circ-SFMBT2通過對miR-491-5p的海綿作用靶向HOXA9在急性髓系白血病治療反應中的作用

中圖分類號：R733.71 文獻標志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2025.08.002

Role of circ-SFMBT2 in targeting HOXA9 through its sponge like effect on miR-491-5p in the treatment response of acute myeloid leukemia

ZHOU Chang，LI Jiaxin， YIN Chang， JIANG Libo， LU Ting， XU Lingling （DepartentofHematologyheecondAfliated Hospitalof QiqiharMedical University，Qiqihar616，Hilongiang，China 【Abstract】ObjectiveTo investigate the mechanistic role of circularRNA SFMBT2（circ-SFMBT2）in acute myeloid leukemia（AML）bysponging miR-491-5pand targeting HOXA9.MethodsAtotal of 30AML patients and30 age-and sex-matched patients withbenign anemia（control group）who visitedthe Departmentof Hematologyof the SecondAffiliated HospitalofQiqihar Medical UniversityfromJanuaryto September2O24 wereselectedas thesubjectsofthe study.Expression levelsof circ-SFMBT2，miR-491-5p，andHOXA9 inbonemarrowcellsweredetectedbyreversetranscription-quantitative PCR（RT-qPCR）.Celltransfection techniqueswere employed tosilencecirc-SFMBT2（si-circ-SFMBT2 group）and co-transfect with miR-491-5p inhibitor（si-circ-SFMBT2 + miR-491-5p inhibitor group）．And then，the ffects of these treatments on the proliferation，apoptosis，migration，and invasion capacities of AMLcells were analyzed.ResultsThe expresion levelsof circ-SFMBT2 and HOXA9 inthe bone marrow of the AML group were significantly higher thanthose in the control group （ Plt;0. 001 ），while miR-491-5p expressionwas significantly lower than that in the control group（ Plt; 0.001）.Correlationanalysis revealedasignificant negativecorelation between circ-FMBT2andmiR-491-5pexpressions （ r=-0.956 ！ Plt;0.001 ），a significant negative correlation between HOXA9 and miR-491-5p expressions （ r=-0.977 ， Plt; 0.001），and a significant positive correlation between HOXA9 and circ-SFMBT2 expressions （ r=0.977 ， Plt;0.001 ）. Functionalexperimentsshowedthatcomparedwiththecontrol siRNAgroup，thesi-circ-SFMBT2group exhibited significantly downregulated circ-SFMBT2 and HOXA9 mRNA expressions （ Plt;0. 05 ），upregulated miR-491-5p expression （ Plt;0.05 ）， reduced AML cell survival capacity，migration，and invasion counts （ Plt;0.05 ），and increased apoptosis rate （ Plt;0.05 ）. In comparison with the si-circ-SFMBT2 group，the si-circ-SFMBT2 + miR-491-5p inhibitor group showed significantly upregulated HOXA9 mRNA levels （ Plt;0. 05 ），downregulated miR-491-5p expression （ Plt;0. 05 ），increased AML cell survival capacity，migration，and invasion counts （ Plt;0.05 ），and decreased apoptosis rate （ Plt;0.05 ）.Conclusion circ-SFMBT2 is highlyexpressed inAMLandmayactasamolecularsponge toinhibit theexpressionofmiR-491-5p，therebyrelieving its targeting inhibitionof HOXA9，andthen maysubsequently promote theproliferation，migration，and invasivecapacityof AML cells.

【Keywords】 circularRNA SFMBT2（circ-SFMBT2）；miR-491-5p；HOXA9；acute myeloid leukemia（AML）

急性髓性白血病（acutemyeloidleukemia，AML）是一種由骨髓祖細胞惡性克隆增殖導致的疾病，其主要病理特征為骨髓內異常髓樣細胞的聚集和分化障礙，進而影響正常造血功能[1-3]。盡管近年來在AML的診斷和治療領域取得了一定進展，但由于其高度異質性和復雜的分子機制，該疾病的長期生存率仍不理想[4-5]。因此，深入探索AML的發病機制，發現新的干預靶點，對AML的防治具有重要意義。環狀RNA（circRNA）是一類具有共價閉合環狀結構、不易被RNA外切酶降解的非編碼RNA，具有高度的穩定性和組織特異性[6-8]。近年研究表明，cir-cRNA在多種癌癥中發揮重要作用，參與調控腫瘤發生發展的多個環節，包括細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程[9-I1]。已有研究證實，環狀 RNA SFMBT2（circ-SFMBT2）可通過“海綿”效應調控miRNA功能，進而影響下游基因的表達[12]。此外，HOXA9基因作為重要的轉錄因子，與AML的發生發展密切相關[13]。本研究旨在探討circ-SFMBT2、miR-491-5p和HOXA9在AML患者中的表達特征及其生物學功能，并進一步研究其對AML細胞活力的影響，揭示其可能的作用機制，為AML的診斷和治療提供新的理論依據。

1 對象與方法

1.1研究對象選取2024年1月至9月于齊齊哈爾醫學院附屬第二醫院血液內科就診的患者作為研究對象。本研究納人30例年齡為18～72歲、男女性別比例均衡的確診AML患者（AML組），以及30例年齡、性別匹配的良性貧血患者（對照組）。收集兩組患者的病歷信息并采集骨髓樣本，詳見表1。所有實驗均經齊齊哈爾醫學院附屬第二醫院醫學倫理委員會批準（倫科審[2024]01第21號）。所有納入研究的患者均被告知試驗細節，并在試驗前簽署知情同意書。

表1兩組患者一般資料的比較（x±s）

1.2納入和排除標準AML組納入標準： ① 年齡gt;18歲； ② 符合AML中國診療指南標準[14]； ③ 精神及認知功能正常； ④ 病歷資料完整。AML組排除標準： ① 繼發性AML患者，包括繼發于MDS或治療相關的AML; ② 研究前接受過化療或放療； ③ 合并其他惡性腫瘤，如結腸癌、乳腺癌、肺癌等； ④ 患有自身免疫系統疾病，如系統性紅斑狼瘡、干燥綜合征、類風濕性關節炎等。對照組納入標準： ① 經骨髓細胞形態學檢測確診為缺鐵性貧血等良性貧血； ② 年齡gt;18 歲; ③ 精神及認知功能正常。對照組排除標準：① 患有其他基礎疾病或血液系統疾病； ② 不配合研究或中途退出。

1.3細胞培養對兩組患者進行骨髓穿刺，消毒穿刺部位皮膚，作皮膚和骨膜下局麻，提取骨髓血中的細胞。將AML細胞置于RPMI-164O培養基中培養，培養液含 10% 胎牛血清、 100U/mL 青霉素和100μg/mL 鏈霉素，在 37%5% CO₂ 條件下培養。

1.4實時熒光定量PCR（RT-qPCR）采用TRIzol試劑、PrimerScriptRT試劑盒和miRNAcDNA一級合成試劑盒提取總RNA后合成cDNA并逆轉錄miRNA。RT-qPCR檢測采用熒光定量試劑盒進行擴增。 β -actin及U6是circRNA、mRNA及miRNA表達的對照基因。通過 2^-ΔΔCt 方法計算目的基因的表達量。circ-SFMBT2：正向引物 5^° -GCGTCGTGTGAC-TAAGCAATC-3’；反向引物 -CCAATCCCACAT-AGCGAAGG- .3^° ;miR-491-5p：正向引物 ₅， -GGAGT-GGGGAACCCTTCC-3'；反向引物 5^° -GTGCAGGGTC-CGAGGT-3';HOXA9：正向引物 5^° -CTTACCCAAGCT-TCACTCACC-3'；反向引物 5^° -AAGAGGCCTGGTGC-TACTAC-3' ; β -actin：正向引物 5^° -CTCCATCCTGGC-CTCGCTGT-3’；反向引物 -GCTGCTACCTTCAC-CGTTCC-3'；U6：正向引物 5^′ -GTGCTCGCTTCG-GCAGCACAT-3’；反向引物5’-AATATGGAACGCT-TCACGAAT-3'。

1.5細胞轉染過程將AML細胞接種于6孔板中，每孔 5×10⁵ 個細胞， 37°C 培養過夜。隨后，使用LipofectamineTM 3000轉染試劑分別轉染對照 siRNA、si-circ-SFMBT2和miR-491-5p抑制劑。同時設立未轉染的對照組。轉染完成后，采用RT-qPCR技術檢測circ-SFMBT2miR-491-5p及HOXA9的mRNA表達水平，以評估轉染效果。

1.6細胞增殖檢測將AML細胞接種于96孔板中，每孔加入 10μL 四甲基偶氮唑鹽（MTT）溶液，繼續培養4小時。隨后棄去上清液，加入 100μL 二甲基亞砜（DMSO）溶解裂解物，避光處理。使用微孔板讀數儀（BIOTEK，美國）在 490nm 波長處測定吸光度（OD）值。

1.7細胞凋亡檢測收集 AML 細胞，用PBS洗滌2次。每管加人 2.5μL Annexin ΔV 和 2.5μL 碘化丙啶（propidiumiodide），輕輕振蕩混勻，室溫避光孵育15分鐘。隨后每管加入 1mL PBS， 1500rpm 離心5分鐘，重復洗滌兩次后，使用流式細胞儀分析細胞凋亡百分比。

1.8細胞遷移和侵襲實驗采用Transwell小室法測定AML細胞的遷移和侵襲能力。實驗分為兩組：一組小室預先涂布Matrigel基質膠，另一組不涂布。細胞轉染48小時后，用無血清培養基對AML細胞進行饑餓處理，隨后將細胞接種至Transwell小室的上腔（預先涂布或未涂布Matrigel）。下腔加入600μL 含 10% 胎牛血清（FBS）的RPMI1640培養基。培養48小時后，移除上腔中未遷移的細胞。用 4% 甲醛固定遷移至膜下表面的細胞，并用 0.1% 結晶紫染色10分鐘。最后，使用Nikon倒置顯微鏡（日本）在五個隨機視野中計數遷移和侵襲的細胞數量。

1.9統計學方法采用SPSS29.0統計分析軟件進行數據處理，利用GraphPadPrism6.0軟件對試驗數據進行可視化呈現。計量資料符合正態分布，以均數 標準差 表示，組間比較采用獨立樣本 χ_t 檢驗；計數資料以頻數 （n） 表示，組間比較采用 χ² 檢驗，相關性分析采用Pearson相關分析，檢驗水準：α=0.05 ，雙側檢驗。

2結果

2.1兩組患者circ-SFMBT2、miR-491-5p、HOXA9表達的比較通過RT-qPCR 檢測兩組患者骨髓中circ-SFMBT2、miR-491-5p和HOXA9的表達水平。分析結果顯示，與對照組相比，AML患者中circSFMBT2和HOXA9的表達顯著升高，而miR-491-5p的表達則顯著降低（表2），提示AML可能促進circ-SFMBT2和HOXA9的表達，同時抑制miR-491-5p的表達。進一步分析AML 患者中circ-SFMBT2、miR-491-5p和HOXA9表達的相關性，結果顯示：miR-491-5p與circ-SFMBT2之間存在顯著的負相關關系（ r=-0 .956， Plt;0. 001 ）（圖1A）;miR-491-5p與HOXA9表達也呈現顯著的負相關關系（ r=-0.977 ，Plt;0.001 ）（圖1B）;而circ-SFMBT2與HOXA9的表達則存在顯著的正相關關系（ r=0.977 ， Plt;0.001 ））（圖1C）。結果提示circ-SFMBT2、miR-491-5p和HOXA9之間可能存在協同調控關系。

2.2circ-SFMBT2對miR-491-5p和HOXA9的調控作用在 si-circ-SFMBT2干擾后，circ-SFMBT2 和HOXA9的mRNA表達水平顯著降低，而miR-491-5p則顯著上調。此外，抑制miR-491-5p可上調HOXA9的mRNA表達水平，同時下調miR-491-5p自身的表達（圖2A-C）。這些結果表明，circ-SFMBT2位于miR-491-5p上游，并負調控其表達水平；而miR-491-5p則位于HOXA9上游，負調控HOXA9的表達。

2.3沉默circ-SFMBT2對AML細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響通過分析沉默circ-SFMBT2對細胞功能的影響，研究發現si-circ-SFMBT2干擾可顯著降低AML細胞的增殖、遷移及侵襲能力，同時顯著提高細胞凋亡率。此外，抑制miR-491-5p能夠促進AML細胞的增殖、遷移和侵襲能力，并減少細胞凋亡（圖3A-D）。這些結果表明，circ-SFMBT2通過調控miR-491-5p對AML細胞活力產生顯著影響。

表2兩組患者骨髓中circ-SFMBT2、miR-491-5p和HOXA9表達的比較

注：A為circ-SFMBT2與miR-491-5p的相關性分析；B為HOXA9與miR-491-5p的相關性分析；C為HOXA9與circ-SFMBT2的相關性分析

圖1AML患者中circ-SFMBT2、miR-491-5p和HOXA9表達水平的相關性

圖2沉默circ-SFMBT2對miR-491-5p、HOXA9的調控作用

注：A為通過RT-qPCR檢測circ-SFMBT2水平;B為通過RT-qPCR檢測miR-491-5p水平;C為通過RT-qPCR檢測HOXA9水平。各組對比，ns表示 Pgt;0.05 表示si-circ-SFMBT2組vs對照siRNA組， Plt;0.05 #表示si-circ-SFMBT2+miR-491-5p抑制劑組vssi-circ-SFMBT2組， Plt;0.05

注：A為通過MTT檢測細胞存活率;B為通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率；C、D為通過Transwell小室檢測細胞遷移和侵襲能力。各組對比，ns表示 Pgt;0.05 ： * 表示si-circ-SFMBT2組vs對照siRNA組，Plt;0.05 ;#表示si-circ-SFMBT2+miR-491-5p抑制劑組vssi-circ-SFMBT2組， Plt;0.05 圖3沉默 -SFMBT2對AML細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

3討論

AML是一類具有高度異質性和侵襲性的疾病。盡管近年來關于AML的病理學研究取得了顯著進展，但其預后差和耐藥等問題依然存在[15-17]。目前，AML的復雜發病機制尚未完全闡明。因此，深人研究AML發生發展的分子機制，并探索新的藥物靶點及治療方案具有重要意義。

本研究通過比較AML患者與良性貧血患者的circ-SFMBT2miR-491-5p和HOXA9表達水平，探討這些分子在AML中的表達特征及其生物學功能。結果顯示，AML患者中circ-SFMBT2和HOXA9的表達水平顯著升高，而miR-491-5p的表達水平顯著降低。進一步分析表明，miR-491-5p與circ-SFMBT2、miR-491-5p與HOXA9之間均存在顯著的負相關關系，而circ-SFMBT2與HOXA9之間則存在顯著的正相關關系。這些結果表明，circ-SFMBT2、miR-491-5p和HOXA9之間存在協同作用，提示它們在AML的發生發展中可能發揮重要作用。

circ-SFMBT2作為一種新近發現的環狀RNA，在AML中呈高表達，提示其可能是AML的重要生物標志物[18]。已有研究報道，circ-SFMBT2在AML中的表達顯著升高，并且與AML患者的預后不良相關[12]。本研究通過沉默circ-SFMBT2，觀察到AML細胞的存活率、遷移能力和侵襲能力顯著降低，而細胞凋亡率顯著增加。這一發現進一步支持了circ-SFMBT2在AML細胞生物學功能中的關鍵作用。

miR-491-5p作為一種小RNA分子，其表達水平在AML患者中顯著降低，提示其可能發揮抑癌作用。已有研究報道miR-491-5p在多種癌癥中具有抑癌功能[19-20]。我們的研究顯示，沉默 circ-SFMBT2可以顯著提高miR-491-5p的表達水平，而使用miR-491-5p抑制劑則可以逆轉這一效果。有研究表明，circRNA能夠在AML中充當miRNA海綿[21]。這表明，circ-SFMBT2通過“海綿”效應調控miR-491-5p的表達，進而影響下游基因的調控。miR-491-5p已被證明可以靶向HOXA9，并通過下調HOXA9表達抑制AML發展[22]，進一步支持了circ-SFMBT2-miR-491-5p-HOXA9軸的存在及其在AML中的作用機制。

HOXA9基因是一個重要的轉錄因子，與AML的發生和發展密切相關[13]。已有研究表明，HOXA9的異常表達與AML的不良預后相關[23]。本研究發現，AML組中HOXA9的表達水平顯著高于對照組，且與circ-SFMBT2的表達水平呈正相關。沉默circ-SFMBT2可顯著降低HOXA9的表達水平，而使用miR-491-5p抑制劑則能恢復HOXA9的表達水平。這些結果進一步證實了circ-SFMBT2通過miR-491-5p調控HOXA9的表達，從而影響AML細胞的功能。

盡管本研究為circ-SFMBT2在AML中的作用機制提供了有力證據，但仍存在一些局限性。首先，本研究的樣本量較小，需要更大規模的隊列研究來驗證這些發現的普遍性和可靠性。其次，本研究主要基于體外細胞實驗，缺乏體內動物模型的數據支持。未來的研究應進一步探討circ-SFMBT2在AML患者中的臨床應用價值，并在體內模型中驗證其作用機制。最后，circ-SFMBT2的具體調控機制仍需進一步闡明，特別是其與其他信號通路之間的相互作用。

綜上所述，circ-SFMBT2在AML中的高表達可能通過調控miR-491-5p的表達，進而影響HOXA9的表達水平，促進AML細胞的增殖、遷移和侵襲。這些發現為深入了解AML的發病機制提供了新的線索，并為AML的診斷和治療提供了新的靶點。未來的研究可以進一步驗證circ-SFMBT2-miR-491-5p-HOXA9軸在AML中的具體作用機制，并探索其在臨床應用中的潛力。

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（收稿日期：2024-12-05修回日期：2025-03-07）（編輯：梁明佩）