物群落組成；進一步的 α 多樣性分析挖掘出野生品種與栽培品種樣本間群落結構的差異。對多樣性及結構差異進行分析，并通過對不同微生物群落進行功能預測，為后續探究五味子野生品種和栽培品種質量及品質差異提供理論參考。

3.2野生和栽培五味子葉際微生物的多樣性和群落組成結構存在差異

一方面，五味子野生品種和栽培品種葉際微生物物種豐富度和群落均勻度均為細菌優于真菌?？赡芟啾扔谡婢?，細菌在植株生長過程以及次生代謝中起到更加重要的調節作用。另一方面，野生品種葉際細菌、真菌群落豐富度和多樣性均優于栽培品種。推測栽培品種由于人力因素如統一耕種、施肥管理等，微生物群落結構較為單一，野生品種由于其所處地理環境復雜，群落結構較為多樣。物種豐富度越高、優勢菌群越不明顯，抵抗力和穩定性就越大，其中所含有的微生物功能也更加多樣化、抵御環境變化的能力也就越強。說明野生品種比栽培品種更能適應外界因素的變化，豐富多樣的微生物群落可幫助野生五味子抵抗逆境環境的侵害。

在本研究中，發現野生與栽培五味子葉際微生物群落結構差異較大，且野生品種葉際細菌及真菌的豐富度和分布均勻度均高于栽培品種。說明人工種植在一定程度上改變了五味子葉際微生物的群落結構，使其豐度和多樣性有所降低。主要表現為，一是野生五味子葉際細菌群落主要以甲基桿菌屬（Methylobacterium-Methylorubrum，4.47%～49.27%） 和鞘氨醇單胞菌屬（Sphin-gomonas， 8.29%～19.45%） 為優勢菌群；栽培五味子中優勢菌群為甲基桿菌屬（ 6.44%～ 65.24% ）和弧菌屬 （Vibrio，0.42%～21.34%） ！且野生五味子優勢菌群相對豐度占比均高于栽培五味子。二是野生五味子葉際真菌群落中優勢菌屬為枝孢屬（Cladosporium11. 27%～27. 22%） 和鏈格孢屬（Alternaria， 0.12%～5.95%） ；栽培五味子中以外囊菌屬 （12.90%～68.55%） 為主。

3.3植物自身及周圍環境會塑造獨特的葉際微生物群落

從多樣性和豐富度方面來看，野生五味子葉際微生物群落優于栽培五味子。推測在人工栽培條件下，五味子植株生長在較為穩固的生態系統中，土壤理化、氣候、環境等影響因子相比于野生系統而言較為單一。分析栽培五味子葉際微生物群落結構，發現有優勢菌群甲基桿菌屬的出現，相對豐度占比很高，推測在栽種五味子葉際生態群落中，甲基桿菌屬的出現對某些相對豐度占比較低菌屬的生長起到了抑制或影響作用。說明人工栽培有助于群落中優勢菌群的富集和生長。進一步分析發現，假牛肝菌屬（Pseudorobillarda）、Knufia、Diatractium、Chaetosphaeronema、Mi-crocyclospora、Calloriaceae_gen_Incertae_se-dis、杯梗孢屬（Cyphellophora）、黑埋核盤菌屬（Pyrenopeziza）、腋無柄孢屬（Alatosessilispora）、座囊菌屬（Dothidea）和殼月孢屬（Selenoph-oma）多達11個葉際真菌菌屬均為野生五味子獨有。戈盧別夫氏菌屬（Golubeuia）在栽培五味子葉際真菌中相對豐度最大占比高達 31.36% ，而在野生五味子中未被發現。

3.4野生與栽培五味子葉際微生物差異造成次生代謝物差異

基于COG數據庫和KEGG通路預測分析五味子葉際微生物群落功能，發現葉際微生物群落中與氨基酸代謝、能量代謝、脂質代謝、核苷酸代謝、生物降解和代謝以及萜類化合物和聚酮類化合物的生物合成與代謝功能有關的菌群相對豐度占比較高，且上述功能相對豐度占比多為野生品種高于栽培品種。說明相較于栽培品種而言，野生品種五味子植株生理活動更為旺盛，分泌次生代謝產物更多。由本研究數據可知，野生品種中鞘氨醇單胞菌屬相對豐度占比高于栽培品種。多項研究表明，鞘氨醇單胞菌屬細菌在促進植物生長方面發揮著重要作用[33-34]，可通過產生赤霉素、水楊酸、吲哚乙酸和脫落酸等植物激素來促進植物發芽和生長。通過產生植物生長激素，鞘氨醇單胞菌屬在植物非生物脅迫耐受性[35]、降解和生物轉化多環芳烴、生物修復和環境污染物的生物降解中發揮著至關重要的作用[36-37]。推測鞘氨醇單胞菌群的豐度差異是造成野生品種與栽培品種植株次生代謝產物不同的原因。此外，有研究發現，隸屬于菌屬Georgenia的菌株可分泌細胞外淀粉酶、果膠酶和蛋白酶，具有多種促進植物生長的特性和生物催化潛力，意味著其在提高作物產量和質量方面的應用[38]，而Georgenia 是野生品種特有的一屬細菌，其存在或許會影響野生品種與栽培品種五味子品質差異。后續可基于本研究中微生物組數據，挖掘出與五味子植株代謝功能相關聯的葉際菌群，分析此類菌群在野生和栽培五味子葉際微生物群落中的差異，進一步研究該菌群與次級代謝產物的互作關系。

圖10葉際微生物COG功能分類

Fig.10Classification of COG function of Phyllosphere microorganism

圖11PICRUSt2功能注釋聚類熱圖

Fig.11 PICRUSt2 functional annotation clustering heat map7

4結論

野生五味子植株葉際細菌及真菌豐富度和多樣性均高于栽培五味子；野生品種葉際細菌群落優勢菌屬為甲基桿菌屬（Methylobacterium-Methylorubrum）、弧菌屬（Vibrio）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和假單胞菌屬（Pseudo-monas），葉際真菌群落優勢菌屬為外囊菌屬（Taphrina）、枝孢屬（Cladosporium）和鏈格孢屬（Alternaria）；栽培品種葉際細菌群落優勢菌屬主要為甲基桿菌屬，葉際真菌群落優勢菌屬主要為外囊菌屬、枝孢屬和Vishniacozyma；五味子葉際微生物群落主要功能類群與五味子植株次生代謝產物合成及能量代謝相關。脂類運輸與代謝、萜類化合物和聚酮類化合物代謝及能量產生類功能方面相對豐度占比野生品種顯著高于栽培品種。

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Diversity，Structural Differences and Functional Predictions of Microbial Communities in Wild and Cultivated Schisandra chinensis Leaves

WU Yutong1'3 ，WANG Ruolin1.3 ，YAN Xia1' and HUANG Lili2，3

1.CollegeofLifeScience，Northwest Aamp;FUniversityYangling Shaanxi7121oo，China;2.CollegeofPlantProtection Northwest Aamp;F University，Yangling Shaanxi71210o，China;3.State Key Laboratory for Crop Stress Resistance and High-Efficiency Production，Northwest Aamp;F University，Yangling Shaanxi7121oo，China）

Abstract This study used high-throughput sequencing to determine the richness，diversity，community composition，and structural differences in the microbial communities of wild and cultivated Schisandra chinensis leaves.Functional predictions for various microbial communities were conducted，providing a reference for further research on how microbial communities in wild and cultivated Schisandra chinensis leaves affect plant secondary metabolism.DNA fragments of microbial communities associated with wild and cultivated Schisandra chinensis leaves were sequenced using the Ilumina Novaseq platform，and the resulting effective data were subjected to species annotation and abundance analysis to reveal the sample species composition，further alpha diversity and beta diversity analyses were conducted to explore differences in community structure.The annotation results of the amplicons were correlated with the corresponding functional databases，and PICRUSt2 software was used for functional prediction.The results showed that at the bacterial level，wild and cultivated species had 2 525 and 1 516 Amplicon Sequence Variants （ASVs），respectively，with 408 ASVs in common. At the fungal level，there were 883 and 368 ASVs，with 105 ASVs shared. The genus Methylobacterium-Methylorubrum and Sphingomonas were more abundant in wild leaf bacteria，while Methylobacterium-Methylorubrum were dominant in cultivated leaves. The genus Cladosporium was more abundant in wild leaf fungi，whereas Taphrina and Cladosporium was dominant in cultivated fungi.Functional predictions using PICRUSt2 and KEGG pathway analysis indicated that wild varieties exhibited higher relative abundances in lipid transport and metabolism，terpenoid and polyketide metabolism，and energy production compared to cultivated varieties.In conclusion，the richness and diversity of phyllospheric microorganisms in wild Schisandra chinensis are higher than those in cultivated varieties. The microbial communities associated with the synthesis of secondary metabolites and energy production are also moreabundant in planted varieties.

Key words Schisandra chinensis; Phyllosphere microorganisms; Secondary metabolites; Communi ty diversity；Structural analysis；Functional prediction

Received 2023-11-30 Returned 2023-12-28

Foundation itemNational Key Ramp;D Program of China （No.2021YFD10o020O）;National Natural Science Foundation of China （No. 32072477）.

First authorWU Yutong，female，master student. Research area： microbial resource utilization. E-mail：18103699151@163.com

Corresponding authorYAN Xia，female， professor，doctoral supervisor. Research area：microbial resource utilization. E-mail：yanxia@ nwsuaf. edu. cn

HUANG Lili，female，professor，doctoral supervisor. Research area： plant pathology research. E-mail ：huanglili@nwsuaf. edu. cn

（責任編輯：郭柏壽 Responsible editor：GUOBaishou）