兒童結核病診斷中分子檢測技術的應用與研究進展

[摘要] 結核病（tuberculosis，TB）是全球范圍內的重大公共衛生問題，兒童TB的診斷面臨諸多挑戰。分子檢測技術憑借快速、高敏感度和特異性等優勢，顯著提升TB的診斷效率。本文綜述核酸擴增技術、線性探針技術、質譜技術及高通量測序技術等在兒童TB診斷中的應用現狀和研究進展，分析其原理、優勢及局限性，旨在為兒童TB的診斷提供新的思路和方法，提高兒童TB的診斷率，為兒童TB的早期發現、及時治療和預防控制提供參考。

[關鍵詞] 結核病；兒童；分子檢測技術；診斷

[中圖分類號] R529.2；R446.5" """"[文獻標識碼] A """""[DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2025.24.028

結核病（tuberculosis，TB）是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的慢性傳染病，嚴重威脅人類健康；兒童TB負擔面臨嚴重挑戰。世界衛生組織（World Health Organization，WHO）2024年報告顯示，2023年全球約1080萬例TB患者，兒童和青少年（15歲以下）占比12%^[1]。在中國，0～14歲兒童TB報告病例數僅占估算發病數的1%，診斷覆蓋率極低，表明存在巨大的診斷缺口。

兒童TB的診斷相較于成人更困難，主要原因在于兒童癥狀不典型、痰液標本難以獲取及傳統的診斷方法敏感度較低等。傳統的痰涂片鏡檢和MTB培養雖然仍是TB診斷的金標準，但其在兒童TB診斷中的應用受到諸多限制。因此，開發快速、準確且不依賴于呼吸道標本的新型檢測技術對提高兒童TB診斷水平至關重要^[2]。

近年來，分子診斷技術在TB診斷領域取得顯著進展。該技術可直接檢測標本中的病原體核酸，具有較高的敏感度和特異性，可顯著提高TB的診斷效率，但其在兒童TB中的應用仍需深入探索。本文綜述分子檢測技術的最新進展，以期為優化兒童TB診斷策略提供參考。

1 "核酸擴增檢測技術

1.1 "基于常規聚合酶鏈反應技術的應用

1.1.1 "MTB及利福平耐藥檢測/超敏結核分枝桿菌及利福平耐藥基因檢測" MTB及利福平耐藥檢測（Xpert MTB/RIF）基于實時熒光聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術，可同步檢測位于rpoB基因81-bp區域的利福平耐藥突變，在短時間內可提供準確可靠的結果。2013年WHO推薦將其用于兒童TB及利福平耐藥性的初步診斷檢測^[3]。為進一步提高Xpert檢測技術的敏感度，2017年WHO推薦新一代檢測方法：超敏結核分枝桿菌及利福平耐藥基因檢測（GeneXpert MTB/RIF Ultra，Xpert Ultra）^[4]。Xpert Ultra通過新增IS6110和IS1081多拷貝擴增序列，提高MTB的檢出率，具有更高的敏感度，準確性相當，對少菌標本的檢測效能有很大提升^[5]。

研究表明Xpert及Xpert Ultra在兒童TB診斷中的應用具有一定價值，但其敏感度受多種因素的影響^[6]。Orikiriza等^[7]研究顯示Xpert檢測糞便診斷兒童TB的敏感度為50.0%，在人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）陽性兒童中有所下降（25.0%）。一項Meta分析結果顯示Xpert檢測胃液診斷TB的匯總敏感度最高（73.0%），其次為痰標本（64.6%）、糞便樣本（61.5%）及鼻咽抽吸物（45.7%），匯總特異性≥98.1%；Xpert Ultra檢測痰標本的匯總敏感度（72.8%）高于Xpert檢測，但特異性下降（97.5%）^[5]。Sun等^[8]收集兒童糞便和胃液樣本進行Xpert MTB/RIF Ultra檢測，發現Ultra糞便（60.3%）與Ultra胃液（52.5%）具有相似的敏感度，且Ultra糞便（60.3%）敏感度顯著高于Xpert糞便（32.6%）。祁雪等^[9]以支氣管肺泡灌洗液為檢測標本，結果顯示Xpert在病原學診斷和臨床診斷肺結核的敏感度分別為79%、51%。方敏等^[10]研究顯示Xpert Ultra檢測胃液標本診斷兒童TB的敏感度、特異性分別為53.5%、98.3%。此外，WHO推薦研究易獲得的非痰樣本對TB進行基于生物標志物的快速檢測。一項系統分析以口腔拭子作為診斷肺結核的樣本類型進行核酸擴增試驗，結果顯示成人口腔拭子的敏感度為36%～91%，兒童為5%～42%，特異性為66%～100%；使用Xpert Ultra檢測時，舌拭子的敏感度和特異性較高^[11]。Khambati等^[12]證實Xpert MTB/RIF檢測唾液樣本的敏感度可達80%以上；唾液中的炎癥標志物和細胞因子也被視為潛在生物標志物，可用于兒童TB的診斷。

目前基于實時熒光定量PCR的高度集成化、自動化的分子現場快速檢驗（point-of-care testing，POCT）技術在臨床中發揮日益重要的作用。Xpert技術尤其是Xpert Ultra是目前臨床實踐中應用最廣泛的分子POCT技術，其對兒童多種樣本（胃液、糞便、灌洗液）均展現出優于傳統痰涂片和培養的敏感度，尤其對少菌樣本的診斷價值更顯著。然而，其敏感度受樣本類型、載菌量、HIV共感染等因素影響，設備和試劑成本較高限制其在基層的普及。近年來，國產TB分子POCT技術發展迅速，國產替代產品的出現是積極的發展方向。

1.1.2 "實時熒光定量PCR" 實時熒光定量PCR（real-time fluorescen quantitative PCR，qPCR）通過熒光信號定量分析MTB DNA，敏感度高且適用于低載菌量樣本。Kay等^[13]研究發現糞便qPCR的敏感度高于Xpert Ultra（80.4% vs. 73.5%），與痰液Xpert Ultra相當（94.8%）。王蓮芝等^[14]對比qPCR、實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術和耐藥基因芯片3種分子診斷技術，發現qPCR對兒童痰液和胃液檢測的敏感度最高（81.51%），3種方法胃液敏感度均高于痰液。基于上述研究結果，新型糞便qPCR檢測具有簡便、非侵入性等優勢，尤其適用于痰液樣本難以獲取的患者，如兒童和HIV感染者。

qPCR作為成熟的實驗室技術，具有高敏感度、可定量、多重檢測能力等優勢，是TB分子診斷的基石之一，其在兒童非傳統樣本中的應用研究展示出良好潛力。與POCT設備比較，qPCR敏感度可能更高，在大型實驗室通量更高、單位檢測成本可能更低，但需專業的實驗室環境和操作人員，時效性通常不如POCT。

1.1.3 "液滴數字" 液滴數字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）將微流控技術與PCR相結合，允許對DNA的單個拷貝數進行精確定量，敏感度和特異性較高。Antonello等^[15]對運用于TB組織標本的ddPCR進行效能檢測，結果顯示針對多拷貝基因IS6110的ddPCR檢測敏感度達98.5%，性能優于Xpert（敏感度79.4%）和抗酸桿菌涂片鏡檢（敏感度33.8%）；同時指出內參基因的引入有助于提高DNA提取和擴增效率。此種精確的靶向DNA定量方法可作為檢測極低感染負荷分子（如早期感染和潛伏感染）的理想替代方法，有望推動TB轉錄組學領域研究^[16]。ddPCR憑借其精準定量能力和對抑制物的高耐受性，對兒童TB、潛伏結核感染等的極低載菌量標本展現出獨特優勢，敏感度可能超越Xpert Ultra。但其設備成本高昂、操作相對復雜、通量較低，目前主要用于研究領域，且在兒童樣本中的診斷價值仍需更多研究證實。

1.1.4" PCR熔解曲線分析" 通過PCR技術擴增目標DNA序列，在擴增完成后增加熔解曲線分析（melting curve analysis，MCA）過程，同時實時監測熒光信號變化，通過繪制熔解曲線檢測DNA的熔解溫度（Tm值）。該法用于檢測MTB及4種一線抗結核藥物和二線氟喹諾酮類藥物的耐藥突變檢測。對疑似耐藥TB患兒，可使用該技術進行初步診斷。MCA是qPCR技術的有力補充，但其對引物/探針設計、反應條件優化要求高，多重檢測能力有限，在兒童耐藥TB診斷中的應用潛力尚待挖掘。

1.2" 等溫擴增技術

1.2.1 "交叉引物等溫擴增" 交叉引物等溫擴增（cross-priming amplification，CPA）是一種新型的核酸等溫擴增方法，在63℃恒溫條件下，一個DNA靶序列可使多個交聯引物呈指數級擴增，具有高特異性和高敏感度。基于CPA技術的一種新型試劑盒——EasyNAT試劑盒，設計2個針對插入序列IS6110的交叉引物，可特異性檢測MTB復合群，結果在2h內報告，可為TB提供早期診斷。Quan等^[17]通過EasyNAT試劑盒檢測胃液標本評估其在兒童TB中的診斷價值，并與Xpert和Xpert Ultra進行比較，結果顯示EasyNAT和Xpert對細菌學證實的TB的敏感度均為61.5%，Xpert Ultra更優于EasyNAT（敏感度為82.1% vs. 61.5%）。Li等^[18]同樣評估CPA檢測診斷兒童TB的準確性，結果顯示CPA法和Xpert的敏感度分別為96%和98%，特異性均為100%，且CPA測試對各種樣品類型的敏感度和特異性均較高。CPA技術的研究數據顯示其在兒童TB診斷中可達到與Xpert相當的敏感度和特異性，且具有成本較低的優勢，但其性能在不同研究中存在差異。其在更廣泛的兒童樣本（如糞便、口腔拭子）中的應用效果及在高負擔地區大規模應用的表現需進一步評估。

1.2.2 "環介導等溫擴增檢測" TB-環介導等溫擴增檢測（loop mediated isothermal amplification，LAMP）是一種不依賴溫度的DNA擴增檢測方法，用于檢測MTB復合群，結果可在2h內獲得，且操作簡便。2016年WHO建議^[19]TB-LAMP可作為痰涂片鏡檢的替代檢測，敏感度76%～80%，特異性近100%，在成人中運用較廣，而在兒童中的運用數據有限。Promsena等^[20]研究表明TB-LAMP診斷兒童TB的總敏感度為76.5%；在涂片陽性標本中敏感度達100%，涂片陰性標本中為50%；Yadav等^[21]評價TB-LAMP檢測兒童MTB的性能，發現其敏感度與Xpert MTB/RIF相當，均為84%。Fan等^[22]研究發現TB-LAMP聯合培養可將兒童肺泡灌洗液檢測敏感度提升至82.5%。此外，Dayal等^[23]選取兒童誘導痰及胃液標本，采用2種引物（IS6110和mpb64）對MTB進行TB-LAMP檢測，結果顯示LAMP mpb64和LAMP IS6110的敏感度分別為94.9%和89.8%，MTB檢出率均明顯高于痰涂片鏡檢和培養。LAMP技術的優勢在于設備簡單便攜、操作簡便、成本低廉，特別適合基層實驗室作為涂片陽性的確認試驗或涂片陰性但高度疑似患者的輔助診斷工具。

2 "線性探針檢測

線性探針檢測（line probe assay，LPA）于2008年獲得WHO批準，用于快速檢測異煙肼和利福平的耐藥性，通過檢測inhA啟動子和異煙肼的katG區域及利福平的rpoB基因突變鑒定耐藥性^[24]。2016年WHO批準第2代LPA技術，由德國Hain公司推出，用于檢測二線藥物、氟喹諾酮類和氨基糖苷類藥物的耐受性，并建議對確診耐藥或耐多藥TB患者使用該檢測方法^[19]。Bangarwa等^[25]對84份兒童痰涂片陰性樣本進行LPA（MTBDR+2.0版本）檢測，敏感度和特異性分別為63%和100%（與培養相比）。LPA的核心價值在于快速、低成本檢測多種一線和二線抗結核藥物的耐藥相關突變，是耐藥TB診斷的重要工具。但其應用前提是樣本中需有足夠的MTB DNA，通常依賴于培養陽性樣本或核酸提取物。該技術仍需專業實驗室人員進行精準操作，且通量有限，在兒童耐藥TB診斷中，更常用于對培養陽性分離株或分子檢測陽性樣本的進一步耐藥譜分析。

3" 質譜法

質譜法（mass spectrometry，MS）在MTB檢測中展現出獨特潛力，尤其在快速鑒定、耐藥性分析和生物標志物檢測方面。Li等^[26]開發一種基于血液的免疫親和液相色譜-串聯質譜測定方法，可定量檢測MTB毒力因子10-kDa培養濾液蛋白（CFP10）和HIV-1衣殼蛋白p24中的單肽段。該研究在小規模成人和兒童隊列中顯示出良好診斷效能，對HIV的敏感度為85.7%（成人）和88.9%（兒童），對TB的敏感度為100.0%和88.9%。該方法有助于整合HIV和TB的診斷與管理，但仍需大規模隊列研究進行更準確評估。K?hler等^[27]開發一種基于高效液相色譜-質譜聯用的單次運行多重檢測方法，用于耐藥TB患者治療藥物監測，覆蓋14種一線和二線抗生素，敏感度高（監測藥物濃度＞5個半衰期），且準確性和精密度滿足臨床決策標準。該研究展示MS相關技術在耐藥TB患者治療藥物監測中的應用潛力。Magdalena等^[28]采用靶向串聯液相色譜-質譜法對236名波蘭兒童的血清及MTB抗原刺激的全血培養進行靶向代謝組學分析，結果表明血清中的亮氨酸和刺激血液培養中的犬尿氨酸對識別MTB感染最具鑒別潛力。靶向代謝組學有助于發現結核感染兒童的代謝變化，為兒童TB輔助診斷提供新思路。近年來，基于尿液脂阿拉伯甘露聚糖（lipoarabinomannan，LAM）的TB診斷取得顯著進展。有研究通過氣相色譜/質譜法（gas chromatography/mass spectrometry，GC/MS）證實兒童LAM水平低于成人，提示潛在漏診風險^[29]。研究通過GC/MS或捕獲酶聯免疫吸附試驗（BJ76/A194）尿液LAM檢測表現出高性能，但在資源匱乏地區適用性受限^[30]。目前MS技術對兒童TB診斷的應用主要處于研究階段，展現出多樣化潛力。

4 "高通量測序技術

4.1 "二代測序

二代測序（next-generation sequencing，NGS）逐漸成為一種檢測常見、罕見及新興微生物的前沿診斷工具，在感染診斷、病原體檢測和臨床治療指導等方面具有優勢。2020年WHO推薦NGS為監測耐藥TB的一種有價值的工具^[31]；其對一線和二線抗結核藥物的檢測結果更準確、更快速，并為分子流行病學研究提供寶貴價值。近年來，靶向NGS（targeted NGS，tNGS）被用于預測糞便樣本的藥物敏感度。Sibandze等^[32]利用FastDNA試劑盒成功從糞便中提取MTB特異性DNA，用于測序及收集耐藥信息。Ness等^[33]通過比較4種市售DNA試劑盒，發現FastDNA試劑盒在MTB DNA提取中表現最佳，可用于基于NGS的MTB耐藥性預測，為兒童及HIV感染者提供無創檢測方案。

4.2 "全基因組測序

隨著新一代測序技術的發展，全基因組測序（whole-genome sequencing，WGS）在TB診斷中的應用越來越廣泛。研究表明WGS的潛在用途是快速準確地識別各種遺傳多態性。Zhang等^[34]采用WGS檢測兒童MTB對8種抗結核藥物（異煙肼、利福平、乙胺丁醇、利福噴丁、丙硫異煙胺、左氧氟沙星、莫西沙星和阿米卡星）的耐藥性，結果顯示WGS預測MTB對8種藥物耐藥的敏感度為57.1%～100.0%，特異性為98.4%～100.0%。該研究提示WGS可準確預測抗結核藥物的藥敏試驗結果，為兒童TB的診斷和精準治療提供依據。目前，高通量測序技術尚未在兒童TB診斷中普及，仍需大樣本、多中心的針對兒童不同樣本類型的應用評估數據進一步研究。

5 "小結與展望

在眾多分子技術中，qPCR的實驗室檢測和高度集成化的分子POCT技術（如Xpert系列）已成為當前臨床兒童TB診斷的主力軍。qPCR提供穩定、可定量的結果，適用于實驗室環境；分子POCT則以其快速、簡便的特點，極大提高診斷的可及性和時效性，尤其適用于基層醫療機構和急診。等溫擴增技術在高負擔國家的基層現場檢測中展現出替代潛力，但其性能和標準化仍需提升。LPA是耐藥譜分析的經濟有效工具。MS和NGS技術雖然強大，但受限于高昂成本和復雜性，目前主要應用于研究和實驗室層面，為精準診斷和耐藥檢測提供幫助。目前多種分子檢測技術尚缺乏兒童大樣本的研究數據，需進一步在該群體中開展和普及。此外，發展高性能且低成本、低要求的檢測技術對經濟及操作條件受限的高負擔國家和地區尤為重要。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2025–05–14）

（修回日期：2025–08–02）