野生與栽培五味子葉際微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)差異及功能預(yù)測(cè)分析

五味子[Schisandrachinensis（Turcz.）Baill.為五味子科（SchisandraceaeBlume.）五味子屬（SchisandraMichx.）多年生落葉藤本植物[]，屬于國(guó)家三級(jí)重點(diǎn)保護(hù)藥用植物品種[2]據(jù)《中華本草》記載，五味子屬植物用藥部位包括根、莖、葉和果實(shí)[3]，具有益氣生津、斂肺止咳、補(bǔ)腎寧心的功效。現(xiàn)代研究揭示五味子在心血管類(lèi)疾病、呼吸系統(tǒng)類(lèi)疾病、抗腫瘤和增強(qiáng)免疫力方面具有廣闊應(yīng)用前景[4]，是極具開(kāi)發(fā)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益的中藥材。

五味子在中藥材市場(chǎng)需求量逐年增加，其成分與品質(zhì)越來(lái)越受到重視。作為藥用植物，五味子次生代謝產(chǎn)物豐富，發(fā)揮藥理作用的化學(xué)成分主要是三萜類(lèi)化合物、木脂素類(lèi)、多糖類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、黃酮類(lèi)以及脂肪酸等[5]，化合物成分含量的高低可成為五味子質(zhì)量?jī)?yōu)劣的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。研究發(fā)現(xiàn)，五味子野生品種與栽培品種中次生代謝物存在一定差異，藥用活性也有所不同[。丁璞等[7評(píng)價(jià)五味子藤莖品質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，野生品種中木脂素含量高于栽培品種；貝雷等8比較伊春地區(qū)野生與栽培北五味子木脂素成分中醇甲含量差別，發(fā)現(xiàn)野生品種次生代謝物中醇甲含量高于栽培品種；侯冬巖等比較野生品種與栽培品種五味子脂肪酸成分時(shí)發(fā)現(xiàn)，野生五味子脂肪酸種類(lèi)低于栽培五味子；陳舒妤9測(cè)定野生品種與栽培品種五味子中木脂素及有機(jī)酸成分的含量，數(shù)據(jù)表明野生品種木脂素含量較高，而栽培品種有機(jī)酸含量較高。李承范等[10]通過(guò)ICP-MS法測(cè)定五味子中微量元素含量，發(fā)現(xiàn)野生品種微量元素總量明顯高于栽培品種，且有害元素鉛、鎘和碑的含量明顯低于栽培品種。田進(jìn)國(guó)等[11利用紅外光譜鑒別北五味子野生和栽培品種得出結(jié)論，二者主要成分的組成相似，但各主要成分相對(duì)含量有明顯差異。已有報(bào)道表明，五味子野生品種與栽培品種會(huì)因生態(tài)環(huán)境、采收時(shí)間等不同使其積累的代謝產(chǎn)物產(chǎn)生差異，導(dǎo)致品質(zhì)參差不齊[12-14]。產(chǎn)地、藥用部位、采收與加工時(shí)間、貯存與運(yùn)輸方式、炮制方法等均可成為影響五味子質(zhì)量的因素[15]

近年來(lái)，隨著微生物組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)微生物與宿主植物相互作用往往可以合成新的藥用先導(dǎo)化合物[16]。葉際微生物可直接或間接地通過(guò)調(diào)節(jié)植物次生代謝參與許多重要生理活動(dòng)，如植物生長(zhǎng)發(fā)育、先天免疫、趨避病蟲(chóng)、防御反應(yīng)和對(duì)環(huán)境脅迫的反應(yīng)等[17]，葉際菌群不僅能夠獨(dú)立產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物，還能參與植物次生代謝產(chǎn)物的合成以及對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化[18]。葉際微生物作為一類(lèi)前景廣闊的資源微生物受到越來(lái)越多的關(guān)注[19]。

目前，有關(guān)五味子的研究多集中在用藥規(guī)律、栽培技術(shù)、次生代謝產(chǎn)物成分以及微生物群落的相關(guān)研究[20]。但是，在五味子野生品種和栽培品種的微生物相關(guān)研究中，葉際微生物組的差異的研究尚不清楚。本研究通過(guò)高通量測(cè)序?qū)Ρ汝兾鞯貐^(qū)野生品種和栽培品種北五味子葉際微生物群落組成結(jié)構(gòu)、豐富度及多樣性差異，并對(duì)不同微生物群落進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。在全面了解野生品種與栽培品種葉際群落多樣性及差異性基礎(chǔ)上，聯(lián)系其與五味子次生代謝調(diào)控的關(guān)系，以期揭示葉際微生物在五味子野生品種和栽培品種次生代謝差異中的貢獻(xiàn)，為五味子科研實(shí)踐及生產(chǎn)提供理論參考。

1材料與方法

1.1 材料

五味子野生和栽培葉片樣品于2023年7月自陜西省商洛市柞水縣采集，分為野生組葉片（Wildleaves，WL）和栽培組葉片（Plantedleav-es，PL），每組各選擇形狀大小相近的樣品做5個(gè)重復(fù)處理，共10個(gè)樣本，分別標(biāo)記為WL1、WL2、WL3、WL4、WL5、PL1、PL2、PL3、PL4、PL5。將葉片放入自封袋中，做好標(biāo)記，冷凍保存至 -80°C 冰箱，備用。

1.2葉際微生物群落高通量測(cè)序

葉片樣品送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行DNA提取和擴(kuò)增子測(cè)序。先提取收集到樣品的DNA，對(duì)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后對(duì)DNA進(jìn)行質(zhì)檢，隨后將目的片段回收并進(jìn)行定量，構(gòu)建文庫(kù)后上機(jī)測(cè)序。采用IluminaNo-vaseq測(cè)序平臺(tái)，以細(xì)菌16SrDNA V5～V7 區(qū)（通用引物： 5^′ -AACMGGATTAGATACCCKG，3^′ -ACGTCATCCCCACCTTCC）和真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1-1F（通用引物： 5^′ -CTTGGTCATT-TAGAGGAAGTAA， 3^′ -GCTGCGTTCTTCA-TCGATGC）為靶點(diǎn)，對(duì)10組葉片樣品進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序所得的可信目標(biāo)序列將用于后續(xù)分析。

1.3 信息分析

1.3.1測(cè)序數(shù)據(jù)處理根據(jù)所擴(kuò)增的區(qū)域特點(diǎn)構(gòu)建小片段文庫(kù)，基于IlluminaNovaseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行雙末端測(cè)序，再根據(jù)barcode進(jìn)行拆分獲得每個(gè)樣品的原始數(shù)據(jù)。原始數(shù)據(jù)存在一定比例的干擾數(shù)據(jù)，為了使信息分析的結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，首先去除barcode和引物，并通過(guò)Flash軟件對(duì)R1和R2序列原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，對(duì)拼接的Tags進(jìn)行質(zhì)控，得到CleanTags，再進(jìn)行嵌合體過(guò)濾，得到可用于后續(xù)分析的EffectiveTags。

1.3.2ASVs聚類(lèi)和物種注釋根據(jù)質(zhì)控后的EffectiveTags，使用QIIME2軟件中的DADA2模塊進(jìn)行降噪[21]，不再以相似度聚類(lèi)，只進(jìn)行去重或者說(shuō)相當(dāng)于以 100% 相似度聚類(lèi)22，使用DADA2降噪后產(chǎn)生的每個(gè)去重序列稱(chēng)為ASV。過(guò)濾掉豐度小于5的序列，獲得最終的ASVs（AmpliconSequenceVariants）及特征表。使用QIIME2軟件中的classify-sklearn模塊[23]將得到的ASVs與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，根據(jù)ASVs注釋結(jié)果和各樣品特征表，獲得界、門(mén)、綱、目、科、屬、種水平物種豐度表。16S區(qū)域使用Silva138.1數(shù)據(jù)庫(kù)注釋?zhuān)琁TS區(qū)域使用UNITEv8.2數(shù)據(jù)庫(kù)注釋。

1.3.3 樣本多樣性分析Alpha Diversity（Al-pha多樣性）用于分析樣本內(nèi)微生物群落多樣性[24]。利用QIIME2軟件進(jìn)行稀釋曲線的繪制和樣本多樣性分析，其中以Chao1稀釋曲線反映群落中ASVs豐度，以Chaol分析指數(shù)、Shannon分析指數(shù)反映Alpha多樣性，以評(píng)估各樣本中微生物群落豐富度和多樣性的差異。

1.3.4分組樣本間群落結(jié)構(gòu)差異分析BetaDiversity（Beta多樣性）是對(duì)不同樣本的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較和分析。首先根據(jù)所有樣本的物種注釋結(jié)果和特征序列豐度信息，將相同分類(lèi)的特征序列信息合并處理得到物種豐度信息表，同時(shí)利用特征序列之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系計(jì)算Unif-rac（Unweightedunifrac）距離[25]，再利用特征序列豐度信息對(duì)Unweightedunifrac距離進(jìn)一步構(gòu)建Weightedunifrac距離[26]，最后通過(guò)Beta多樣性指數(shù)組間差異分析及主坐標(biāo)分析（PrincipalCo-ordinatesAnalysis，PCoA）從中發(fā)現(xiàn)不同樣本（組）間的差異。通過(guò)SVG繪圖方法繪制出各樣本（組）對(duì)應(yīng)的物種注釋結(jié)果在不同分類(lèi)層級(jí)上的相對(duì)豐度柱形圖，分析分組樣本間的群落結(jié)構(gòu)差異；根據(jù)所有樣本在不同分類(lèi)水平的物種注釋及豐度信息采用R（Version3.1.O）pheatmap包繪制物種豐度聚類(lèi)熱圖，從物種層面進(jìn)行聚類(lèi)，以便發(fā)現(xiàn)物種在各樣本中聚集含量的高低；最后通過(guò)R（Version3.5.3）軟件選用 χ_t -test統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)分組樣本的物種組成和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

1.3.5功能預(yù)測(cè)擴(kuò)增子的注釋結(jié)果和相應(yīng)的COG（Cluster of Orthologous Groups）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）功能數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)聯(lián)，選用R（Version4.0.3）軟件對(duì)生態(tài)樣本中的微生物群落通過(guò)PICRUSt2（Phy-logenetic Investigation of Communities by Re-constructionofUnobservedStates）進(jìn)行功能預(yù)測(cè)分析，包括 Ψ_t -test檢驗(yàn)和功能豐度聚類(lèi)熱圖展示。

2 結(jié)果與分析

2.1野生和栽培五味子葉際微生物多樣性差異分析2.1.1Alpha多樣性分析基于Chaol指數(shù)的稀釋曲線結(jié)果顯示，在測(cè)序初期，隨著橫坐標(biāo)增大，各組曲線縱坐標(biāo)均出現(xiàn)急劇上升。這表明在測(cè)序初期階段，樣本中發(fā)現(xiàn)大量物種，新物種集中涌現(xiàn)。當(dāng)測(cè)序量高于10000后，各組曲線均已到達(dá)平臺(tái)期，縱坐標(biāo)不再顯著上升，表明大部分微生物多樣性已產(chǎn)生，即使測(cè)序深度繼續(xù)增加也不會(huì)再發(fā)現(xiàn)新的物種，說(shuō)明測(cè)序深度足夠，本次測(cè)序樣本量充足且測(cè)序結(jié)果可信，此時(shí)數(shù)據(jù)分析結(jié)果可靠（圖1）。

圖1葉際微生物群落Chao1指數(shù)稀釋曲線

Fig. 1 Rarefaction curves of leaf microbial community

對(duì)不同樣品的Alpha多樣性分析，結(jié)合不同類(lèi)型的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析指數(shù)，對(duì)微生物群落的豐富度和多樣性進(jìn)行評(píng)估。Chao1指數(shù)表明相較于野生品種，栽培品種葉際微生物中細(xì)菌、真菌群落豐富度總體偏低（圖2-A，圖2-C）；群落多樣性及均勻度方面，Shannon指數(shù)反映野生品種細(xì)菌、真菌微生物群落多樣性總體高于栽培品種，且野生品種中物種均勻度更好（圖2-B，圖2-D）。總的來(lái)看，五味子野生品種葉際細(xì)菌、真菌微生物群落豐富度和多樣性均較栽培品種高，且差異較為顯著。此外，野生品種和栽培品種組間真菌群落豐富度和多樣性較細(xì)菌差異更大。

圖2葉際微生物群落AIpha多樣性指數(shù)差異統(tǒng)計(jì)

Fig.2Differences in Alpha diversity index of interleaf microbial communities

2.1.2ASVs（Amplicon Sequence Variants）聚類(lèi)分析對(duì)細(xì)菌、真菌微生物群落進(jìn)行Venn 圖分析，聚焦不同樣本中共有及獨(dú)有微生物數(shù)目。野生品種和栽培品種葉片中共發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌ASVs總數(shù)為4041個(gè)，其中野生與栽培品種五味子細(xì)菌ASVs數(shù)量分別為2525和1516個(gè)，兩者共有的ASVs數(shù)目為408個(gè)，特有ASVs數(shù)量分別為2117和1108個(gè)（圖3-A）；野生和栽培品種葉片中共發(fā)現(xiàn)的真菌ASVs總數(shù)為1251個(gè)，其中野生五味子與栽培品種五味子真菌ASVs數(shù)量分別為883和368個(gè)，兩者共有的ASVs數(shù)目為105個(gè)，特有ASVs數(shù)量分別為778和263個(gè)（圖3-B）。分析發(fā)現(xiàn)葉際細(xì)菌分別占各自樣本所有物種的 16.16% （野生品種）和 26.91% （栽培品種），葉際真菌則分別占 11.89% 和 28.53% 。從各樣本中獨(dú)有微生物情況來(lái)看，野生品種獨(dú)有細(xì)菌及真菌ASVs數(shù)目均比栽培品種多，可以對(duì)獨(dú)有部分微生物進(jìn)行進(jìn)一步分析。

圖3葉際菌群韋恩圖

Fig.3Venn diagram of leaf microbiota

2.2野生和栽培五味子葉際微生物群落組成結(jié)構(gòu)及差異分析

2.2.1主坐標(biāo)分析顯示群落結(jié)構(gòu)差異為探索野生品種和栽培品種葉際微生物的變異，在ASV水平上采用基于Bray-Curtis的PCoA對(duì)樣本進(jìn)行Beta多樣性分析。葉際細(xì)菌群落分析顯示，野生品種樣本和栽培品種樣本各自聚集在一起，組間明顯分離（圖4-A）。基于UnweighteduniFrac距離的PCoA分析證實(shí)了這種現(xiàn)象（圖4-B）。葉際真菌群落分析發(fā)現(xiàn)野生品種樣本和栽培品種樣本分離更明顯（圖4-C）。基于UnweighteduniF-rac距離的PCoA分析表明這兩組樣品完全分離（圖4-D）。表明野生品種和栽培品種五味子葉際微生物群落存在顯著差異，真菌群落差異更顯著。

圖4葉際微生物群落PCoA分析圖

Fig.4PCoA analysisof leafmicrobial communities

2.2.2野生五味子與栽培五味子葉際細(xì)菌群落組成五味子葉際細(xì)菌群落在門(mén)水平上，野生品種的相對(duì)豐度占比處于前五的為變形菌門(mén)（Pro-teobacteria， 56.06%～80.18%） 、放線菌門(mén)（Acti-nobacteria， 13.13%～35.53%） 、厚壁菌門(mén)（Firmicutes，0. 15%～3 ： 30% ）、放線桿菌門(mén)（Acti-nobacteriota，O. 18%～2 一 66% ）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidota，O. 20%～1.34%） ；栽培品種中細(xì)菌類(lèi)群的優(yōu)勢(shì)菌群是變形菌門(mén)，相對(duì)豐度占比最高達(dá) 89.64% ，隨后依次為放線菌門(mén) （2.09%～ 7.32% ）、厚壁菌門(mén) （3.07%～7.85%） 和藍(lán)藻菌門(mén)（Cyanobacteria， 0.00%～13.30%） （圖5-A）。野生五味子葉際細(xì)菌在門(mén)水平上的組成與栽培五味子相似，但野生品種放線菌門(mén)細(xì)菌相對(duì)豐度占比高于栽培品種，栽培品種變形菌門(mén)相對(duì)豐度占比略高于野生品種。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，PL4樣本相較于其他樣本藍(lán)藻菌門(mén)相對(duì)豐度較高，占比達(dá)13.30% ，且其余菌門(mén)相對(duì)豐度較低，推測(cè)藍(lán)藻菌門(mén)的存在會(huì)抑制其余優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的生長(zhǎng)。

屬水平上，野生品種葉際細(xì)菌相對(duì)豐度占比處于前5的為甲基桿菌屬（Methylobacterium-Methylorubrum 4.47%～49.27% 、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas 8.29%～19.45%） 、假單胞菌屬（Pseudomonas， 0. 05%～19. 37%） 、金黃色單胞菌屬（Aureimonas， 2.13%～10.66%） 和動(dòng)球菌屬（Kineococcus， 1.28%～9.75%） ；栽培品種葉際細(xì)菌類(lèi)群的優(yōu)勢(shì)菌屬為甲基桿菌屬1 （6，44%～65.24%） ，其次分別為弧菌屬（Vibrio，0.42%～21 ， 34% ）、假單胞菌屬（0. 33%～ 8.72% ）、鞘氨醇單胞菌屬 （0.31%～5.37%） 和鏈球菌屬（Streptococcus， 1. 17%～3. 90%） （圖5-C）。野生品種和栽培品種葉際細(xì)菌群落在屬水平上的組成存在差異，野生品種鞘氨醇單胞菌屬、假單胞菌屬、金黃色單胞菌屬、動(dòng)球菌屬、Naka-murella、Variovorax、胺桿菌屬（Amnibacteri-um）、Klenkia、Friedmanniella和類(lèi)諾卡氏屬（Nocardioides）細(xì)菌相對(duì)豐度明顯高于栽培品種。Georgenia是野生品種特有的一屬細(xì)菌，該屬為革蘭氏陽(yáng)性菌，好氧或兼性厭氧，非產(chǎn)孢，能分泌氧化酶和過(guò)氧化氫酶；栽培品種葉際微生物群落中甲基桿菌屬、弧菌屬、氣單胞菌屬（Aeromonas）、假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）、Patulibacter、鏈球菌屬和氣球菌屬（Aerococcus）細(xì)菌相對(duì)豐度高于野生品種。總的來(lái)看，野生品種相較于栽培品種葉際細(xì)菌群落豐富度更高，物種組成也更豐富。甲基桿菌屬為五味子葉際細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬，在野生品種和栽培品種中相對(duì)豐度占比均為最高。

2.2.3野生五味子與栽培五味子葉際真菌群落組成野生品種和栽培品種葉片樣本經(jīng)ITS高通量測(cè)序后，基于不同分類(lèi)水平的物種注釋結(jié)果，繪制出各樣品在不同分類(lèi)層級(jí)上對(duì)應(yīng)的相對(duì)豐度柱形圖。

屬水平上，野生品種葉際真菌相對(duì)豐度占比處于前五的為枝孢屬（Cladosporiuml1. 27%～ 27.22% ）、外囊菌屬（Taphrina，0. 05%～ 22.58% ）Tricellula （1.47%～18.37%） 、鏈格孢屬（Alternaria， ）.12%～5.95%） 和Vishniaco-zyma（0，29%～2.92%） ;栽培品種中相對(duì)豐度占比處于前五的葉際真菌為外囊菌屬 （12.90%～ 68.55% 、枝孢屬 （20.51%～41.62%） 、Golubeu-ia（0，03%～31.36%） 、Vishniacozyma（1 .54%～ 15.38% 和鏈格孢屬 （0.47%～7.79%） （圖5-D）。野生品種和栽培品種葉際真菌群落組成在屬水平存在較大差異，優(yōu)勢(shì)真菌外囊菌屬和枝孢屬在相對(duì)豐度占比方面表現(xiàn)為栽培品種顯著多于野生品種，此外，栽培品種Vishniacozyma和鏈格孢屬真菌相對(duì)豐度占比也略高于野生品種；野生品種Tricellula、亞隔孢殼屬（Didymella）、多臂菌屬（Trichomerium）線黑粉酵母屬（Filobas-idium）黑團(tuán)孢屬（Periconia）、異莖點(diǎn)霉屬（ Pa- raphoma）真菌相對(duì)豐度占比略多于栽培品種。假牛肝菌屬（Pseudorobillarda）、Knufia、Di-atractium、Chaetosphaeronema、Microcyclospo-ra、Calloriaceae_gen_Incertae_sedis、杯梗孢屬（Cyphellophora）、黑埋核盤(pán)菌屬（Pyrenopez-iza ）、腋無(wú)柄孢屬（Alatosessilispora）、座囊菌屬（Dothidea）和殼月孢屬（Selenophoma）多達(dá)11種真菌菌屬為野生品種獨(dú)有；戈盧別夫氏菌屬（Golubeuia）在栽培品種葉際真菌中相對(duì)豐度最大占比高達(dá) 31.36% ，而在野生品種中未被發(fā)現(xiàn)。這些結(jié)果表明野生品種葉際真菌群落相較于栽培品種豐富度更高，物種組成更豐富。

2.2.4野生與栽培五味子葉際細(xì)菌差異分析為進(jìn)一步探究野生品種與栽培品種葉際細(xì)菌群落差異，在 Plt;0.05 顯著性水平分析門(mén)和屬分類(lèi)單元。門(mén)水平上，占細(xì)菌群落主要組成的放線菌門(mén)存在顯著差異，野生品種葉際細(xì)菌放線菌門(mén)相對(duì)豐度平均占比為 23.58% ，顯著高于栽培品種的4.34% （圖6-A）；屬水平上，野生品種與栽培品種存在顯著差異的主要有11屬細(xì)菌，其中野生品種相對(duì)豐度平均占比顯著高于栽培品種的有9個(gè)屬，分別為鞘氨醇單胞菌屬（ WL：13. 17% ，PL：5.13% ）、金黃色單胞菌屬 （WL：4. 99% ，PL：0.31% ）、Klenkia（WL：3. 46% ，PL： 0.56% ）、諾卡氏菌屬（Nocardioides，WL：2. 55% ，PL：0.05% ）、放線孢菌屬（Actinomycetospora，WL：0.67% ，PL： 0.02% ）、蛭弧菌屬（Bdellovibrio，WL：0. 21% ，PL：0. 03% ）、棒形桿菌屬（Claui-bacter， WL ：0. 16% ，PL：0. 11% ）、Pseudokineo-coccus （WL： 0. 15% ，PL：0. 00% ）和Jatrophi-habitans （WL：0.10% ，PL： 0.01% ），栽培品種葉際細(xì)菌屬相對(duì)豐度平均占比高于野生品種的為氣單胞菌屬（WL：1. 49% ，PL：6. 00% ）和鏈球菌屬（Streptococcus， WL：0.59% PL：2.35% （圖6-B）。

2.2.5野生與栽培五味子葉際真菌差異分析通過(guò) t -test檢驗(yàn)在 Plt;0. 05 顯著性水平對(duì)五味子葉際真菌在屬分類(lèi)單元分析結(jié)果如圖7所示，共有7個(gè)屬的真菌在野生品種和栽培品種之間存在顯著差異，其中野生品種相對(duì)豐度平均占比高于栽培品種的有5屬，分別為亞隔孢殼屬 （Didy- mella， WL：3.98% ， PL：0.02%） 、節(jié)枝孢屬 （Ar^- ticulospora， ，PL：0. 04% ）、穴殼屬（Dothiora，WL：0. 78% ，PL： 0.00% ）、Boeremia（WL：0.36% ，PL： 0.00% 和Setophaeosphaeria（WL：0.19%，PL：0.00%） ，栽培品種中真菌相對(duì)豐度平均占比較高的屬有外囊菌屬（WL：6.63% ，PL：44. 67% ）和枝孢屬 WL：20.19% ，PL：32.34% 。

2.2.6物種豐度聚類(lèi)熱圖揭示野生與栽培五味子葉際微生物群落結(jié)構(gòu)差異關(guān)系為分析物種在各樣本中聚集含量的高低，選取豐度排名前35的屬繪制熱圖發(fā)現(xiàn)野生品種葉際細(xì)菌群落豐富度較栽培品種高，野生品種中相對(duì)豐度占比較高的屬于放線菌門(mén)，栽培品種中相對(duì)豐度占比較高的細(xì)菌群落屬于變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)（圖8-A）；野生品種5個(gè)重復(fù)樣本葉際真菌群落豐富度均較高，栽培品種中PL4、PL5葉際真菌群落豐度較高且主要集中于Vishniacozyma和Typhula（圖8-B）。

2.3野生與栽培五味子葉際微生物群落功能預(yù)測(cè)分析

2.3.1KEGG通路預(yù)測(cè)葉際微生物群落功能為探究五味子葉際微生物群落功能，使用

圖6葉際細(xì)菌不同分類(lèi)水平差異分布

Fig.6Differential distributionof leaf boundarybacteriaat different taxonomic levels

圖7葉際真菌屬水平差異分布

Fig. 7 Genusleveldistributionoffungalinleafarea

PICRUSt2通過(guò)16SrDNA基因測(cè)序結(jié)果比對(duì)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)果表明五味子葉際微生物中具有碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝和脂質(zhì)代謝功能的類(lèi)群豐度最高。其中碳水化合物代謝（?????? ， Plt;0. 000 1; 、氨基酸代謝 （** ，P=0.008 9 、脂代謝 （????，Plt;0.000 1） 萜類(lèi)和聚酮類(lèi)化合物代謝 （??，P=0，002 5） 功能基因相對(duì)豐度顯示，葉際微生物群落相對(duì)豐度占比野生品種顯著高于栽培品種（圖9）。

2.3.2葉際微生物基因功能分類(lèi)分析為進(jìn)一步探究五味子葉際細(xì)菌群落中的功能基因，在COG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其進(jìn)行功能分類(lèi)分析。結(jié)果表明豐度占比較大的基因?yàn)镈HRS3（COG1028），屬于短鏈脫氫酶家族（圖10）。研究表明短鏈脫氫酶可以通過(guò)參與植物次級(jí)代謝調(diào)控，如萜類(lèi)、酚類(lèi)、生物堿和類(lèi)固醇等的生物合成來(lái)調(diào)節(jié)植物生理生化反應(yīng)[27]。 χ_t -test 差異分析顯示，該類(lèi)短鏈脫氫酶家族基因豐度占比野生品種顯著高于栽培品種 （P=0.003 ，圖10）。

2.3.3聚類(lèi)熱圖揭示野生與栽培五味子預(yù)測(cè)功能差異進(jìn)一步利用PICRUSt2分析比較野生品種和栽培品種葉際微生物功能差異。聚類(lèi)分析結(jié)果顯示野生品種與栽培品種樣品各自生物學(xué)重復(fù)0 ?WL1～5，PL1～5） 聚集在一起，表明樣本具有較好的重復(fù)性。野生品種與栽培品種樣本在聚類(lèi)分析樹(shù)中相互分開(kāi)，表明不同樣本功能具有差異（圖11）。野生品種葉際菌群功能主要集中于次生代謝產(chǎn)物生物合成與分解代謝、脂類(lèi)及萜類(lèi)運(yùn)輸與代謝、氨基酸運(yùn)輸與代謝以及能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換，上述功能較栽培品活躍；栽培品種葉際菌群功能主要集中于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和防御機(jī)制。

3討論

3.1高通量測(cè)序在葉際微生物組研究中的應(yīng)用

近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于環(huán)境、化工、動(dòng)植物及微生物群落多樣性的研究[28]。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法耗時(shí)耗力，且有些在自然環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖的菌屬難以通過(guò)分離培養(yǎng)在營(yíng)養(yǎng)血內(nèi)獲得[18]，鑒定得到的菌屬不完全、多樣性較低[29]。第二代測(cè)序的出現(xiàn)一定程度上克服了上述缺點(diǎn)，使得不可培養(yǎng)微生物的研究成為可能[30]，使葉際微生物組的分析較為全面完善。本研究對(duì)野生和栽培五味子葉際微生物群落16SrDNA V5～V7 段以及ITS1-1F段進(jìn)行擴(kuò)增子測(cè)序，構(gòu)建小片段文庫(kù)，并基于IlluminaNovaseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行雙末端測(cè)序。DADA2方法比傳統(tǒng)的OTU方法更加敏感和特異，能夠檢測(cè)到OTU方法遺漏的真實(shí)生物變異，輸出的假序列更少[31]。同時(shí)，ASVs替代OTU提高了標(biāo)記基因數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性、全面性和可重復(fù)性[32]。經(jīng)過(guò)Reads拼接過(guò)濾、ASVs降噪，對(duì)得到的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行物種

圖9KEGG代謝通路預(yù)測(cè)圖

Fig.9 KEGG metabolicpathway prediction diagram

注釋及豐度分析，從而揭示野生品與栽培品葉際微生物群落組成；進(jìn)一步的 α 多樣性分析挖掘出野生品種與栽培品種樣本間群落結(jié)構(gòu)的差異。對(duì)多樣性及結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行分析，并通過(guò)對(duì)不同微生物群落進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，為后續(xù)探究五味子野生品種和栽培品種質(zhì)量及品質(zhì)差異提供理論參考。

3.2野生和栽培五味子葉際微生物的多樣性和群落組成結(jié)構(gòu)存在差異

一方面，五味子野生品種和栽培品種葉際微生物物種豐富度和群落均勻度均為細(xì)菌優(yōu)于真菌。可能相比于真菌，細(xì)菌在植株生長(zhǎng)過(guò)程以及次生代謝中起到更加重要的調(diào)節(jié)作用。另一方面，野生品種葉際細(xì)菌、真菌群落豐富度和多樣性均優(yōu)于栽培品種。推測(cè)栽培品種由于人力因素如統(tǒng)一耕種、施肥管理等，微生物群落結(jié)構(gòu)較為單一，野生品種由于其所處地理環(huán)境復(fù)雜，群落結(jié)構(gòu)較為多樣。物種豐富度越高、優(yōu)勢(shì)菌群越不明顯，抵抗力和穩(wěn)定性就越大，其中所含有的微生物功能也更加多樣化、抵御環(huán)境變化的能力也就越強(qiáng)。說(shuō)明野生品種比栽培品種更能適應(yīng)外界因素的變化，豐富多樣的微生物群落可幫助野生五味子抵抗逆境環(huán)境的侵害。

在本研究中，發(fā)現(xiàn)野生與栽培五味子葉際微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大，且野生品種葉際細(xì)菌及真菌的豐富度和分布均勻度均高于栽培品種。說(shuō)明人工種植在一定程度上改變了五味子葉際微生物的群落結(jié)構(gòu)，使其豐度和多樣性有所降低。主要表現(xiàn)為，一是野生五味子葉際細(xì)菌群落主要以甲基桿菌屬（Methylobacterium-Methylorubrum，4.47%～49.27%） 和鞘氨醇單胞菌屬（Sphin-gomonas， 8.29%～19.45%） 為優(yōu)勢(shì)菌群；栽培五味子中優(yōu)勢(shì)菌群為甲基桿菌屬（ 6.44%～ 65.24% ）和弧菌屬 （Vibrio，0.42%～21.34%） ！且野生五味子優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)豐度占比均高于栽培五味子。二是野生五味子葉際真菌群落中優(yōu)勢(shì)菌屬為枝孢屬（Cladosporium11. 27%～27. 22%） 和鏈格孢屬（Alternaria， 0.12%～5.95%） ；栽培五味子中以外囊菌屬 （12.90%～68.55%） 為主。

3.3植物自身及周?chē)h(huán)境會(huì)塑造獨(dú)特的葉際微生物群落

從多樣性和豐富度方面來(lái)看，野生五味子葉際微生物群落優(yōu)于栽培五味子。推測(cè)在人工栽培條件下，五味子植株生長(zhǎng)在較為穩(wěn)固的生態(tài)系統(tǒng)中，土壤理化、氣候、環(huán)境等影響因子相比于野生系統(tǒng)而言較為單一。分析栽培五味子葉際微生物群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)有優(yōu)勢(shì)菌群甲基桿菌屬的出現(xiàn)，相對(duì)豐度占比很高，推測(cè)在栽種五味子葉際生態(tài)群落中，甲基桿菌屬的出現(xiàn)對(duì)某些相對(duì)豐度占比較低菌屬的生長(zhǎng)起到了抑制或影響作用。說(shuō)明人工栽培有助于群落中優(yōu)勢(shì)菌群的富集和生長(zhǎng)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，假牛肝菌屬（Pseudorobillarda）、Knufia、Diatractium、Chaetosphaeronema、Mi-crocyclospora、Calloriaceae_gen_Incertae_se-dis、杯梗孢屬（Cyphellophora）、黑埋核盤(pán)菌屬（Pyrenopeziza）、腋無(wú)柄孢屬（Alatosessilispora）、座囊菌屬（Dothidea）和殼月孢屬（Selenoph-oma）多達(dá)11個(gè)葉際真菌菌屬均為野生五味子獨(dú)有。戈盧別夫氏菌屬（Golubeuia）在栽培五味子葉際真菌中相對(duì)豐度最大占比高達(dá) 31.36% ，而在野生五味子中未被發(fā)現(xiàn)。

3.4野生與栽培五味子葉際微生物差異造成次生代謝物差異

基于COG數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG通路預(yù)測(cè)分析五味子葉際微生物群落功能，發(fā)現(xiàn)葉際微生物群落中與氨基酸代謝、能量代謝、脂質(zhì)代謝、核苷酸代謝、生物降解和代謝以及萜類(lèi)化合物和聚酮類(lèi)化合物的生物合成與代謝功能有關(guān)的菌群相對(duì)豐度占比較高，且上述功能相對(duì)豐度占比多為野生品種高于栽培品種。說(shuō)明相較于栽培品種而言，野生品種五味子植株生理活動(dòng)更為旺盛，分泌次生代謝產(chǎn)物更多。由本研究數(shù)據(jù)可知，野生品種中鞘氨醇單胞菌屬相對(duì)豐度占比高于栽培品種。多項(xiàng)研究表明，鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌在促進(jìn)植物生長(zhǎng)方面發(fā)揮著重要作用[33-34]，可通過(guò)產(chǎn)生赤霉素、水楊酸、吲哚乙酸和脫落酸等植物激素來(lái)促進(jìn)植物發(fā)芽和生長(zhǎng)。通過(guò)產(chǎn)生植物生長(zhǎng)激素，鞘氨醇單胞菌屬在植物非生物脅迫耐受性[35]、降解和生物轉(zhuǎn)化多環(huán)芳烴、生物修復(fù)和環(huán)境污染物的生物降解中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[36-37]。推測(cè)鞘氨醇單胞菌群的豐度差異是造成野生品種與栽培品種植株次生代謝產(chǎn)物不同的原因。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，隸屬于菌屬Georgenia的菌株可分泌細(xì)胞外淀粉酶、果膠酶和蛋白酶，具有多種促進(jìn)植物生長(zhǎng)的特性和生物催化潛力，意味著其在提高作物產(chǎn)量和質(zhì)量方面的應(yīng)用[38]，而Georgenia 是野生品種特有的一屬細(xì)菌，其存在或許會(huì)影響野生品種與栽培品種五味子品質(zhì)差異。后續(xù)可基于本研究中微生物組數(shù)據(jù)，挖掘出與五味子植株代謝功能相關(guān)聯(lián)的葉際菌群，分析此類(lèi)菌群在野生和栽培五味子葉際微生物群落中的差異，進(jìn)一步研究該菌群與次級(jí)代謝產(chǎn)物的互作關(guān)系。

圖10葉際微生物COG功能分類(lèi)

Fig.10Classification of COG function of Phyllosphere microorganism

圖11PICRUSt2功能注釋聚類(lèi)熱圖

Fig.11 PICRUSt2 functional annotation clustering heat map7

4結(jié)論

野生五味子植株葉際細(xì)菌及真菌豐富度和多樣性均高于栽培五味子；野生品種葉際細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)菌屬為甲基桿菌屬（Methylobacterium-Methylorubrum）、弧菌屬（Vibrio）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和假單胞菌屬（Pseudo-monas），葉際真菌群落優(yōu)勢(shì)菌屬為外囊菌屬（Taphrina）、枝孢屬（Cladosporium）和鏈格孢屬（Alternaria）；栽培品種葉際細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)菌屬主要為甲基桿菌屬，葉際真菌群落優(yōu)勢(shì)菌屬主要為外囊菌屬、枝孢屬和Vishniacozyma；五味子葉際微生物群落主要功能類(lèi)群與五味子植株次生代謝產(chǎn)物合成及能量代謝相關(guān)。脂類(lèi)運(yùn)輸與代謝、萜類(lèi)化合物和聚酮類(lèi)化合物代謝及能量產(chǎn)生類(lèi)功能方面相對(duì)豐度占比野生品種顯著高于栽培品種。

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Diversity，Structural Differences and Functional Predictions of Microbial Communities in Wild and Cultivated Schisandra chinensis Leaves

WU Yutong1'3 ，WANG Ruolin1.3 ，YAN Xia1' and HUANG Lili2，3

1.CollegeofLifeScience，Northwest Aamp;FUniversityYangling Shaanxi7121oo，China;2.CollegeofPlantProtection Northwest Aamp;F University，Yangling Shaanxi71210o，China;3.State Key Laboratory for Crop Stress Resistance and High-Efficiency Production，Northwest Aamp;F University，Yangling Shaanxi7121oo，China）

Abstract This study used high-throughput sequencing to determine the richness，diversity，community composition，and structural differences in the microbial communities of wild and cultivated Schisandra chinensis leaves.Functional predictions for various microbial communities were conducted，providing a reference for further research on how microbial communities in wild and cultivated Schisandra chinensis leaves affect plant secondary metabolism.DNA fragments of microbial communities associated with wild and cultivated Schisandra chinensis leaves were sequenced using the Ilumina Novaseq platform，and the resulting effective data were subjected to species annotation and abundance analysis to reveal the sample species composition，further alpha diversity and beta diversity analyses were conducted to explore differences in community structure.The annotation results of the amplicons were correlated with the corresponding functional databases，and PICRUSt2 software was used for functional prediction.The results showed that at the bacterial level，wild and cultivated species had 2 525 and 1 516 Amplicon Sequence Variants （ASVs），respectively，with 408 ASVs in common. At the fungal level，there were 883 and 368 ASVs，with 105 ASVs shared. The genus Methylobacterium-Methylorubrum and Sphingomonas were more abundant in wild leaf bacteria，while Methylobacterium-Methylorubrum were dominant in cultivated leaves. The genus Cladosporium was more abundant in wild leaf fungi，whereas Taphrina and Cladosporium was dominant in cultivated fungi.Functional predictions using PICRUSt2 and KEGG pathway analysis indicated that wild varieties exhibited higher relative abundances in lipid transport and metabolism，terpenoid and polyketide metabolism，and energy production compared to cultivated varieties.In conclusion，the richness and diversity of phyllospheric microorganisms in wild Schisandra chinensis are higher than those in cultivated varieties. The microbial communities associated with the synthesis of secondary metabolites and energy production are also moreabundant in planted varieties.

Key words Schisandra chinensis; Phyllosphere microorganisms; Secondary metabolites; Communi ty diversity；Structural analysis；Functional prediction

Received 2023-11-30 Returned 2023-12-28

Foundation itemNational Key Ramp;D Program of China （No.2021YFD10o020O）;National Natural Science Foundation of China （No. 32072477）.

First authorWU Yutong，female，master student. Research area： microbial resource utilization. E-mail：18103699151@163.com

Corresponding authorYAN Xia，female， professor，doctoral supervisor. Research area：microbial resource utilization. E-mail：yanxia@ nwsuaf. edu. cn

HUANG Lili，female，professor，doctoral supervisor. Research area： plant pathology research. E-mail ：huanglili@nwsuaf. edu. cn

（責(zé)任編輯：郭柏壽 Responsible editor：GUOBaishou）