缺氧膽管癌細(xì)胞外泌體對(duì)增殖、遷移、侵襲及JAK2/STAT3通路的影響

[摘要] 目的 探究缺氧條件下膽管癌（cholangiocarcinoma，CCA）細(xì)胞分泌的外泌體（exosome，Exo）對(duì)CCA細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路的影響。方法 提取CCA細(xì)胞分泌的Exo并鑒定。將常氧、缺氧條件下的Exo與CCA細(xì)胞共培養(yǎng)，分為常氧組、缺氧組、缺氧+抑制劑組，另設(shè)空白組，檢測(cè)CCA細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力和相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果 在CCA細(xì)胞質(zhì)中檢測(cè)到Exo攜帶熒光染料3，3'-雙十八烷基氧雜碳菁高氯酸鹽。與空白組比較，常氧組的克隆形成數(shù)、細(xì)胞遷移數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)量上升，增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallopeptidase，MMP）-2、MMP-9、神經(jīng)鈣黏蛋白（neural cadherin，N-Cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、兔抗磷酸化JAK2（phosphorylated JAK2，p-JAK2）/JAK2、兔抗磷酸化STAT3（phosphorylated STAT3，p-STAT3）/STAT3表達(dá)升高，上皮細(xì)胞鈣黏蛋白（epithelial cadherin，E-Cadherin）表達(dá)降低（Plt;0.05）；與常氧組比較，缺氧組的克隆形成數(shù)、細(xì)胞遷移數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)量上升，PCNA、MMP-2、MMP-9、N-Cadherin、Vimentin、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達(dá)升高，E-Cadherin表達(dá)降低（Plt;0.05）；與缺氧組比較，缺氧+抑制劑組的克隆形成數(shù)、細(xì)胞遷移數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)量下降，PCNA、MMP-2、MMP-9、N-Cadherin、Vimentin、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達(dá)降低，E-Cadherin表達(dá)升高（Plt;0.05）。結(jié)論 缺氧條件下CCA細(xì)胞分泌的Exo通過(guò)激活JAK2/STAT3通路促進(jìn)CCA細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

[關(guān)鍵詞] 缺氧；膽管癌；外泌體；增殖；遷移；侵襲；Janus激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3通路

[中圖分類號(hào)] R735.8" """"[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A """""[DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2025.24.007

The effects of hypoxic cholangiocarcinoma cell-derived exosome on the proliferation， migration， invasion， and JAK2/STAT3 signaling pathway

ZHANG Jianhua， SU Zijian， LIAN Jinhong

Department of Hepatobiliary Surgery， Quanzhou First Hospital， Quanzhou 362000， Fujian， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of exosome （Exo） secreted by cholangiocarcinoma （CCA） cells under hypoxic conditions on the proliferation， migration， invasion， and Janus kinase 2 （JAK2）/signal transducer and activator of transcription 3 （STAT3） pathway of CCA cells. Methods Exo secreted by CCA cells was extracted and identified. Exo under normoxic and hypoxic conditions were co-cultured with CCA cells and divided into normal oxygen group， hypoxic group， hypoxic+inhibitor group， and blank group. The proliferation， migration， and invasion abilities of CCA cells were tested separately. Immunoblotting was applied to detect the expression levels of relevant proteins. Results Exo carrying fluorescent dye 3， 3'- dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate was detected in CCA cytoplasm. Compared with blank group， the number of clone formation， cell migration and invasion cells in normoxic group increased， the expression of proliferating cell nuclear antigen （PCNA）， matrix metallopeptidase （MMP）-2， MMP-9， neural cadherin （N-Cadherin）， Vimentin， phosphorylated JAK2 （p-JAK2）/JAK2， phosphorylated STAT3 （p-STAT3）/STAT3 increased， and the expression of epithelial cadherin （E-Cadherin） decreased （Plt;0.05）; Compared with normal oxygen group， the number of clone formation， cell migration and invasion cells in hypoxia group increased， the expression of PCNA， MMP-2， MMP-9， N-Cadherin， Vimentin， p-JAK2/JAK2 and p-STAT3/STAT3 increased， and the expression of E-Cadherin decreased （Plt;0.05）. Compared with hypoxia group， the number of clone formation， cell migration and invasion cells in hypoxia+inhibitor group decreased， the expression of PCNA， MMP-2， MMP-9， N-Cadherin， Vimentin， p-JAK2/JAK2 and p-STAT3/STAT3 decreased， and the expression of E-Cadherin increased （Plt;0.05）. Conclusion Exo secreted by CCA cells under hypoxic conditions promote proliferation， migration， invasion， and epithelial mesenchymal transition of CCA cell by activating the JAK2/STAT3 pathway.

[Key words] Hypoxia; Cholangiocarcinoma; Exosome; Proliferation; Migration; Invasion; Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3 pathway

膽管癌（cholangiocarcinoma，CCA）是一種起源于膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，具有高侵襲性和隱匿性，多數(shù)患者發(fā)展至晚期才被確診，預(yù)后較差^[1]。因此深入探索CCA發(fā)生進(jìn)展的分子機(jī)制對(duì)患者的治療十分重要^[2]。缺氧是實(shí)體瘤特征之一，可能通過(guò)外泌體（exosome，Exo）加速腫瘤發(fā)生^[3]。Exo是具有磷脂雙層結(jié)構(gòu)的納米級(jí)囊泡，參與各種生理和病理過(guò)程^[4]。但缺氧條件下CCA細(xì)胞分泌的Exo對(duì)CCA細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響尚未可知。Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路為炎癥相關(guān)疾病的治療靶點(diǎn)，主要通過(guò)受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）、JAK2和STAT3介導(dǎo)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。激活的JAK2刺激RTK產(chǎn)生STAT3的結(jié)合位點(diǎn)。STAT3通過(guò)其SH2結(jié)構(gòu)域與RTK結(jié)合，并在JAK2作用下磷酸化進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)揮重要作用^[5]。據(jù)報(bào)道，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）類賴氨酰氧化酶1反義RNA1（lysyl oxidase-like 1 antisense RNA1，LOXL1-AS1）通過(guò)調(diào)節(jié)JAK2/STAT3信號(hào)通路影響CCA進(jìn)展^[6]。本課題組基于前期研究進(jìn)展，在缺氧條件下通過(guò)分離鑒定CCA細(xì)胞分泌的Exo，探究Exo對(duì)CCA細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及JAK2/STAT3通路的影響。

1" 材料與方法

1.1" 材料

人CCA細(xì)胞RBE（ZQ0247）購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司；兔抗CD9（BK-KT11838）、TSG101（BK-KT8280）、Syntenin（BK-KT12884）、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）（BK-KT10757）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallopeptidase，MMP）-2（BK-KT6764）、MMP-9（BK-KT7901）、神經(jīng)鈣黏蛋白（neural cadherin，N-Cadherin）（BK-KT9801）、波形蛋白（Vimentin）（BK-KT12012）、上皮細(xì)胞鈣黏蛋白（epithelial cadherin，E-Cadherin）（BK-KT7131）、JAK2（BK-KT10379）、STAT3（BK-KT10994）抗體購(gòu)自上海帛科生物技術(shù)有限公司。兔抗磷酸化JAK2（phosphorylated JAK2，p-JAK2）（PHA97301）抗體購(gòu)自普健生物（武漢）科技有限公司；兔抗磷酸化STAT3（phosphorylated STAT3，p-STAT3）（IC184614）抗體購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司；兔抗CD81（BGT-ANT-35744）購(gòu)自武漢佰瑞得生物技術(shù)有限公司。兔抗Galnexin（GTX127352）抗體購(gòu)自深圳欣博盛生物科技有限公司。JAK2抑制劑AG490購(gòu)自（abx282079）艾美捷科技有限公司。Exo綠色熒光染色試劑盒3，3′-雙十八烷基氧雜碳菁高氯酸鹽（3，3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate，DIO）（MH1061-1盒）購(gòu)自江蘇麥格生物科技有限公司。本研究經(jīng)泉州市第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)（倫理審批號(hào)：泉一倫[2021]275號(hào)）。

1.2" 方法

1.2.1nbsp; 缺氧處理 "人膽管癌RBE細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，常氧條件：37℃、5% CO₂、20% O₂；缺氧條件：37℃、1% O₂，培養(yǎng)48h^[7]。

1.2.2" Exo的分離、鑒定 "將CCA細(xì)胞培養(yǎng)液以3400轉(zhuǎn)/min、4℃離心15min，分離上清液，以7200轉(zhuǎn)/min、4℃離心30min，去除細(xì)胞碎片，然后以30 000轉(zhuǎn)/min、4℃超速離心90min。取上清液，濾膜過(guò)濾，收集過(guò)濾液，以7200轉(zhuǎn)/min、4℃離心70min，去上清液，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）重懸后，選擇超速轉(zhuǎn)子，再次以4℃、30 000轉(zhuǎn)/min，超速離心70min，去上清液，用預(yù)冷的PBS重懸，Exo于–80℃保存。

1.2.3 "透射電鏡觀察Exo "取Exo滴加在銅網(wǎng)上沉淀1min，濾紙吸去浮液，醋酸雙氧鈾10μl滴加于銅網(wǎng)上沉淀1min，濾紙吸去浮液，常溫干燥，電鏡觀察。

1.2.4 "分析Exo粒徑 "取Exo進(jìn)行稀釋，粒徑分析檢測(cè)Exo粒徑分布。

1.2.5 "檢測(cè)Exo標(biāo)志蛋白表達(dá) "將Exo加入裂解液，混勻，用聚氰基丙烯酸正丁酯試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。配置十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，取蛋白樣品，加熱變性，上樣，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，于5%脫脂牛奶含有Tris-HCl緩沖鹽和Tween的溶液（solution containing Tris-HCl buffer salt and Tween，TBST）中，封閉1h，加一抗稀釋液（1 ： 1000）4℃過(guò)夜孵育，TBST洗膜，加二抗稀釋液（1 ： 5000）室溫孵育1h，TBST洗膜，與增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光避光反應(yīng)5min，曝光，分析各蛋白條帶表達(dá)量。

1.2.6" Exo攝取實(shí)驗(yàn)" Exo樣本與DIO染料混合，室溫孵育30min，分離柱吸取上層保護(hù)液，PBS清洗，將樣本加分離柱上層，離心，避光加PBS，離心，取24孔板，用多聚賴氨酸包被細(xì)胞爬片，加CCA細(xì)胞和熒光標(biāo)記的Exo樣本，加等量的PBS作為空白組，室溫孵育過(guò)夜，用鼠抗人α-Tubulin抗體（1 ： 200）染色細(xì)胞骨架，過(guò)夜孵育，清洗，用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚染色，封片，在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7" 實(shí)驗(yàn)分組 "將RBE細(xì)胞制備為單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至96孔板，每孔加3000個(gè)細(xì)胞，分別加入PBS、常氧、缺氧條件下提取的Exo，分為空白組、常氧組、缺氧組和缺氧+抑制劑組，每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)，缺氧+抑制劑組使用50μmol/L JAK2抑制劑AG490和缺氧Exo處理RBE細(xì)胞24h^[8]。

1.2.8" 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CCA細(xì)胞增殖活性 "將各組RBE細(xì)胞接種至6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)14d，多聚甲醛固定15min，結(jié)晶紫染色30min。鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞克隆形成數(shù)。

1.2.9 "檢測(cè)CCA細(xì)胞遷移能力" 將各組RBE細(xì)胞接種在加入不含基質(zhì)膠的小室上室，下室加血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)12h，甲醛固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察，計(jì)數(shù)細(xì)胞遷移數(shù)目。

1.2.10" Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CCA細(xì)胞侵襲能力 "將RBE細(xì)胞接種于Transwell小室上室，下室鋪滿FBS培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，室溫下用多聚甲醛固定15min，隨后結(jié)晶紫染色30min。顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)侵襲數(shù)目。

1.2.11 "檢測(cè)蛋白表達(dá) "參考1.2.5中實(shí)驗(yàn)步驟，檢測(cè)各組PCNA、MMP-2、MMP-9、N-Cadherin、Vimentin、E-Cadherin、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表達(dá)。

1.3" 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（" ）表示，多組間比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2" 結(jié)果

2.1" RBE細(xì)胞分泌的Exo鑒定

CCA細(xì)胞RBE經(jīng)無(wú)Exo培養(yǎng)基分別在常氧和缺氧條件下培養(yǎng)48h，分離、提取其中的Exo。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)Exo為雙層膜結(jié)構(gòu)，呈“茶托”樣，粒徑約90nm，與Exo結(jié)構(gòu)一致。常氧和缺氧條件下，RBE細(xì)胞Exo中均含有Exo標(biāo)記蛋白CD81、CD9、TSG101，但不表達(dá)Galnexin，證明本研究已有效分離Exo，結(jié)果見(jiàn)表1、圖1至圖3。

2.2" 熒光顯微鏡觀察RBE細(xì)胞能否攝取Exo

Exo用DIO標(biāo)記并與RBE細(xì)胞共培養(yǎng)后，在RBE細(xì)胞質(zhì)中檢測(cè)到Exo攜帶熒光染料DIO，說(shuō)明RBE細(xì)胞對(duì)Exo進(jìn)行攝取，并儲(chǔ)存于細(xì)胞質(zhì)中，見(jiàn)圖4。

A.PBS為空白對(duì)照；B.紅色熒光染色為細(xì)胞骨架；C.A與B合并圖像；D.DIO綠色熒光染色為Exo；E.紅色熒光染色為細(xì)胞骨架；F.D與E合并圖像

2.3" 缺氧Exo對(duì)RBE細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響

與空白組比較，常氧組的克隆形成數(shù)、細(xì)胞遷移數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)量均上升（Plt;0.05）；與常氧組比較，缺氧組的克隆形成數(shù)、細(xì)胞遷移數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)量升高（Plt;0.05）；與缺氧組比較，缺氧+抑制劑組的克隆形成數(shù)、細(xì)胞遷移數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)量減少（Plt;0.05），見(jiàn)表2、圖5至圖7。

2.4" 缺氧Exo對(duì)RBE細(xì)胞增殖、遷移、侵襲蛋白的影響

與空白組比較，常氧組的PCNA、MMP-2、MMP-9表達(dá)升高（Plt;0.05）；與常氧組比較，缺氧組的PCNA、MMP-2、MMP-9表達(dá)升高（Plt;0.05）；與缺氧組比較，缺氧+抑制劑組的PCNA、MMP-2、MMP-9表達(dá)下降（Plt;0.05），見(jiàn)圖8和表3。

2.5" 缺氧Exo對(duì)RBE細(xì)胞N-Cadherin、Vimentin、E-Cadherin的影響

與空白組比較，常氧組的N-Cadherin、Vimentin表達(dá)升高，E-Cadherin表達(dá)降低（Plt;0.05）；與常氧組比較，缺氧組的N-Cadherin、Vimentin表達(dá)升高，E-Cadherin表達(dá)降低（Plt;0.05）；與缺氧組比較，缺氧+抑制劑組的N-Cadherin、Vimentin表達(dá)下降，E-Cadherin表達(dá)上升（Plt;0.05），見(jiàn)圖9和表4。

2.6" 缺氧Exo對(duì)JAK2/STAT3通路的影響

與空白組比較，常氧組的p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達(dá)升高（Plt;0.05）；與常氧組比較，缺氧組的p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達(dá)升高（Plt;0.05）；與缺氧組比較，缺氧+抑制劑組的p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達(dá)下降（Plt;0.05），見(jiàn)圖10和表5。

3" 討論

CCA占所有胃腸道惡性腫瘤的3%，預(yù)后極差，全球發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，其病因和發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚。手術(shù)切除是治愈CCA的唯一方法，但術(shù)后復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率較高^[9]。目前多數(shù)靶向藥物的效果并不理想^[10]。因此，迫切需要確定新的生物標(biāo)志物或靶向療法改善CCA患者的臨床結(jié)局。

Exo包含蛋白質(zhì)、信使RNA和微小RNA，廣泛分布于不同體液中，在各種生物行為中起重要作用^[11]。據(jù)報(bào)道，Exo在腫瘤微環(huán)境中以多種方式參與腫瘤的發(fā)生或轉(zhuǎn)移^[12]。Exo本身攜帶CD9、CD63、CD81、CD83、Alix、Tsg101等標(biāo)志物，可調(diào)節(jié)受體細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄翻譯、關(guān)鍵酶促反應(yīng)過(guò)程^[7]。本研究從缺氧條件下分離CCA分泌的Exo，檢測(cè)Exo標(biāo)志蛋白CD9、CD81、Tsg101，發(fā)現(xiàn)CCA細(xì)胞具有攝取Exo的能力。腫瘤相關(guān)M2巨噬細(xì)胞分泌的Exo中Circ_0020256可促進(jìn)CCA細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲^[13]。缺氧對(duì)癌癥進(jìn)展有不同的影響，不僅促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移，還驅(qū)動(dòng)癌細(xì)胞產(chǎn)生更多細(xì)胞因子、非編碼RNA和Exo，參與各種生理生化過(guò)程^[14-15]。腫瘤中的缺氧區(qū)域可作為惡性細(xì)胞的孵化器，惡性細(xì)胞適應(yīng)缺氧微環(huán)境，調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、增殖、遷移、轉(zhuǎn)移等過(guò)程^[16]。本研究中，缺氧條件下CCA分泌的Exo可增加CCA細(xì)胞的克隆形成數(shù)、細(xì)胞遷移數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)PCNA、MMP-2、MMP-9、N-Cadherin、Vimentin表達(dá)，抑制E-Cadherin表達(dá)，說(shuō)明缺氧條件下的Exo可促進(jìn)CCA細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲與EMT。

JAK2/STAT3是關(guān)鍵的炎癥信號(hào)通路，與腫瘤多個(gè)生物學(xué)行為密切相關(guān)，其異常表達(dá)對(duì)腫瘤預(yù)后有重要意義^[17]。由于JAK2在細(xì)胞中的作用，其已成為癌癥治療的重要靶點(diǎn)。STAT3可被許多細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子激活，參與致癌和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)^[18]。研究顯示抑制JAK2/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可促進(jìn)CCA細(xì)胞凋亡^[19]；細(xì)粒棘球蚴囊液及其Exo可促進(jìn)肝癌細(xì)胞Hepa1-6增殖，抑制其凋亡，可能通過(guò)JAK2/STAT3通路實(shí)現(xiàn)的。本研究中，缺氧條件下從CCA細(xì)胞中提取的Exo與CCA細(xì)胞共培養(yǎng)可促進(jìn)p-JAK2/ JAK2、p-STAT3/STAT3表達(dá)；回復(fù)實(shí)驗(yàn)中，JAK2抑制劑可逆轉(zhuǎn)結(jié)果，說(shuō)明Exo可激活JAK2/STAT3信號(hào)通路促進(jìn)CCA細(xì)胞惡性行為。

綜上，在缺氧條件下，CCA細(xì)胞Exo可促進(jìn)CCA細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲與EMT，可能通過(guò)激活JAK2/STAT3通路實(shí)現(xiàn)。然而，Exo的哪種遺傳物質(zhì)發(fā)揮作用尚不清楚，需進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2025–02–09）

（修回日期：2025–08–01）

基金項(xiàng)目：福建醫(yī)科大學(xué)啟航項(xiàng)目（2020QH1270）

通信作者：張劍華，電子信箱：710262737@qq.com