靶向二代測序在人類免疫缺陷病毒合并肺部感染診斷中的應用進展

[摘要] 艾滋病相關肺部感染的病原體眾多，早期明確病原體對疾病的治療具有重要意義。常規微生物檢測耗時長、敏感度差，且檢測效率低。靶向二代測序（targeted next-generation sequencing，tNGS）作為一種新興的病原體檢測方法，可實現DNA和RNA共檢，不受人類基因組影響，縮短檢測時間，滿足臨床檢測需求。本文闡述tNGS在人類免疫缺陷病毒合并肺部感染診斷中的研究進展，為其臨床應用提供參考。

[關鍵詞] 靶向二代測序；人類免疫缺陷病毒；肺部感染；病原體診斷

[中圖分類號] R563.1；R512.91" """"[文獻標識碼] A """""[DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2025.25.026

人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染的主要特征是持續性損傷宿主的免疫系統，使感染者免疫功能低下而合并多種機會性感染，其中最常見的是肺部感染^[1]。感染HIV使得宿主的肺部和呼吸道防御發生改變，增加肺部感染風險，肺部感染是HIV感染者發病率和死亡率上升的重要原因^[2]。肺部感染常由細菌、真菌、病毒引起，可能存在一種或多種感染，臨床上多為混合感染^[3]。盡早明確HIV感染者合并肺部感染的病原體尤為重要。常規微生物檢測效率低、用時長，且易受抗生素使用的影響。靶向二代測序（targeted next-generation sequencing，tNGS）是一種有潛力的檢測方法，可彌補常規檢測方法的局限性，識別罕見病原體，為臨床治療提供依據^[4-5]。

1" tNGS概況

tNGS是一種具有靶向性的檢測技術，是將二代測序（next-generation sequencing，NGS）技術與聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）優點相結合的新一代測序技術，其不僅具有PCR技術的敏感度、時效性、普適性，也具有NGS技術的高通量、特異性等特點。tNGS是臨床上一種全面、快速的可行選擇^[6]。tNGS直接對臨床樣本中的特定病原微生物基因組進行富集，繼而再進行高通量測序，與數據庫進行比對，根據得到的序列信息分析樣本中的病原微生物種類，可快速獲得檢測結果，為臨床診斷治療提供有力依據。tNGS還可同時檢測DNA和RNA，縮短檢測時間，使感染性疾病的診療工作事半功倍^[7-8]。

2" tNGS的診斷優勢

2.1" 與宏基因組二代測序比較

宏基因組二代測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）是一種非靶向高通量測序技術，適用于各種病原微生物的測定^[9]。mNGS在肺部感染領域的應用帶動病原體診斷的進步，但由于其成本較高，在臨床的普適性較tNGS差。tNGS在檢測時間和成本上均具有較大優勢。與mNGS相比，tNGS檢測呼吸道病原體的成本下降3/4。mNGS的平均周轉時間約為48h，不能同時檢測DNA和RNA是mNGS的一大弊端^[10]。tNGS可整合DNA和RNA，縮短檢測時間。Deng等^[11]研究發現tNGS的平均周轉時間為20.2h。mNGS依賴人體宿主的背景值，使結果受到影響；tNGS的檢測靶點包括預先設定的病原體，不需要花費額外時間和成本去除人源化干擾，不受人類基因組和背景菌群的影響^[7，12]。mNGS的測序深度需根據檢測目標和經費預算靈活調整；而tNGS固定測序深度運行，在保證結果可靠性的同時實現成本優化^[13]。tNGS檢測可全面覆蓋已知突變并有助于在靶基因的完整編碼區發現未表征的新突變或罕見突變^[14]。此外，tNGS可有效檢測結核分枝桿菌的耐藥菌株，這在mNGS技術中是難以實現的^[15]。

2.2" 與傳統檢測方法比較

對呼吸道感染疾病，臨床通常使用微生物培養、抗原抗體免疫學等方法進行微生物檢測^[16]。tNGS的檢測時間約為24h，而常見病原體培養至少需要48h，對生長條件更嚴苛的微生物則需要更長的時間；真菌和分枝桿菌等甚至需要數周時間^[17]。微生物培養與溫度、所需營養物質和生長因子密切相關。對一些難培養的苛養細菌、厭氧菌和病毒培養耗時長且檢出率低^[18]。抗原檢測操作簡單，但敏感度較低，操作不當或標本被污染可造成假陽性或假陰性^[19]。抗體檢測可提高臨床診斷的敏感度，但無法估算其持久性，可能出現實驗的交叉反應；此外，抗體檢測不可作為單獨的檢測指標，需聯合其他檢測法提高疾病的檢出率^[20]。PCR技術對引物有較高要求，不能靶向檢測基因^[21]。約60%的病原體無法通過常規微生物檢測明確，且檢測的準確性和及時性亦無法滿足臨床診療的需求，而tNGS的診斷效能遠高于傳統檢測方法^[22-24]。

3" tNGS在HIV合并肺部感染中的應用

3.1" 細菌

肺臟是最常見的細菌感染部位，HIV感染者細菌性肺炎的發病率是普通人群的25倍，隨著CD4細胞數量的下降，其發病率逐漸增高^[25]。在HIV感染者中，結核病是最常見的機會性感染疾病之一，主要影響肺部，導致患者長期嚴重咳嗽，二者同時感染可加速疾病進展^[26]。因此需準確、快速地及時診斷病原體，以便開展早期治療。在鑒定結核分枝桿菌及其相關耐藥性方面，tNGS展現出快速且穩健的性能^[27]。細菌培養和涂片鏡檢通常是細菌診斷的首選方法，但并不是所有的微生物都可用于培養，tNGS可為細菌病原體的檢出提供快速、簡便的方法。一項研究利用tNGS分析中國西藏高原地區社區獲得性肺炎的病原學分布，發現在革蘭陽性球菌中檢出率最高的是肺炎鏈球菌，在革蘭陰性桿菌中檢出率最高的是嗜血桿菌屬^[21]。Zhang等^[28]研究納入8例肺膿腫患者，常規細菌培養僅檢測出1例微小小單孢菌陽性患者；而tNGS成功檢測出8例微小小單孢菌陽性患者。

3.2" 真菌

HIV感染者肺部感染的真菌多為機會性致病菌^[29]。肺孢子菌是肺部感染的常見致病真菌，在免疫抑制人群中更常見；當CD4細胞計數低于200個/μl時可造成危及生命的肺炎^[30]。真菌性肺炎易發生于HIV感染者、嚴重的血液惡性腫瘤及長期使用免疫抑制劑等免疫功能低下的人群中^[31]。新型隱球菌是常見致病性真菌，早期臨床癥狀不典型，發展成為隱球菌腦膜炎才會出現典型的臨床表現，因此在未發展為腦膜炎時診斷病原體能較好地改善患者預后^[32]。某院收治的淋巴瘤患者在完全緩解期發現無癥狀肺部結節，初試抗細菌治療無效后，采用tNGS檢測確診為肺隱球菌感染，經針對性治療實現肺部病灶完全消退，原發淋巴瘤持續保持完全緩解，證實tNGS檢出病原體具有較大優勢，及時盡早地做出診斷對有效控制真菌感染尤為重要^[33]。

3.3" 病毒

與未感染HIV人群相比，HIV感染者感染呼吸道病毒的概率是前者的幾十倍^[34]。臨床上由病毒引起的肺部感染并不少見^[35]。在病毒感染早期給予抗病毒治療的臨床效果會更好，而常規微生物檢測方法常低估病毒對肺部感染的影響力，因此需要更加快速的診斷方法^[36-38]。Sun等^[39]對90例肺部感染患者的肺泡灌洗液采用mNGS和tNGS對病原體進行檢測，結果發現相較于mNGS，tNGS可檢出一些額外的病原體，主要為病毒，提示tNGS比mNGS檢測肺部感染病原體的優勢更大。

3.4" 特殊病原體

常見的非典型肺部病原體（特殊病原體）包括肺炎支原體、肺炎衣原體、貝氏柯克斯體等^[40]。肺炎支原體是常見的呼吸道病原體，可引發肺炎、支氣管炎和上呼吸道感染等疾病^[41]。肺炎支原體因其獨特的生物學特性，既無細胞壁結構又增殖遲緩，使得傳統培養檢測面臨困難：培養法分離時間長達3周，血清學檢測可出現假陰性^{[13，40，42]}。肺炎衣原體在HIV感染人群中的發病率與CD4細胞計數成反比，若免疫功能低下則可導致更嚴重的肺部疾病甚至死亡^[43-44]。Deng等^[5]研究中的tNGS檢測特殊病原體的陽性率為7.7%，檢測常規微生物的陽性率為6.2%，提示tNGS診斷非典型病原體效能高于常規微生物檢測方法。非典型病原體在HIV感染人群中診斷困難，tNGS可顯著提高非典型病原體的識別能力，克服常規微生物檢測的技術短板。

3.5" 在肺部混合感染中的應用

由于HIV感染者免疫功能低下，肺部感染在臨床上多為混合感染，常見的是細菌–真菌混合感染和細菌–細菌混合感染^[45]。感染不同的病原體可出現臨床癥狀重疊，難以精準區分致病病原體^[37]。陶鋒等^[46]對不明原因肺部感染的患者進行tNGS檢測，發現tNGS檢測對雙重感染甚至多重感染的診斷能力高于常規微生物檢測方法。

4" 臨床診治中的難點與挑戰

盡管tNGS在臨床診斷中有明顯技術優勢，但也存在一些困難和挑戰。①操作流程較為煩瑣，且對操作人員的專業素質要求較高。因此需要加強相關醫護人員的培訓與人才儲備^[3]。②tNGS采用靶向擴增方法，雖可提高目標序列的檢測能力，但同時也存在漏檢非靶向序列的不足^[47]。③對樣本要求高，若樣本中病原體核酸含量過低（如早期感染、局部感染或經抗生素預處理后），可能因低于tNGS檢測下限而無法檢出。④雖然tNGS可為臨床耐藥分析提供基礎，但耐藥基因與表型表達的相關性仍需更多臨床深入探索驗證。

5" 小結與展望

tNGS作為檢測病原體的一種新興技術，具有快速、準確、敏感度高等特點，對肺部感染病原體和耐藥性檢測有較大的應用價值。特別是對免疫功能低下的HIV感染者，臨床合并多種病原菌感染時，可快速、精準地診斷以指導臨床治療。隨著技術的發展和臨床經驗的積累，tNGS在感染性疾病診斷和管理中的應用將更加廣泛和精準。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2025–03–27）

（修回日期：2025–08–08）

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通信作者：陶鵬飛，電子信箱：584842336@qq.com