生長(zhǎng)分化因子15減輕高糖誘導(dǎo)小鼠胰島β細(xì)胞MIN6凋亡的研究

[摘要] 目的 探討生長(zhǎng)分化因子15（growth differentiation factor 15，GDF15）對(duì)高糖條件下MIN6細(xì)胞凋亡和胰島素分泌的影響。方法 將小鼠胰島β細(xì)胞株（MIN6細(xì)胞）分為4組：NG組、NG+ rGDF15組、HG組、HG+ rGDF15組。觀察比較4組細(xì)胞形態(tài)，檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)及胰島素水平。結(jié)果 HG組細(xì)胞損傷顯著，表現(xiàn)為促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)及抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下降，細(xì)胞凋亡率明顯增加，胰島素分泌量顯著降低（Plt;0.01）。重組GDF15蛋白干預(yù)可改善MIN6細(xì)胞形態(tài)，Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，胰島素分泌量有所提高（Plt;0.01）。結(jié)論 GDF15可減輕高糖環(huán)境誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞損傷。

[關(guān)鍵詞] 高糖；MIN6細(xì)胞；生長(zhǎng)分化因子15；β細(xì)胞

[中圖分類號(hào)] R589.1" """"[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A """""[DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2025.23.008

Study of growth differentiation factor 15 attenuated high glucose-induced apoptosis in mouse pancreatic islet β MIN6 cells

LI Huan¹， WU Mengqi²， WEN Zhiqiang²， DENG Huafei¹， LUO Shunrong³

1.Department of Pathophysiology， School of Basic Medical Sciences， Xiangnan University， Chenzhou 423000， Hunan， China; 2.School of Clinical Medical Sciences， Xiangnan University， Chenzhou 423000， Hunan， China; 3.Department of Pathology， School of Basic Medical Sciences， Xiangnan University， Chenzhou 423000， Hunan， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of growth differentiation factor 15 （GDF15） on apoptosis and insulin secretion of MIN6 cells under high glucose conditions. Methods The mouse pancreatic islet β cell line （MIN6 cells） were divided into four groups： NG group， NG+rGDF15 group， HG group， and HG+rGDF15 group. The cell morphology among groups were observed， the apoptosis rate， the protein expression levels of Bcl-2 and Bax and the insulin level was detected. Results HG group exhibited significant cellular damage， characterized by upregulated apoptosis-promoting protein Bax and downregulated apoptosis-suppressing protein Bcl-2 expression， accompanied by a marked increase in apoptosis rate and a substantial decrease in insulin secretion （Plt;0.01）. Administration of recombinant GDF15 protein improved MIN6 cell morphology， significantly reduced Bax protein relative expression， elevated Bcl-2 protein relative expression， markedly decreased apoptosis rate， and enhanced insulin secretion （Plt;0.01）. Conclusion GDF15 can mitigate high glucose-induced MIN6 cell damage.

[Key words] High glucose; MIN6 cells; Growth differentiation factor 15; β cell

糖尿病是一種以高血糖為主要特征的代謝性疾病，其并發(fā)癥具有強(qiáng)大破壞性，可引起全身多組織器官的功能障礙和衰竭，是嚴(yán)重威脅人類健康的常見病、多發(fā)病^[1]。糖尿病的發(fā)生與胰島β細(xì)胞遭到破壞或功能障礙有關(guān)^[2]。因此，要治愈這種疾病，就必須恢復(fù)和保護(hù)胰島β細(xì)胞。生長(zhǎng)分化因子15（growth differentiation factor 15，GDF15）是一種應(yīng)激性細(xì)胞因子，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族成員，主要參與器官生長(zhǎng)、分化、發(fā)育及細(xì)胞修復(fù)^[3-4]；在腫瘤、缺血性疾病、神經(jīng)退行性疾病、妊娠劇吐的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用^[5-7]。近年來GDF15在糖尿病發(fā)生、發(fā)展中的作用受到廣泛關(guān)注^[8-11]。研究表明GDF15水平升高與血糖穩(wěn)態(tài)和β細(xì)胞功能密切相關(guān)，揭示GDF15對(duì)預(yù)測(cè)糖尿病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的潛在價(jià)值^[12-13]；但GDF15對(duì)糖尿病胰島β細(xì)胞的作用仍有爭(zhēng)議。為進(jìn)一步明確GDF15對(duì)β細(xì)胞的作用，本研究采用體外培養(yǎng)的小鼠胰島β細(xì)胞株（MIN6細(xì)胞），探討GDF15對(duì)高糖誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞損傷的影響。

1" 材料與方法

1.1" 細(xì)胞與主要試劑

MIN6細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)上海金少源生物科技有限公司；小鼠重組GDF15蛋白（recombinant GDF15，rGDF15）購(gòu)于中國(guó)Novoprotein公司；1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；Bax、Bcl-2抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司；GAPDH抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；小鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購(gòu)于中國(guó)武漢科鹿生物科技有限責(zé)任公司，膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)BD Bioscience公司。

1.2" 細(xì)胞分組及形態(tài)觀察

本實(shí)驗(yàn)小鼠MIN6細(xì)胞在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分為4組：正常對(duì)照組（normal glucose，NG組）、正常對(duì)照+rGDF15組（NG+ rGDF15組）、高糖組（high glucose，HG）組、高糖+ rGDF15組（HG+ rGDF15組）。依據(jù)參考文獻(xiàn)[14]方法，NG組與HG組加入5.5mmol/L葡萄糖或25 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)72h；NG+rGDF15組與HG+ rGDF15組加入50μg/L rGDF15和5.5mmol/L葡萄糖或25mmol/L葡萄糖培養(yǎng)72h。在6孔板中均勻接種MIN6細(xì)胞，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)并白光拍照。

1.3" 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用不含EDTA胰酶消化細(xì)胞后進(jìn)行離心，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，并重懸于100μl結(jié)合緩沖液。緊接著進(jìn)行細(xì)胞染色，混勻后室溫避光孵育15min。預(yù)冷的結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞2次后再進(jìn)行重懸，并過濾到流式管中，通過流式細(xì)胞檢測(cè)儀（美國(guó)Beckman公司）進(jìn)行Annexin V-FITC檢測(cè)，分析細(xì)胞凋亡情況。

1.4" Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)檢測(cè)

進(jìn)行ELISA檢測(cè)，提取細(xì)胞總蛋白，并用BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度。根據(jù)測(cè)得濃度取相應(yīng)體積樣品至每孔40μg蛋白，加入5×蛋白上樣緩沖液，95～100℃沸水浴5min。常規(guī)進(jìn)行制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，再加入特異性一抗（Bcl-2、Bax稀釋比例為1：1000）4℃搖床過夜，和辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（稀釋比例為1：5000）室溫30min，然后使用化學(xué)發(fā)光顯色法顯影曝光。采用GAPDH作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化目的蛋白，記錄吸光度值。各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，收集標(biāo)本進(jìn)行離心，取細(xì)胞上清，每組設(shè)3復(fù)孔，同時(shí)分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔。檢測(cè)按照小鼠胰島素的含量。

1.5" 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 27.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 "結(jié)果

2.1" GDF15對(duì)高糖模型MIN6細(xì)胞形態(tài)的影響

NG組和NG+rGDF15組MIN6細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)飽滿，胞膜邊緣清晰，呈不規(guī)則長(zhǎng)尾梭形。HG組細(xì)胞存活率顯著降低（Plt;0.01），數(shù)量減少，棱角收縮成團(tuán)；HG+rGDF15組細(xì)胞形態(tài)較HG組有所改善，可見細(xì)胞碎片減少，密度增加，見圖1。

2.2" GDF15對(duì)高糖誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞凋亡的影響

與NG組比較，NG+rGDF15組的細(xì)胞凋亡率無明顯改變（Pgt;0.05）。高糖干預(yù)后，HG組的細(xì)胞早期和晚期凋亡率較NG組明顯升高（Plt;0.01）。使用rGDF15預(yù)處理后，HG+rGDF15組細(xì)胞凋亡率較HG組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01），見圖2。

2.3" GDF15對(duì)高糖誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞促凋亡蛋白、抗凋亡蛋白的影響

與NG組比較，NG+rGDF15組的抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。與NG組比較，HG組Bcl-2表達(dá)降低，Bax表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01）。rGDF15干預(yù)后，HG+rGDF15組的Bcl-2表達(dá)上調(diào)，Bax表達(dá)降低（Plt;0.01），見圖3。

2.4" GDF15對(duì)高糖環(huán)境下MIN6細(xì)胞胰島素分泌的影響

與NG組比較，NG+rGDF15組的MIN6細(xì)胞胰島素分泌量呈增高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。在高糖環(huán)境下，MIN6細(xì)胞胰島素分泌量明顯下降，但rGDF15干預(yù)后可明顯改善MIN6細(xì)胞胰島素分泌水平（Plt;0.01），見圖4。

3 "討論

功能性β細(xì)胞數(shù)量的減少是糖尿病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制^[15]。研究顯示長(zhǎng)期高血糖可導(dǎo)致β細(xì)胞線粒體代謝和能量合成功能受損，進(jìn)而引起β細(xì)胞的進(jìn)行性功能衰竭和凋亡^[16]。因此，如何更好地改善高糖誘導(dǎo)的β細(xì)胞損傷成為當(dāng)前研究的焦點(diǎn)。

Nakayasu等^[17]發(fā)現(xiàn)外源性補(bǔ)充GDF15可有效延緩非肥胖糖尿病小鼠的糖尿病發(fā)生、發(fā)展并抑制炎癥因子誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡。研究表明GDF15可明顯降低糖脂毒性誘導(dǎo)的人源β細(xì)胞系細(xì)胞凋亡。過表達(dá)GDF15可明顯改善鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的小鼠β細(xì)胞凋亡^[18]。Mohammad等^[19]發(fā)現(xiàn)敲除大鼠胰島細(xì)胞瘤（islet cell tumor，INS-1）細(xì)胞中GDF15的表達(dá)可明顯增加細(xì)胞凋亡。但有關(guān)GDF15對(duì)高糖誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞損傷的影響尚未見報(bào)道。

本研究中GDF15可減輕高糖誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞損傷。研究證實(shí)Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡中扮演重要角色^[20]。Bcl-2可抑制細(xì)胞凋亡，而Bax則通過促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放到胞質(zhì)進(jìn)而觸發(fā)半胱天冬酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡^[14]。本研究中rGDF15預(yù)處理可通過抑制高糖誘導(dǎo)的Bax表達(dá)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)進(jìn)而降低MIN6細(xì)胞凋亡率，進(jìn)一步證實(shí)GDF15對(duì)胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用。也有研究提出GDF15對(duì)糖脂毒性誘導(dǎo)的INS-1E細(xì)胞和原代胰島細(xì)胞凋亡無明顯作用，甚至敲除GDF15可改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡^[21]。這可能與GDF15水平、作用時(shí)間及細(xì)胞種屬不同有關(guān)，仍有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

另一方面，糖尿病的發(fā)生、發(fā)展也與胰島β細(xì)胞無法分泌充足的胰島素有關(guān)。體外研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)GDF15可明顯促進(jìn)INS-1細(xì)胞和小鼠胰島β細(xì)胞系細(xì)胞分泌胰島素，使用小干擾RNA降低GDF15的表達(dá)也能明顯抑制胰島素的分泌^[22]。本研究GDF15在抑制高糖條件下MIN6細(xì)胞凋亡的同時(shí)，也明顯促進(jìn)高糖條件下胰島素的釋放。GDF15在低糖條件下的胰島素分泌呈增高趨勢(shì)，這提示GDF15對(duì)β細(xì)胞的刺激可呈現(xiàn)葡萄糖依賴性，但后續(xù)仍需進(jìn)一步研究。

綜上，本研究證實(shí)GDF15明顯改善高糖模型對(duì)MIN6細(xì)胞的損傷，提示其可通過保護(hù)胰島β細(xì)胞的數(shù)量和功能防治糖尿病。但GDF15作用的差異可能與細(xì)胞類型或?qū)嶒?yàn)條件有關(guān)，需進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2025–03–05）

（修回日期：2025–07–18）

基金項(xiàng)目：2021年度校級(jí)科學(xué)研究項(xiàng)目（湘南學(xué)院校發(fā)〔2021〕139 號(hào)-2021XJ38）

通信作者：羅順蓉，電子信箱：1608401080@qq.com