紅花木R2R3-MYB基因LcMYB113調控花青苷合成

中圖分類號：Q943 文獻標識碼：A 文章編號：1000-3142（2025）06-1137-12

Function of R2R3-MYB gene LcMYB113 on regulating anthocyanin biosynthesis in Loropetalum chinense var. rubrum

LU Peng'，RONG Duoyan’，LIAO Xiaoshan2， XIAO Yangyao’， ZHANG Bangyue ¹ ovincialEngineering Research CenterofLilyGermplasmResourceInnovationandDeep Processing，CollegeofLifeScie Chemistry，HunanUniversityof Technology，Zhuzhou 412OO7，Hunan，China；2.Zhuzhou Institute ofAgricultural Sciences，Zhuzhou 4120o7，Hunan，China）

Abstract：AnthocyaninsareoneofthekeyfactorsaffctingtheformationofornamentalvalueofLoropetalumchinense var.rubrum.In order to investigate the molecular mechanisms of anthocyanin biosynthesis in L. chinensevar.rubrum，an anthocyanin biosynthesis-related R2R3-MYB gene，named LcMYB113 with GenBank accesion number OR344758，was cloned from L. chinense var.rubrum.The deduced amino acid sequence of LcMYB113 gene wasanalyzed by bioinformatics methods.The relative expression levels of LcMYB113 gene in leaves of L. chinense var. rubrum and L.chinense were tested byreal-time fluorescencequantitative RT-PCR method.The phenotypes of leaves andflowers of transgenic tobacco lines were recorded.Therelative expresion levelsofanthocyanin biosyntheticstructural gees in leaves of transgenictobacco lines were examined.The results were as folows：（1）Theopen reading frameof LcMYB113 gene was 789 bplong，encoding 262aminoacids.Multiple alignment analysis showed thattheN-terminal ofLcMYB13 contained a canonical R2R3 DNA binding domain and a bHLH transcript factor binding motif ?D/E?Lx₂?R/K?x₃Lx₆ （204號 Lx3R.Two anthocyanin biosynthesis activator characteristic motifs ANDV and ?K/R?P?Q/R?P?Q/R? were also found inthe aminoacid sequenceofLcMYB113.Phylogenetictreeanalysis indicated that LcMYB113 was closely related to anthocyanin specific R2R3-MYB subfamily transcription factors，including PsMYB58 of and VvMYBA1 of Vitis vinifera.（2）The anthocyanin content and relative expresion levelof LcMYB113 gene in leavesof L. chinense var. rubrum were 7.4 and 1O1 times that of L_* ：chinenserespectively，which indicated that the relative expresionlevel of LcMYB113 gene was corelated with theanthocyanin content in leaves.（3）The LcMYB113 gene overexpression vector was constructed and transformed into tobacco variety WS38.Heterologous expresion of LcMYB113 gene intobacco inducedanthocyanin accumulation in leaves and flowers of transgenic lines.Further more，compared with wide type tobacco line，transgenic lines hadremarkablyhigherrelativeexpresion levelsofanthocyanin biosynthetic structural genes，such as NtANS，NtDFR and NtCHS.In summary，this research results indicate that LcMYB113 can regulate the biosynthesisof anthocyanin，and provide theoretical support for leaf color breeding of L_* chinense var. rubrum.

Key words：Loropetalum chinensevar.rubrum，anthocyanin，LcMYBl13，gene cloning，real-time fluorescence quantitative RT-PCR

紅花木（Loropetalumchinensevar.rubrum）為金縷梅科繼木屬的多年生植物，樹姿挺拔，枝條紅褐色，花紅葉艷，觀賞性極佳，是原產于我國的特色觀花觀葉植物（董淑龍等，2022）。此外，紅花木適應性強、耐修剪、易于塑形，在長江流域及南方地區常作為主要的彩葉觀賞植物大量應用于城市道路、公園、社區等綠化中（張藝帆等，2022）。

紅花檐木作為我國特色的觀花觀葉園林綠化植物（彭閏珉和于曉英，2012；Zhangetal.，2023），其花青苷物質類型及含量的差異是造成紅花木不同品種間葉色差異的基礎，在紅花檐木的葉片中已經檢測到15種花青苷物質，包括天竺葵素、矢車菊素、錦葵素等（陳倩如等，2021）。已有研究表明，花青苷物質的生物合成依賴于多種結構酶類的活性，包括苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonialyase，PAL）、查爾酮合成酶（chalconesynthase，CHS）、查爾酮異構酶（chalcone isomerase，CHI）、黃烷酮3-羥化酶（flavanone 3-hydroxylase，F3H）、黃烷酮 3^′ -羥化酶（flavanone 3^′ -hydroxylase，F3^′H ）、二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）、花青素合成酶（anthocyanidinsynthase，ANS）等（Li et al.，2014;Chaves-Silvaetal.，2018；Khusnutdinovetal.，2021）。在植物中，R2R3-MYB類轉錄因子被認為是調控花青苷生物合成結構基因表達的關鍵轉錄因子，R2R3-MYB能夠結合花青苷生物合成結構基因的啟動子區域并激活靶基因的表達，從而促進花青苷物質的積累；此外，R2R3-MYB還能與bHLH及WD40形成轉錄復合體共同調控花青苷物質的合成（Felleretal.，2011;Li，2014；An et al.，2020；Yan et al.，2021）。Wu等（2022）研究表明，R2R3-MYBs蛋白的N端R2R3DNA結構域相對保守，而C端具有多樣性。基于擬南芥R2R3-MYB蛋白AtWER的晶體結構分析，證明R2R3結構域形成2組各3個α 螺旋的結構，該結構域特異識別DNA序列 5^′ 1AACNGC- 3^′ （Wangetal.，2020），而R3 結構中的RB基序是識別bHLH的特征序列（Zimmermannetal.，2004；WangBHetal.，2022）。在觀賞植物中，已經陸續克隆并鑒定了多個調控花青苷合成的R2R3-MYB轉錄因子，包括菊花（Chrysanthemum × morifolium）（WangYGetal.，2022）、牡丹（Paeonia）（Liu et al.，2022;Shi et al.，2022）、百合（Lilium）（Yinetal.，2021）和貼梗海棠（Chaenomeles speciosa）（Ren et al.，2023）等，這些R2R3-MYB轉錄因子在花青苷生物合成中起重要的調控作用。例如：菊花的 CmMYB9a 正調控花瓣中花青苷物質的合成，該轉錄因子能夠結合并轉錄激活花青苷生物合成結構基因CmCHS和CmDFR的啟動子活性，在菊花中瞬時過表達或煙草中穩定過表達 CmMYB9a 基因都能誘導花青苷物質的積累（WangYGetal.，2022）；卵葉牡丹（Paeonia qiui）的 PqMYB113 能夠轉錄激活靶基因PqDFR和 PqANS 的活性，從而促進葉片花青苷物質的合成，在煙草和擬南芥中異源表達PqMYB113基因也能夠促進花青苷生物合成結構基因的表達及產物的積累（Liuetal.，2022）；紫斑牡丹（Paeonia rockii）的 PrMYB5 能轉錄激活PrDFR基因的表達并正調控花瓣中花青苷物質的合成（Shietal.，2022），這與卵葉牡丹 PqMYB113 的功能類似；LvMYB5是東方百合栽培品種‘Vivian’（LiliumorientalhybridscultivarVivian）花瓣花青苷物質合成的正調控因子，抑制該基因的表達會導致百合花瓣花青苷積累減少，而煙草葉片中瞬時表達該基因會促進花青苷色素的積累（Yin et al.，2021）。此外，貼梗海棠（Chaenomeles speciosa）（Ren et al.，2023）、雞爪楓（Acer palmatum）（Sun et al.，2022）、斜紋粗肋草（Aglaonemacommutatum）（Lietal.，2022）和月季（Rosahybrida）（李茂福等，2022）等觀賞植物的R2R3-MYBs因子也被發現能夠正調控花青苷物質的合成。目前，除了在紅花繼木中克隆了多個花青苷生物合成途徑的結構基因外（張翔，2020；李彩虹，2021），對其生物合成調控的相關分子機制尚不清楚，也沒有關鍵調控轉錄因子R2R3-MYB功能的報道。

本研究基于轉錄組測序數據克隆了紅花木R2R3-MYB家族的1個LcMYB113基因，對其進行生物信息學分析，構建過表達載體及遺傳轉化煙草，對比分析轉基因和野生型煙草在表型、花青苷含量、花青昔合成結構基因的表達量之間的差異，擬探討以下問題： （1）LcMYB113 蛋白理化性質、結構、所屬家族及物種間的進化關系； （2）LcMYB113 基因在紅花繼木和白花繼木葉片中的表達情況；（3）通過LcMYB113基因在煙草中異源表達分析其是否能夠誘導花青昔生物合成。通過對LcMYB113基因的克隆及功能研究，本研究確定LcMYB113基因編碼蛋白歸屬于正調控花青昔合成的R2R3-MYB因子，該基因的表達能夠促進植物中花青昔合成結構基因的表達及花青苷物質的積累，這為進一步開展紅花木葉色育種提供理論基礎。

1材料與方法

1.1植物材料

紅花木植株為6＼～8年扦插苗，白花木植株為6＼～8年實生苗，野生型煙草（Nicotianatabacum）株系（Wisconsin-38，WS38）及轉基因煙草株系盆栽于湖南工業大學百合工程研究中心植物生長室，生長條件為 22^°C 恒溫，光照周期為 ^16h 光照 ?^8h 黑暗。新鮮的葉片用于直接提取花青苷物質，部分新鮮葉片經液氮速凍后放置于 -80°C 冰箱中，用于進一步的RNA提取、cDNA第一鏈合成及實時熒光定量RT-PCR分析。

野生型及轉基因煙草種子在培養基生長2周后，移植到營養土中再繼續生長約18周后，植株主花序正常開花，采集主花序向下的第5或第6片葉片。一部分新鮮的葉片材料用于直接提取花青苷物質，另一部分經液氮速凍后放置于 -80^°C 冰箱中，用于進一步的基因表達分析。

1.2LcMYB113克隆和遺傳轉化煙草

使用通用植物RNA快速提取試劑盒RN52（北京艾德萊生物科技有限公司）提取紅花木的總RNA。使用M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司]合成cDNA的第一鏈。利用高保真酶GXL［寶日醫生物技術（北京）有限公司］擴增紅花木LcMYB113（GenBank序列號OR344758）的開放閱讀框（Openreadingframe，ORF）序列，基因特異引物見表1，擴增體系為50μL_ν 。PCR體系配置如下： 5×GXL Buffer 10.0μL dNTP Mixture （2.5mmol?L^-1）4.0μL ，正向、反向引物各 1.0μL ，第一鏈cDNA模板 0.5μL，GXL 高保真酶 1.0μL，ddH₂O 補充至 50μL 。PCR擴增程序如下：預變性 1min ，進行35個循環； 72^°C 延伸 5min，10^qC 保存。LcMYB113ORF的PCR產物在瓊脂糖凝膠電泳及回收后，利用 ClonExpress II One Step Cloning Kit（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）無縫連接到pSuper1300過表達載體中（榮朵艷等，2019）。重組過表達載體pSuper-LcMYB113通過熱激法轉化大腸桿菌感受態 DH5α ，單菌落測序正確后，提取陽性菌的質粒，并利用液氮凍融法將質粒轉化到農桿菌感受態EHA105中。

利用農桿菌介導的葉盤法將LcMYB113基因轉化到煙草WS38中（Galloisamp;Marinho，1995）。轉基因煙草材料在含 20mg?L^-1 的潮霉素和200mg?L^-1 的特美汀抗性培養基中分化及生根，再移栽到營養土中盆栽生長。利用植物基因組DNA快速提取試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］提取轉基因煙草T0代植株葉片的基因組DNA，利用潮霉素抗性基因（Hygromycinphosphotransferase，HYG）LcMYB113基因的鑒定引物（表1，轉基因鑒定引物）進行PCR鑒定并獲得陽性苗，繼續養護至開花、收獲種子。選取3個具有代表性表型的轉基因株系TO代種子，經過含潮霉素培養基篩選后，將T1代轉基因陽性幼苗移植于營養土中繼續生長，直至主花序正常開花，用于進一步的取樣分析。代表性轉基因植株的葉片在早期生長階段局部出現斑點狀的色素積累，隨著生長時間的增加，色素斑點不斷增加并連成片，葉片大部分面積最終表現為紫紅色。利用轉基因鑒定引物對3個選定的轉基因株系中LcMYB113基因的表達進行半定量RT-PCR檢測，內參基因選擇NtActin（GenBank序列號：LOC107831145）。

引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

1.3生物信息學分析

利用DNAMAN6.0軟件對LcMYB113基因進行序列分析，利用BLASTP（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/進行同源蛋白搜索，并利用Mega5軟件及鄰接法進行系統進化樹的構建，并進行了1000次重復的bootstrap測試。運用在線網站InterPro（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/）對蛋白的保守結構域進行預測。運用在線網站ProtParam（https：//web.expasy. org/protparam/）對蛋白的理化性質進行預測。利用在線網站SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）對蛋白質的三級結構進行預測。

1.4實時熒光定量PCR檢測

檢測紅花木LcMYB113基因相對表達量的實時熒光定量RT-PCR引物見表1，內參基因選擇甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）（張力等，2013）。同時訂購煙草花青苷生物合成結構基因（包括NtANS、NtDFR、NtCHS等）及內參基因NtActin的實時熒光定量RT-PCR引物（Liuetal.，2022）。利用FastStartEssentialDNAGreenMaster（羅氏生命科學公司）實時熒光定量PCR檢測試劑盒檢測基因在組織中的相對表達情況。實時熒光定量RT-PCR反應體系為 20μL：2×GreenI Master混合液10.0μL ，正向、反向引物各 1.0μL ，稀釋后的cDNA模板 5.0μL ，去離子水補足至 20.0μL 。擴增程序如下： 95^°C 預變性 10s，72%10s ，共40個循環。每個反應設3次重復。利用Excel2010軟件和 2^-ΔΔCt 法計算基因的相對表達量，用GraphPadPrism9.5軟件進行柱形圖的繪制。進行紅花樾木葉片中基因相對表達量分析時，以白花繼木葉片中對應基因的表達量為單位1進行計算；進行轉基因煙草葉片中相關基因的相對表達量分析時，以野生型煙草葉片中對應基因的表達量為單位1進行計算。利用SPSS20軟件及T檢驗以確定基因表達量的差異性。不同的材料分別選取3個獨立植株的葉片提取RNA并進行后續實時定量分析，通過3次生物學重復確定數據的可靠性。

1.5花青苷含量測定

紅花繼木和白花木的葉片、煙草葉片的花青苷提取及含量測定用鹽酸乙醇方法（李長江，2018）進行。具體操作如下：剪取相應組織新鮮材料葉片，在分析天平上進行稱重，約 20mg ;將樣品放入石英研缽中，同時加入 4mL 的提取液（0.1mol?L^-1 的鹽酸乙醇溶液）進行充分研磨，將研磨后的溶液轉至 15mL 離心管中，將離心管在 95^°C 水浴鍋中加熱 5min ，在 28^°C 的黑暗條件下過夜孵育；室溫離心機 1000g 離心 1min ，取出上清液，用紫外分光光度計測定 oD 值（ OD₅₃₀ 與OD₆₅₀ ）；根據[ （OD₅₃₀-0.25×OD₆₅₀）×V（mL）]/m （g）公式計算樣品中的花青苷含量，單位為 μg?Ω g^-1FW 。共進行3個獨立株系的葉片花青苷物質的測定，并用于進一步數據分析，用GraphPadPrism9.5軟件進行柱形圖的繪制，利用SPSS20軟件及Duncan氏方法進行不同材料之間花青苷含量的顯著差異性分析。

表1基因克隆、表達分析引物序列

2 結果與分析

2.1LcMYB113基因克隆及生物信息學分析

基于轉錄組測序結果，設計基因擴增特異引物，以紅花木葉片的cDNA為模板PCR擴增LcMYB113基因的ORF序列（圖1）。測序結果表明， LcMYB113 的ORF為 789bp ，編碼262個氨基酸。利用Protparam在線分析LcMYB113蛋白的理化性質，預測出該蛋白分子量為 30 125.55kDa ，分子式為 C₁₃₂₆H₂₁₂₅N₃₈₉O₃₈₉S₁₂ ，亮氨酸（leucine，Leu）含量最高（占 11.1% ），組氨酸（histidine，His）含量最低（占 1.5% ），等電點為9.2，呈堿性，不穩定系數為39.3，疏水性為 -0.578 ，是負值，表明LcMYB113蛋白是堿性且不穩定的疏水蛋白。利用SWISSMODEL在線軟件，以擬南芥R2R3-MYB蛋白AtWER為模板構建了LcMYB113蛋白R2R3結構域的三級結構，LcMYB113蛋白與擬南芥AtWER蛋白的R2R3結構域氨基酸序列一致性達到 62.39% ，并且R2和R3結構域各有3個 ∝ 螺旋（圖2）。

將LcMYB113氨基酸序列在NCBI中進行BLASTP搜索，并進行同源氨基酸序列的多重比對及保守結構域分析，結果如圖3所示。LcMYB113的N端含有典型的R2R3DNA識別結構域，其中R3結構域中還包含1個與bHLH結合識別的[D/E] Lx₂[R/K]x₃Lx₆Lx₃R 基序。此外，還發現了與花青苷合成調控相關的ANDV和［K/R]P［Q/R]P[Q/R]特征基序。

A.紅花檐木總RNA（M.DL500Omarker）；B.LcMYB113基 因擴增。 A.TotalRNAofLoropetalumchinensevar.rubrum（M.DL5000 marker）；B.Amplification of LcMYB113 gene.

利用Mega5對包括LcMYB113在內的多種植福 0物MYB氨基酸序列進行系統進化樹構建，結果如圖4所示，紅花木LcMYB113與來源于木本植物的牡丹（Paeonia × suffruticosa）PsMYB114和PsMYB58聚為一類，并且與草本植物擬南芥（Arabidopsisthaliana）的AtMYB113、矮牽牛1 Petunia×hybrida× 的PhAN2等的親緣關系較近，它們同屬于調控花青昔合成的MYB轉錄因子，暗示這些MYB轉錄因子在花青昔的合成中可能具有相似的促進作用。

2.2紅花檐木和白花木葉片花青苷含量及 LcMYB113基因表達分析

紅花繼木是白花繼木的變種，其葉片中都能夠顯著積累花青苷物質（圖5：A）。通過對紅花繼木和白花繼木的葉片中花青苷物質進行提取分析，紅花木的葉片中花青苷物質含量為（ 180±6X （20 μg?g^-1FW ，顯著高于白花木葉片中的花青苷物質含量 Ω_{（24±2）μg?g^-1FW]} （圖5：B）。對紅花樾木及白花木葉片中的LcMYB113基因的相對表達量進行檢測，發現 LcMYB113 在紅花木葉片中的相對表達量是白花繼木的101倍（圖5：C）。這表明LcMYB113在紅花木與白花木葉片中的表達趨勢與其花青苷含量的趨勢相一致。

2.3基因克隆及過表達載體構建

為深入探究LcMYB113基因的功能特性，本研究從紅花繼木組織中提取總RNA（圖1：A），再利用逆轉錄酶將RNA逆轉錄為cDNA。利用LcMYB113基因ORF序列的特異性引物，通過PCR技術成功克隆得到目的長度約為 800bp 的LcMYB113基因片段（圖1：B）。利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒將PCR產物進行純化與回收，并與線性化的pSuper1300過表達載體相連接，得到的重組載體轉化大腸桿菌感受態 DH5α 及測序正確。構建的重組載體轉化至EHA105感受態菌株中，利用基因ORF擴增引物對單菌落進行PCR驗證。結果（圖6）表明，所獲得的PCR產物大小與預期長度一致，表明過表達載體的成功構建。

2.4遺傳轉化煙草和轉基因株系表型分析

為了確定LcMYB113基因能夠調控花青苷物質的合成，將LcMYB113基因構建到過表達載體上，并利用農桿菌介導的葉盤法，將LcMYB113基因轉入煙草基因組中（圖7：A-F），對獲得的轉基因株系進行PCR擴增鑒定，表明潮霉素抗性基因HYG和LcMYB113基因均整合到13個T0代轉基因株系的基因組中（圖8）。3個代表性T1代轉基因煙草株系的葉片（圖9：A）、花朵（圖9：C）等組織中均能夠觀察到花青苷物質的積累。半定量RT-PCR檢測結果也表明，LcMYB113基因的轉錄本在這3個T1代轉基因株系中正常表達（圖9：B）。3個代表性T1代轉基因株系的葉片中花青苷含量分別為（ 187±16 ）、（ 309±10 ）、（ 245±35， μg?g^-1 FW，均遠高于野生型煙草葉片花青苷的含量 （19±2） ） μg?g^-1 FW（圖9：D）。進一步對不同T1代轉基因株系葉片花青苷生物合成結構基因的表達進行分析，3個代表性轉基因株系中包括NtANS，NtDFR，NtCHS，NtF3H，NtF3^′H 等多個花青苷生物合成結構基因的表達量顯著升高（圖10）。其中，2號轉基因株系葉片中NtDFR、NtANS和NtF3^′H 的相對表達量為野生型株系的200倍以上，受到的誘導表達最為明顯。上述結果表明，LcMYB113能夠促進煙草中花青苷生物合成結構基因的表達及花青苷物質的積累。

3 討論與結論

本研究基于轉錄組測序結果，從紅花木中分離得到了1個R2R3-MYB基因LcMYB113，該基因編碼262個氨基酸，LcMYB113的N端具有保守的R2R3DNA結合域，三級結構預測表明其與擬南芥AtWER的R2R3結構域相似，均由2組各3個 ∝ 螺旋構成，已經證實AtWER的R2R3結構域能夠特異結合靶DNA序列（Wangetal.，2020），推測LcMYB113的R2R3結構域也具備識別特異靶DNA序列的能力。在LcMYB113的R3結構域中有1個識別bHLH轉錄因子的RB基序，該基序保守地存在很多R2R3-MYB家族蛋白的R3結構域中（Zimmermann et al.，2004;Wu et al.，2022），推測LcMYB113能夠利用RB基序與細胞內特定的bHLH因子結合形成調控復合物。在LcMYB113的N端R3結構域和C端調節結構域中還分別存在1個促進花青苷合成的ANDV和［K/R]P［QR]P[Q/R]基序（Yamagishietal.，2010；Liuetal.，2022），這區別于抑制花青昔合成蛋白AtMYBL2的TLLLFR基序（Matsuietal.，20O8），也不同于抑制羥基肉桂酸合成蛋白AtMYB4的EAR基序（Jinetal.，2000，Wuetal.，2022）。系統進化樹分析表明LcMYB113與其他植物調控花青苷合成調控R2R3-MYB分在同一亞組，如牡丹的PsMYB58、葡萄的VvMYBA1、矮牽牛的PhAN2等，這與促進花青苷合成的PqMYB113（Liuetal.，2022）和RhMYB113c（李茂福等，2022）的系統進化樹分析結果相似。以上生物信息學分析結果支持LcMYB113基因編碼促進花青苷合成的R2R3MYB因子。

LcMYB113基因在紅花繼木葉片中的表達顯著高于白花檐木中的表達，并且與葉片中花青苷物質的含量高度相關，這種結果與其他正調控R2R3-MYBs基因的表達相似，如菊花的 CmMYB9a （WangYGetal.，2022）、卵葉牡丹的PqMYB113（Liuetal.，2022）和月季的RhMYB113c（李茂福等，2022），推測紅花繼木葉片中積累花青苷物質是由LcMYB113基因的高表達量引起的。在煙草中異源表達LcMYB113基因能夠顯著促進轉基因植株葉片、花瓣及萼片等組織中花青苷的積累，同時也檢測到花青苷合成結構基因表達量的提高，這與牡丹PsMYB58（Zhangetal.，2021）和卵葉牡丹 PqMYB113 （Liu etal.，2022）轉基因煙草植株結果相似。菊花 CmMYB9a （Wang YG etal.，2022）和紫斑牡丹PrMYB5（Shietal.，2022）在煙草異源表達僅影響花瓣色素的積累，而紅掌（Anthuriumandraeanum）AaMYB6（李崇暉等，2021）在煙草中100—草莓Fragaria × ananassaFaMYB9 99 月季花RosachinensisRcMYB123 100 43 桃Prmis prscaPpPMYB6123 100．葡萄V.viniferaVvMYBPA1 葡萄VviniferaVvMYB308 100 楓香樹LiquidambarformosanaLfMYB123 53 楊梅MorellarubraMrMYB5 78—淡紅薺Capsella rubella CrMYB111 100 花椰菜 Brassica oleracea var.botrytis BoMYB12 擬南芥Arabidopsisthaliana AtMYB111 100 桃Prumuspersica PpMYB29 蘋果Malus domestica MdMYB22 100 99-白梨Pyrus bretschneideriPbMYB11 100牡丹Paeonia × suffruticosa PsMYB114 97 牡丹Paeonia × suffruticosa PsMYB58 紅花橙木Loropetalumchinense var.rubrumLcMYB113 葡萄VitisviniferaVvMYBA1 100 4 100 茶asl 59 葡萄Vitis vinifera VvMYB113 32 擬南芥Arabidopsis thaliana AtMYB113 矮牽牛Petunia × hybridaPhAN4 52 矮牽牛Petunia × hybrida PhAN2 0.1 88 100 矮牽牛 Petunia guarapuavensis PgAN2 45- 紫花矮牽牛P.integrifoliaPiAN2

A.白花機木與紅花繼木葉片；B.葉片花青苷含量；C.葉片中LcMYB113相對表達量。 ^** 表示差異顯著（ Plt;0.01? ，下同。 A.Leaves of Loropetalum chinense and L. chinense var.rubrum；B.Anthocyanin contents in leaves；C.Relative expression levels of LcMYB11 inleaves.** shows significant differences（ Plt;0.01 ），the same below.

Fig.5Phenotype and LcMYB113 relative expresion level in leaves of Loropetalum chinense and L.chinense var.rubrum

1-8.8個農桿菌菌落；M.DL5000marker；P.陽性對照；E.空白對照。

1-8.Eight Agrobacterium tumefaciens colonies；M. DL5oOO marker；P.Positive control;E.Empty control.

A.預培養；B.農桿菌侵染；C.共培養；D.誘導生芽；E.誘導生根；F.轉基因植株。 A.Pre-cultiatio；B.AgobctetumefacectioC.Cova;Doiuctio；E.Rootiductio;F.scla

1-13.不同的TO代轉基因株系；M.DL500O marker；WT.野生型；E.空白對照；P.陽性對照。

1-13.Individual TO transgenic lines；M.DL5OOO marker；WT.Wild type;E.Emptycontrol;P.Positive control.

A.野生型及T1代轉基因植株葉片（#1、#2、#3均表示代表性T1代轉基因株系，下同）；B.不同株系花朵；C.不同株系葉片中LcMYB113基因表達；D.不同株系葉片花青苷含量。不同小寫字母表示差異顯著（ Plt;0.01 。

A.Leavesfildtandraencants（##2#3alleprsteprstatieTragesebelo）；osfdifentlins；expssiafitls；DAnoaosisofintllettersindicate significantdifferences（ Plt;0.01 ）

異源表達只促進花絲中色素的積累，這與LcMYB113轉基因煙草的表型相差較大，說明不同的R2R3-MYBs基因在促進花青昔合成的能力上具有一定的差異性。以上結果表明，紅花檐木LcMYB113基因具有較強的促進花青昔合成的能力。

綜上所述，本研究克隆了紅花繼木1個R2R3MYB基因LcMYB113，其編碼氨基酸具有典型的R2R3DNA結合域bHLH識別序列及花青苷調控特征基序，歸類于正調控花青苷合成的AN2亞組。LcMYB113基因的表達與紅花木葉子中的花青苷物質積累正相關，在煙草中異源表達LcMYB113基因促進轉基因植株中花青苷含量積累及花青苷合成結構基因的表達。因此，LcMYB113是紅花木中促進花青昔合成調控的轉錄因子。

致謝感謝中國農業大學朱元娣教授惠贈野生型煙草種子。

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（責任編輯 鄧斯麗）