基于SRAP分子標記的石斛蘭雜交后代鑒定及其遺傳多樣性分析

中圖分類號：S567.239 文獻標識碼：A 文章編號：2095-5774（2025）02-0162-07

ldentificationand geneticdiversityanalysis of Dendrobium hybrid progeny based on SRAP markers

LinRongyan ^1，2 ，Chen Yiquan1，2，Lin Mi2，Wu Lijuan3，Zhong Haifengl，2* [1. Crop Research Institute，Fujian Academy of Agricultural Sciences （Fujian Germplasm Resource Center）， Fuzhou，Fujian 350013，China; 2.Fujian Engineering Research Center for Characteristic Floriculture，Fuzhou，Fujian35oo13，China; 3.Qingliu County Economic Crop Technology Promotion Station，Sanming，Fujian 365399，China]

Abstract：【Objective】The authenticity identification method of Dendrobium hybrid progeny based on SRAP marker technologywasconstructed to providereliable technical support for theidentificationof newvarieties（lines）ofDendrobium.【Method】Using SRAP markertechnology，theauthenticityidentificationand geneticdiversityanalysisof D primulinum，D.anosmumand 151 hybrid progeny which were from D .primulinum as female parent and D . anosmum as male parent were cariedout.【Result】7pairsof specific primers were screeed from 90 pairsofSRAP primers to achieve efficientidentification for hybrid progeny，with an efficiencyof 100% ；Polymorphism analysis showed that the polymorphismratioof7pairs of primers was 81.O3%，revealing richgenetic variation;Cluster analysis showed that153 sample materialscouldbedivided into five groups whenthegenetic distancewas O.24.Among them，82.78%of thehybrid progeny were clustered with male parent，and the genetic relationship was closer.The genetic similaritycoeficient among thehybrid progeny lines wasgenerally higherthanthat between themandthe twoparents，andthe genetic similarity coeffcient between the male parent and the hybrid progeny lines was close to that between the female parent and the hybrid progeny lines.【Conclusion】SRAPmarkercan beused for theearlyidentificationof thehybrid progenyof Dendrobium，which can effectively assist the identification and breeding of new varieties.

Keywords：Dendrobium; SRAPmarker technology; polymorphism; authenticity identification;genetic diversity;specific primer

石斛蘭是蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Den-drobiumSW.）植物的總稱，極具觀賞價值和藥用價值[1]。作為觀賞花卉植物，與蝴蝶蘭、萬代蘭、卡特蘭并稱為四大觀賞洋蘭；作為藥用植物，又稱為不死草、還魂草等，《中國藥典》記載金釵石斛、鐵皮石斛等具顯著藥效[2-3]。石斛蘭的育種起源于歐美地區，1874年世界上首個石斛蘭雜交品種誕生[4]，此后越來越多的石斛屬植物被應用于雜交實踐，20世紀50年代石斛蘭的雜交育種迎來全面且規模化的快速發展階段，在育種領域掀起熱潮，不斷孕育出更多具有新特性和觀賞價值的品種。

當前，雜交育種仍是石斛蘭育種的主流手段。王濤等[5]設計鐵皮石斛（D.officinale）與重唇石斛（D.hercoglossum）雜交，成功獲得具有雙親優勢的 F₁ 代；王燕君等[6]和張樂萍等[7]分別選育出觀賞石斛蘭新品種‘彩蝶石斛蘭’和‘玉桃石斛蘭'；易雙雙等[8-9]和于曉云等[10]也通過雜交選育出不同秋石斛新品種。石斛蘭雜交育種周期長，不僅需要持續投入大量人力、物力與財力，還可能成為制約育種效率提升的關鍵瓶頸。為了縮短育種周期，對雜交后代開展早期鑒定十分必要。相較于形態學方法鑒定周期長[1]、易受環境影響[12]、細胞學鑒定技術門檻較高的局限性，分子標記技術具有檢測快速、準確，不受環境影響等優勢，其能夠在基因組層面精準揭示雜交后代與親本之間的遺傳差異。近年來，DNA分子標記技術被大量運用于雜交后代的鑒定以及遺傳關系的研究中，包括SRAP[13]、ISSR[14]、RAPD[15]SSR[16]等分子標記技術。相關序列擴增多態性（SRAP）分子標記是一種基于PCR與DNA多態性的技術，可利用特定引物設計對整個未知序列的基因組進行擴增，產出多態性DNA片段[17]，筆者所在團隊前期采用SRAP分子標記建立秋石斛和春石斛的雜交后代鑒定體系[18-19]，表現出良好的重復性和穩定性，同時操作簡便、多態性豐富。SRAP分子標記技術也在其他植物遺傳多樣性評估、基因定位及雜交后代鑒定等領域廣泛[20-25]應用。

報春石斛（D.primulinum）色彩艷麗，花期較長，具有較高的觀賞價值和藥用價值[26]，檀香石斛（D.anosmum）花香酷似檀香，是良好的觀花植物[27]，同時也具有一定的藥用價值[28]。本研究利用SRAP分子標記對以報春石斛為母本、檀香石斛為父本的雜交后代進行鑒定，同時評估其遺傳多樣性，旨在為石斛蘭新品種選育提供關鍵遺傳信息，加速育種進程。

1材料與方法

1.1材料

以報春石斛、檀香石斛及以報春石斛為母本、檀香石斛為父本的151個雜交后代株系（編號：1-151）為試驗材料，均取自福建省農業科學院作物研究所特色蘭花工程化實驗室育種圃。試驗于2022年11月在福建省特色花卉工程技術研究中心花卉分子實驗室進行。

1.2試驗方法

1.2.1基因組總DNA的提取

采用改良CTAB法[29]提取親本及其雜交后代新株系葉片基因組總DNA，經 1% 瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測其完整性和濃度后統一稀釋至50ng/μL ，置于 -20% 條件下保存備用。

1.2.2SRAP-PCR擴增及引物篩選

石斛蘭SRAP-PCR反應體系的總體積為25μL ，其中含 Mg²⁺ 的Buffer 2.5μL ， 2.5mmol/L 的dNTPs 2.0μL ， 5U/μL 的Taq聚合酶 0.3μL ，模板DNA、上游引物、下游引物均為 1.0μL ， ddH₂O 17.2μL 。采用變溫復性反應程序進行PCR擴增，通過 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳分離產物，獲得電泳圖譜并拍照保存。以父本中能擴增出特異性條帶，而母本中擴增不出相應條帶為標準，對設計合成的90對SRAP引物進行篩選。

1.2.3石斛蘭雜交后代真實性鑒定

利用篩選出的特異性引物對151個雜交后代株系進行SRAP-PCR擴增，若雜交后代具有父本特征條帶，則可判定其為真雜種。

1.2.4數據分析

觀察分析電泳圖譜并統計DNA條帶數，同一遷移位置有擴增條帶記為1，無條帶則記為0，據此在Excel軟件中構建1、0原始數據矩陣?；谠摂祿仃嚕褂肊xcel軟件計算引物的多態性比率，并借助NTSYS-pc2.10e軟件基于Dice系數生成親本與雜交后代間遺傳相似系數矩陣。隨后，用R語言基于遺傳距離繪制聚類圖，同時，利用相似系數矩陣在Excel軟件中繪制親本與雜種間的遺傳相似系數箱線圖。

2結果與分析

2.1SRAP引物的篩選與多態性分析

利用報春石斛、檀香石斛等2個親本，對90對SRAP引物展開了初步篩選，得到在父本中能擴增出特異性條帶，而在母本中不能擴增出相應條帶的44對引物。隨機選取6個雜交后代新株系，利用初篩的44對引物進行再次篩選，篩選出7對引物（表1），即 Mel+Em6 、 Me3+Em5 、 Me5+ Em2 、 Me6+Em12 、 Me7+Em14 、 Me13+Em6 /Mel4+Em6 。7對引物共擴增出58個條帶，其中多態性條帶數達47個，平均每對引物組合能擴增出約6.7個多態性條帶，多態性位點比例為81.03% 。其中 Mel4+Em6 引物組合的多態性比例達到了 100.00% ，而 Me7+Em14 引物組合的多態性比例則相對較低，僅為 57.14% （表2）。這些引物組合不僅能擴增出清晰條帶，還具備父本特有、母本缺失的特異性條帶，可用于后續對151份雜交后代的鑒別工作。

2.2石蘭雜交后代真實性鑒定

對以報春石斛為母本、檀香石斛為父本的151個雜交后代株系開展真實性鑒定（表3、圖1）。在 Mel+Em6 、 Me7+Em14 、 Mel4+Em6 引物組合的擴增結果中，151個雜交后代株系均被鑒定為真雜種，鑒定效率達 100% 。而 Me3+Em5 、 Me5+ Em2 、 Me6+Em12 、 Mel3+Em6 引物組合分別能檢測出111、95、148、79個雜交后代株系可擴增出父本特征條帶，對應的鑒定效率分別為 73.5% ）62.9% 、 98.0% 、 52.3% 。綜合7對引物的擴增結果，共鑒定出全部151個雜交后代均為真雜種，鑒定效率達 100% 。

M 1371381391401411421431441451461471481491501516 Q

注：M，DL2000marker；，報春石斛；δ，檀香石斛；137-151，對應15個雜交后代株系Note：M，DL2000marker；，Dendrobium primulinum；δ，Dendrobium anosmum；137-151，15hybrid progenylines圖1石斛蘭雜交后代SRAP引物組合 Mel3+Em6 部分鑒定電泳圖

2.3基于SRAP分子標記的聚類分析

報春石斛、檀香石斛及其151個雜交后代株系材料的聚類情況見圖2。當遺傳距離為0.24時，153個樣本材料可分為五個類群，其中第I類涵蓋父本檀香石斛及125個雜交后代株系，雜交后代株系占比高達 82.78% ；第Ⅱ類僅包含株系27；第Ⅲ類由24個雜交后代株系組成；第V類與第V類則分別是母本報春石斛和株系 100 。

2.4基于SRAP分子標記的遺傳相似系數分析

根據7對SRAP引物在親本及雜交后代中的擴增數據，構建了遺傳相似系數矩陣，借助此矩陣，繪制了遺傳相似系數箱線圖（圖3）。母本報春石斛與父本檀香石斛間的遺傳相似系數僅0.55。父本檀香石斛與各后代株系間的遺傳相似系數介于0.51～0.84之間，均值為0.72，其中檀香石斛與株系59的遺傳相似系數最高，與株系44的則最低。母本報春石斛與各后代株系的遺傳相似系數在0.51～0.83范圍內，平均值為0.72，報春石斛與株系16的遺傳相似系數最高，與株系100的最低。151個后代株系間的遺傳相似系數介于0.56～0.99之間，平均為0.81，其中株系100與株系88的遺傳相似系數最低，而株系57與株系52的最高。雜交后代株系間的遺傳相似系數普遍高于其與雙親的遺傳相似系數，父本和母本與雜交后代株系的遺傳相似系數接近。

3討論

雜交后代鑒定是新品種選育過程中的關鍵環節之一[30]，石斛蘭種類豐富且遺傳背景復雜[31]。常規的雜交育種周期長，分子標記技術已成為石斛蘭早期鑒定的核心手段。劉玲等[32利用7對TRAP引物能夠有效地將鐵皮石斛親本及其雜交后代鑒別開來；李永清等[33]對鐵皮石斛與霍山石斛的正、反交 F₁ 代共63株，利用SSR標記鑒定雜種真實性，3對引物可鑒定出鐵皮石斛 × 霍山石斛雜交苗中25株真雜種，比例為 78.1% ，可鑒定出霍山石斛 × 鐵皮石斛雜交苗中28株真雜種，比例為 90.3% ；趙秋菊等[34]應用iPBS標記技術對石斛蘭雜交組合進行遺傳鑒定研究，準確鑒定出36個子代植株均為真雜種。杜俊峰等[35]借助20對SRAP引物，對鐵皮石斛和金釵石斛雜交產生的22個后代進行雜種鑒定，成功識別出其中21個為真實雜種。筆者所在團隊利用SRAP分子標記技術均能準確鑒定出‘四面佛’與‘水芙蓉’秋石斛雜交后代以及麝香石斛 × 檀香石斛雜交后代真實性[18-19]。本研究中篩選出的7對SRAP引物共擴增出58個條帶，其中多態性條帶數達47個，多態性位點比例為 81.03% ，多態性較高。7對SRAP引物中， Mel+Em6 、 Me7+Em14 、 Mel4+Em6 等3對引物組合均能單獨鑒定出所有151個雜交后代真實性，顯示出較高的鑒定效率，這與上述研究結果相似。

雜交后代群體的遺傳變異程度，直接關聯到優良品種以及育種中間材料篩選的難易[36]。通過確定雜種基因型偏向父本或母本來預測 F₁ 成年植株的表現性狀，可以有效提高育種效率，減少不必要的人力物力損失[37-39]。深入探究雜交后代的遺傳多樣性，有助于精準把握其遺傳變異狀況，為新品種培育與遺傳改良提供有力參考。經聚類分析，125個雜交后代株系先與父本聚合為一類，再與母本聚合，表明絕大多數雜交后代在親緣關系上先傾向于父本檀香石斛、后傾向于母本報春石斛，這與趙秋菊等[40]對廣美石斛 ?× 黃鉆戒石斛雜交后代的分析是一致的，但與林榕燕等[18]對秋石斛品種‘四面佛’ × ‘水芙蓉’雜交后代的分子結果則相反。從基于遺傳相似系數矩陣構建的箱線圖看，雜交后代株系間的遺傳相似系數平均值高于父母本與雜交后代株系間遺傳相似系數平均值，說明該組合雜交后代的遺傳基礎趨向于變窄[41]，表明雜交后代遺傳背景介于父母本之間，但分離可能不明顯。

4結論

本研究運用SRAP分子標記技術對報春石斛與檀香石斛雜交后代開展真實性鑒定，經篩選確認的7對引物組合對此項鑒定的效率達 100% 。大部分雜交后代株系與父本檀香石斛在基因水平上更接近，但該雜交組合后代的遺傳特性呈收窄態勢。

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（責任編輯：許玲）