miR-204-5p靶向調節TRIB3對大鼠缺氧缺血性腦損傷后海馬神經干細胞增殖的影響

[摘要] 目的 探討微小RNA-204-5p（microRNA-204-5p，miR-204-5p）對大鼠缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）后海馬神經干細胞增殖的影響，分析其與Tribble同源蛋白3（Tribbles homolog 3，TRIB3）的關系。方法 體外培養原代海馬神經干細胞。未接受任何處理的細胞為CK組，對其進行氧糖剝奪（oxygen and glucose deprivation，OGD）損傷處理為OGD組，在OGD的基礎上再分為miR-NC組、miR-204-5p模擬物組、沉默-NC組、沉默-TRIB3組、miR-204-5p 模擬物+pcDNA3.1組、miR-204-5p模擬物+pcDNA3.1-TRIB3組。檢測各組miR-204-5p和TRIB3 mRNA表達，海馬神經干細胞增殖情況。分析miR-204-5p與TRIB3靶向關系。結果 與CK組比較，OGD組miR-204-5p表達、A值、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）蛋白表達均降低，TRIB3表達升高（Plt;0.05）。與miR-204-5p模擬物組比較，OGD組、miR-NC組miR-204-5p表達、A值、PCNA、Cyclin D1蛋白表達均升高，TRIB3表達降低（Plt;0.05）。與miR-204-5p 模擬物+pcDNA3.1-TRIB3組比較，miR-204-5p模擬物組、miR-204-5p模擬物+pcDNA3.1組TRIB3表達升高，A值、PCNA、Cyclin D1蛋白表達均降低（Plt;0.05）。miR-204-5p與TRIB3存在結合位點。結論 miR-204-5p過表達可抑制TRIB3的表達，進而促進HIBD后海馬神經干細胞增殖。

[關鍵詞] miR-204-5p；Tribble同源蛋白3；缺氧缺血性腦損傷；神經干細胞

[中圖分類號] R743" """"[文獻標識碼] A """""[DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2025.23.001

Effect of miR-204-5p targeted regulation of TRIB3 on the proliferation of hippocampal neural stem cells in rats after hypoxic-ischemic brain damage

FAN Ling， HE Mengzao， JIANG Jinping

Departmen of Neonatology， Hangzhou Women’s Hospital， Hangzhou 310008， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of microRNA-204-5p （miR-204-5p） on the proliferation of hippocampal neural stem cells in rats after hypoxic-ischemic brain injury （HIBD）， and to analyze its relationship with Tribbles homolog 3 （TRIB3）. Methods In vitro primary hippocampal neural stem cell culture was conducted. The untreated cells were designated as the CK group， while those subjected to oxygen and glucose deprivation （OGD） injury treatment were classified as the OGD group. Subgroups were established based on OGD conditions： miR-NC group， miR-204-5p mimic group， silencing-NC group， silencing-TRIB3 group， miR-204-5p mimic+pcDNA3.1 group， and miR-204-5p mimic+pcDNA3.1-TRIB3 group. The expression of miR-204-5p and TRIB3 mRNA and the proliferation of hippocampal neural stem cells were detected. The target relationship between miR-204-5p and TRIB3 was analyzed. Results Compared with CK group， OGD group showed decreased expression of miR-204-5p， A value， proliferating cell nuclear antigen （PCNA） and CyclinD1 protein expression， and increased expression of TRIB3 （Plt;0.05）. Compared with miR-204-5p mimic group， OGD group and miR-NC group showed increased expression of miR-204-5p， A value， PCNA and CyclinD1 protein， and decreased TRIB3 expression （Plt;0.05）. Compared with miR-204-5p mimic+pcDNA3.1-TRIB3 group， miR-204-5p mimic group and miR-204-5p mimic+pcDNA3.1 group showed increased TRIB3 expression and decreased A value， PCNA and CyclinD1 protein expression （Plt;0.05）.There were binding sites for miR-204-5p and TRIB3. Conclusion The overexpression of miR-204-5p can inhibit the expression of TRIB3 and promote the proliferation of hippocampal neural stem cells after HIBD.

[Key words] miR-204-5p; Tribbles homolog; Hypoxic-ischemic brain damage; Neural stem cells

缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）主要指由于腦組織缺氧缺血而引發的腦部損傷，是臨床上致使新生兒殘疾及死亡的關鍵因素^[1]。研究顯示在發生窒息的新生兒群體中，因HIBD致死的比例達到20%～50%^[2]。目前，HIBD臨床治療主要包括藥物治療、支持治療及亞低溫治療等^[3]；但預后不良的情況頻繁出現，因此對HIBD相關機制進行研究，積極探尋其有效治療靶點至關重要^[4]。微小RNA（microRNA，miRNA）是非編碼小分子RNA，可與mRNA的特定區域進行互補配對，形成RNA-RNA雙鏈結構，參與細胞增殖、凋亡、分化等重要生理過程^[5]。研究表明在腦缺血及再灌注誘導的神經元損傷中，微小RNA-204-5p（microRNA- 204-5p，miR-204-5p）表達發生變化^[6]。對Tribble同源蛋白3（Tribbles homolog 3，TRIB3）進行沉默，可進一步減輕糖尿病小鼠腦缺血再灌注損傷癥狀^[7]。本研究重點探討miR-204-5p在大鼠HIBD發生后對海馬神經干細胞增殖的影響，并分析是否可通過靶向調節TRIB3發揮作用，以期為HIBD治療挖掘具有應用價值的靶點。

1" 材料與方法

1.1 "實驗動物

SPF級健康SD孕16～18d鼠實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2020-0024]購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。本研究經杭州市婦產科醫院醫學倫理委員會批準（倫理審批號：202112-2701）。

1.2 "主要試劑與儀器

DMEM/F12培養基（江藍純生物公司），實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈式反應（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒（信裕生物公司），細胞計數試劑盒-8法（cell counting kit-8 assay，CCK-8）試劑盒（愛必信生物公司）；Lipofectamine 2000轉染試劑（善然生物公司），增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、TRIB3、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）及IgG二抗（英國Abcam公司），PCR儀（美國ABI公司）；蛋白凝膠成像儀（美國Bio-Red公司）；CO₂細胞培養箱（德國Eppendorf公司），熒光顯微鏡（德國Leica公司）。

1.3 "實驗方法

1.3.1 "原代海馬神經干細胞的分離和培養" 孕鼠麻醉后用75%乙醇進行消毒處理，在嚴格無菌環境下，從孕鼠體內取出胎鼠，迅速分離其顱骨與硬腦膜，剔除小腦、血管等結構，獲取完整海馬組織，剪碎組織，胰酶消化，使用含1%青霉素和鏈霉素雙抗和10%胎牛血清的DMEM/F12培養基中輕柔吹打，200目細胞篩過濾，1500轉/min離心5min，加適量培養基重懸細胞后，將細胞懸液接種于培養皿，培養箱培養，次日用含DMEM/F12培養基、20mg/L堿性成纖維細胞生長因子、20mg/L表皮生長因子、2% B27營養補充劑、1%雙抗（青霉素、鏈霉素）混合液全量換液。培養的第3～4天，采用半量換液方式維持細胞生長環境的穩定。后續培養可用氧糖剝奪（oxygen and glucose deprivation，OGD）實驗。

1.3.2 "原代海馬神經干細胞的鑒定 "選取生長狀態優良的神經干細胞接種蓋玻片（多聚賴氨酸包被）上，放入24孔細胞培養板培養12 h（37 ℃、5 % CO₂）。待細胞貼壁，吸去培養液，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗，甲醛固定30min，PBS沖洗。隨后將細胞放入含0.3 % Triton-100的PBS緩沖液，37 ℃孵育10min，PBS沖洗。用10 %山羊血清室溫封閉30min，加Nestin抗體，4 ℃過夜，加二抗，37℃暗處孵育40min，PBS沖洗，暗處晾干。最后熒光封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。

1.3.3 "缺氧缺血模型的建立與分組 "對培養的海馬神經干細胞實施轉染并進行分組。CK組：細胞未接受任何處理；OGD組^[8]：將細胞接種至培養板（含無糖D-Hanks液），放入2L潮濕密閉容器，于37℃恒溫箱中向容器充入由5%CO₂和95% N₂組成的混合氣體，在密閉環境中缺氧2h，再進行常規孵育24h；miR-NC組：在OGD處理的基礎上轉染miR-NC；miR-204-5p模擬物組：在OGD處理的基礎上轉染miR-204-5p模擬物；沉默-NC組：在OGD處理的基礎上轉染si-NC；沉默-TRIB3組：在OGD處理的基礎上轉染si-TRIB3；miR-204-5p 模擬物+pcDNA3.1組：在OGD處理的基礎上共轉染miR-204-5p 模擬物和pcDNA3.1；miR-204-5p 模擬物+pcDNA3.1- TRIB3組：在OGD處理的基礎上共轉染miR-204-5p 模擬物和pcDNA3.1-TRIB3。

1.3.4 "檢測miR-204-5p和TRIB3 mRNA表達 "采用Trizol試劑盒對各組海馬神經干細胞總RNA進行提取，經cDNA合成試劑盒反轉為cDNA，隨后對cDNA實施qRT-PCR擴增反應。實驗選取U6、GAPDH分別為miR-204-5p、TRIB3的內參基因，2^-ΔΔCt法計算基因相對表達量。引物序列見表1。

1.3.5 "CCK-8法檢測海馬神經干細胞的增殖 "收集各組的海馬神經干細胞，以5×10³個細胞/孔接種96孔板，37℃，5% CO₂環境培養24 h；細胞貼壁后，向每孔加入10μl CCK-8試劑，同樣環境中反應2h，酶標儀測定A_{450 nm}。

1.3.6 "檢測miR-204-5p、TRIB3靶向關系 "利用starBase網站對miR-204-5p和TRIB3的結合位點預測，構建野生型（wild type，WT）和突變型（mutant type，MUT）TRIB3雙熒光素酶報告載體，分別與miR-NC、miR-204-5p mimic共轉染海馬神經干細胞，得到不同的分組，48 h后檢測其相對熒光素酶活性。

1.3.7" 檢測增殖相關蛋白及TRIB3蛋白表達 "蛋白質免疫印跡（western blotting，WB）法收集各轉染組細胞，將其加入放射免疫沉淀分析裂解液中并進行離心，對總蛋白進行提取，之后在二喹啉甲酸試劑盒作用下測定其濃度，分別配置不同的膠，電泳分離蛋白，轉聚偏二氟乙烯膜、封閉。加一抗（PCNA、CyclinD1、TRIB3、GAPDH），4 ℃過夜孵育，次日洗膜，加二抗室溫孵育2h。借助Image Lab?軟件對蛋白條帶實施定量分析。

1.4 "統計學方法

采用SPSS 25.0統計學軟件對數據進行處理分析，計量資料以均數±標準差（"）表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2" 結果

2.1 "大鼠原代海馬神經干細胞的建立

培養3～4d，大鼠原代海馬神經干細胞由單個細胞逐漸聚為圓形或橢圓形細胞團；在顯微鏡下，部分細胞團中心可見小黑點。免疫熒光鑒定結果可見，幾乎所有原代海馬神經干細胞均呈綠色熒光。

2.2 "各組miR-204-5p、TRIB3 mRNA的表達

與CK組比較，OGD組miR-204-5p表達降低，TRIB3 mRNA表達升高（Plt;0.05）。與miR-204-5p模擬物組比較，OGD組、miR-NC組miR-204-5p表達升高，TRIB3 mRNA表達降低（Plt;0.05）。與沉默-TRIB3組比較，OGD組、沉默-NC組TRIB3 mRNA表達降低（Plt;0.05）。與miR-204-5p模擬物+pcDNA3.1-TRIB3組比較，miR-204-5p 模擬物組、miR-204-5p模擬物+pcDNA3.1組TRIB3 mRNA表達升高（Plt;0.05），見表2。

2.3 "各組海馬神經干細胞增殖能力

OGD組A值較CK組降低，miR-204-5p 模擬物組A值較OGD組、miR-NC組升高（Plt;0.05）。沉默-TRIB3組A值較OGD組、沉默-NC組升高，miR- 204-5p模擬物+pcDNA3.1-TRIB3組A值較miR-204- 5p模擬物組、miR-204-5p模擬物+pcDNA3.1組降低（Plt;0.05），見表3。

2.4 "miR-204-5p和TRIB3靶向關系驗證

與miR-NC+TRIB3-WT組比較，miR-204-5p 模擬物+TRIB3-WT組相對熒光素酶活性降低（Plt; 0.05），見表4。miR-204-5p、TRIB3結合位點見圖1。

2.5 "各組海馬神經干細胞增殖相關蛋白及TRIB3蛋白表達

與CK組比較，OGD組細胞PCNA、CyclinD1蛋白表達降低，TRIB3蛋白表達升高（Plt;0.05）。與miR-204-5p 模擬物組比較，OGD組、miR-NC組細胞PCNA、CyclinD1蛋白表達升高，TRIB3蛋白表達降低（Plt;0.05）。與沉默-TRIB3組比較，OGD組、沉默-NC組細胞PCNA、CyclinD1蛋白表達升高，TRIB3蛋白表達降低（Plt;0.05）；與miR-204-5p 模擬物+pcDNA3.1-TRIB3組比較，miR-204-5p 模擬物組、miR-204-5p 模擬物+pcDNA3.1組細胞PCNA、CyclinD1蛋白表達降低，TRIB3蛋白表達升高（Plt;0.05），見圖2、表5。

3" 討論

新生兒中樞神經系統病變可由HIBD引發，而HIBD是多種因素致使腦部缺氧缺血的結果。在HIBD的影響下，腦部多個區域發生損傷，其中海馬對缺氧缺血損傷的敏感度最高^[8-9]。促進神經細胞實現增殖再生，在治療神經損傷中至關重要^[10]。新生兒HIBD是危及其生命安全、引發腦損傷的關鍵原因，造成智力發育遲緩、學習能力薄弱甚至死亡^[11]。

miRNA可依據堿基互補原則，與靶mRNA的3’-UTR特異性結合，進而通過抑制mRNA翻譯或促使其降解調控基因表達^[12-13]。研究顯示miRNA廣泛參與神經退行性疾病、胚胎發育等多種生理、病理過程^[14]。研究報道miR-204-5p可通過靶向血管細胞黏附分子1，進而改善七氟烷誘導的新生大鼠腦損傷^[15]。Wang等^[16]研究發現在心肌缺血再灌注損傷中，長鏈非編碼RNA DLX6反義RNA1可通過對miR-204-5p/F-box和WD重復結構域蛋白7軸進行調控，進而參與心肌缺血再灌注誘導的腦損傷過程。Rong等^[17]研究發現長鏈非編碼RNA KCNQ1重疊轉錄物1可通過調節miR-204-5p/半乳凝素3軸，對小鼠心肌缺血/再灌注損傷產生影響。本研究OGD組較CK組miR-204-5p表達降低，同時海馬神經干細胞的增殖能力下降，當上調miR-204-5p表達后，細胞增殖能力升高，進一步驗證miR-204-5p對細胞增殖的促進作用。TRIB3表達出現異常時，可對缺血再灌注引發的神經細胞凋亡過程產生影響^[18]。本研究在網站預測及熒光素酶活性驗證下，證實miR-204-5p與TRIB3存在結合位點，呈現靶向調控關系，且抑制TRIB3可促進細胞增殖。閻雯等^[8]研究發現沉默TRIB3可推動缺氧缺血后海馬神經元的細胞增殖。作為細胞增殖標志物，PCNA、CyclinD1在細胞增殖調控過程中發揮重要作用^[19]。細胞增殖抗原PCNA作為一種核蛋白，在DNA損傷修復中占據核心地位^[20]。CyclinD1作為有絲分裂進程的關鍵傳感器，可參與細胞周期G1期向G1/S期的轉換過程，啟動DNA復制過程^[21]。本研究OGD組較CK組OD值、PCNA、CyclinD1蛋白表達降低，它們的表達變化與細胞增殖能力的改變相匹配，表明OGD處理可使海馬神經干細胞增殖能力下降。miR-204-5p模擬物+pcDNA3.1- TRIB3組較miR-204-5p模擬物組、miR-204-5p模擬物+pcDNA3.1組TRIB3表達升高，A值、PCNA、CyclinD1蛋白表達均降低，表明過表達TRIB3可部分抵消miR-204-5p對細胞增殖的促進作用，提示miR-204-5p可通過抑制TRIB3表達調節PCNA和CyclinD1等相關蛋白，影響海馬神經干細胞增殖。

綜上，miR-204-5p過表達可抑制TRIB3表達，進而促進HIBD后海馬神經干細胞增殖。本研究目前僅停留在細胞層面，后續計劃開展更深入的探究，將研究拓展至動物體內進行。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2025–04–07）

（修回日期：2025–07–22）

基金項目：浙江省醫藥衛生計劃項目（2022KY273，2025KY1179）

通信作者：范玲，電子信箱：fanling1023@126.com