基于蛋白質組學技術分析腹部推拿對失眠大鼠下丘腦的影響研究

【摘要】背景失眠是一種常見的睡眠障礙，嚴重影響患者的生活質量和身心健康。腹部推拿作為一種非藥物療法，因其在治療失眠方面療效確切且安全、無明顯不良反應，逐漸受到關注，但其治療失眠的具體機制尚不明確。目的通過蛋白質組學分析，闡述腹部推拿治療后對對氯苯丙氨酸（PCPA）失眠模型大鼠下丘腦蛋白的差異表達，結合行為學分析，探討腹部推拿治療失眠的作用機制。方法2022年3—5月，取健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠18只，體質量（ 225±5 ） g 將 SD大鼠隨機分為空白組、模型組和治療組，每組6只。通過腹腔注射PCPA法建立大鼠失眠模型，空白組、模型組不做治療，治療組行腹部推拿，1次 /d ， 12min/ 次，連續 ^7d 。觀察記錄各組大鼠行為狀態，采用蛋白組學技術鑒定各組大鼠下丘腦差異蛋白表達情況，運用生物學信息進行差異蛋白基因本體論（GO）功能注釋和KEGG富集分析，通過Westemblotting法驗證相關差異蛋白。結果造模后 24h 對大鼠進行戊巴比妥鈉翻正反射實驗，結果顯示，模型組、治療組與空白組相比，潛睡眠時間延長、睡眠持續時間縮短（ Plt;0.05 ），提示造模成功。治療7d后，行為學結果顯示，與空白組相比，模型組體質量下降、自發舉爪次數增加、大鼠尋找平臺的時間增加（ Plt;0.05 ）；與模型組比較，治療組體質量增加、自發舉爪次數減少、大鼠尋找平臺的時間縮短（ Plt;0.05 ）。蛋白組學分析結果顯示，與失眠關系密切的早老素-1（Psen1）和肌酸激酶（ Ckm ）造模后升高，治療后降低（ Plt;0.05 ）； γ- 氨基丁酸受體亞基 α-5 （Gabra5）和組蛋白去乙?；?（Hdac4）在造模后降低（ Plt;0.05 ），治療后升高（ Plt;0.05 ）。GO和KEGG通路富集分析發現差異表達蛋白主要參與蛋白激活級聯、能量代謝、炎癥反應、橫紋肌組織發育等生物過程，神經活性配體－受體相互作用、造血細胞譜系是腹部推拿治療作用的主要信號通路。對這以上4種蛋白進行 Westem bloting法驗證，其中3種物質（Psen1、Ckm和Gabra5）顯示出與質譜顯示的趨勢一致。結論經行為學結果及蛋白組學結果分析表明，腹部推拿可有效改善SD大鼠失眠癥狀，通過神經活性配體-受體相互作用、造血細胞譜系通路發揮作用，Psenl、Ckm、Gabra5為可能的關鍵蛋白，為腹部推拿治療失眠提供了基礎性依據。

【中圖分類號】 R741 R277.7 【文獻標識碼】 AD0I：10.12114/j.issn.1007-9572.2024.0424

失眠是臨床常見疾病，通常由多種因素引起，并對精神和軀體造成損害[1]，成年人中約有 30% 曾有短暫性失眠，10%～15%的人長期受到慢性失眠的困擾［2]藥物治療失眠的成癮性是臨床中的重要問題[3]，推拿療法是一種安全可靠、無不良反應且舒適度高的外治療法，但目前缺乏足夠的高質量科學證據來支持其作為治療失眠的有效補充替代療法。因此，利用推拿手法治療慢性失眠并開展其作用機制的研究是當前推拿專業面臨的重要任務［4] O

蛋白質組學是一種能夠在蛋白質水平上理解疾病發展變化的技術，有助于揭示疾病發生和治愈的機制，對于發現疾病的關鍵致病物質和有可能治愈的靶點具有重要作用[5]。課題組前期研究顯示，下丘腦可能是失眠形成和發展的關鍵部位和治療靶點[6]；且腹部推拿治療失眠臨床療效確切，但尚缺少機制分析。所以本研究以下丘腦為主要研究部位，通過蛋白組學技術觀察腹部推拿治療后對氯苯丙氨酸（para-chlorophenylalanine，PCPA）失眠大鼠下丘腦蛋白組學活性變化，從而探討腹部推拿治療失眠的作用機制。

1材料與方法

1.1一般材料

2022年3—5月，取健康雄性Sprague-Dawley大鼠18只，體質量（ 225±5 ） g ，從長春億斯實驗動物技術公司購入［許可證號：SCXK（吉）-2018-0007］。本研究方案經長春中醫藥大學實驗動物福利專業委員會批準（2020346），嚴格遵守動物實驗倫理要求。動物實驗在長春中醫藥大學動物實驗中心完成。飼養條件為控制條件［溫度 23°C ，濕度（ 55±10 ） % ， 12h/12h 明暗循環，大鼠自由進食、飲水]。研究前，大鼠適應1周的新環境。隨機分為空白組、模型組和治療組，每組6只大鼠。

1.2主要儀器及試劑

Morris水迷宮視頻分析系統TrackingMaster V3.0DL-4-Chlorophenylalanine 98% （C9H10CINO2199.6，CAS：7424-00-2），蛋白酶抑制劑混合物（MerckMillipore），Trypsin（Promega），磷酸酶抑制劑（Millipore），碘乙酰胺，IAM（Sigma-Aldrich），甲酸（Fluka），尿素（Sigma-Aldrich），甲醇（ThermoFisherScientific），二甲苯（SangonBiotech），DNA提取試劑盒（Solarbio），二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）銀染試劑盒（Solarbio），甘油（SangonBiotechO），蛋白質標記物（Thermoscientific），奶粉（Amresco）。

1.3實驗方法

1.3.1PCPA大鼠模型制備。采用PCPA方法造模。按400mg/kg 稱取PCPA粉末，少量緩慢加入 0.9% 氯化鈉溶液并研磨至泡沫狀，加入 10% 阿拉伯膠攪拌。同時配制 5% 碳酸氫鈉溶液，在 0.9% 氯化鈉溶液中加入碳酸氫鈉溶液（溫度 10^°C～40^°C 為宜），調節 pH 值為7～8。在研磨后的PCPA中加入調節好 pH 值的碳酸氫鈉溶液，定容而成PCPA混濁液，用超聲機超聲 15min 。給予模型組、治療組大鼠腹腔注射PCPA混濁液，空白組注射等量 0.9% 氯化鈉溶液，每日于8：00注射1次，連續注射 2d 。大鼠在注射 36h 后出現晝夜節律紊亂。空白、模型、治療組大鼠在末次注射后 24h 腹腔注射戊巴比妥鈉（ 35mg/kg ），檢測翻正反射，觀察麻醉后大鼠進入睡眠需要的時間和睡眠持續的時間，判斷大鼠失眠程度[7]。具體操作為：提起鼠尾以大鼠不能翻正為標準，記錄從注射結束到不能翻正的潛睡眠時間，以及不能翻正到蘇醒后可以翻正的睡眠持續時間。將模型組與空白組進行對比，若差異有統計學意義，則為造模成功。

1.3.2各組干預方法?？瞻捉M不造模，不治療；模型組只造模，不治療，造模成功后正常飼養 7d 。造模成功24h 后，治療組通過振腹環揉推拿療法進行治療，即在腹部施以振動和環揉兩種操作。為保證操作標準，使用振動頻率相同、重量均勻的穴位振動按摩器對大鼠進行腹部推拿。將振動按摩器的尖端垂直置于大鼠腹部中皖穴 2cm×2cm 處，每次開啟振動到結束用時 2min 隨后僅依靠按摩器的重力向下順時針旋轉15圈（用時2min ）。兩種方法交替3次，總計 12min 。每只大鼠治療1次/d，連續治療7d[8]。

1.3.3 行為學測試

1.3.3.1大鼠自發活動測試。治療7d后對3組大鼠進行自發活動測試，通過行為活動程度測試觀察大鼠神經興奮程度，測試開始前將大鼠置于干凈的鼠籠中適應3min ，然后開始計時，記錄大鼠在 2min 內的前肢舉爪離地次數，作為自發活動的指標。

1.3.3.2Morris水迷宮測試。治療7d后對3組大鼠進行Morris水迷宮測試，通過Morris水迷宮測試大鼠復雜記憶和空間定向能力，從而判斷失眠對大鼠認知功能的影響。主要實驗裝置由直徑 160cm 的圓筒和圖像采集分析系統組成。水槽內注入適當溫度的清水，四周圍有遮光布，減少外界干擾，利用動物求生本能，尋找隱藏水中的平臺。將大鼠從最遠象限投放水中，記錄在 120s 內尋找平臺所用的時間和路線，并允許停留 15s ，如果在此期間沒有找到站臺則引領其在站臺上站立 15s ，3組大鼠每只分別測試3次，取最優表現記錄。

1.3.4蛋白質組學樣品處理和檢測。將3組大鼠以氣麻儀進行麻醉后，以鑷子尖端夾大鼠四肢無收縮反應為度，確認大鼠處于無痛苦意識狀態，剪開腹腔取血后斷頭處死，在冰上迅速取腦并分離下丘腦，下丘腦組織在預冷的六孔板內投人液氮中速凍，隨即轉移至 -80°C 冰箱內保存。檢測時將下丘腦組織取出研磨為粉，各組樣品分別加入4倍體積裂解緩沖液超聲裂解， 4‰ 條件下以 12 000r/min ，離心 10min ，提取上清液，并用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定酶解，離心后加入胰蛋白酶過夜。加入二硫蘇糖醇、加入碘乙酰胺，室溫避光孵育。肽段經超高效液相系統分離后電離，采用OrbitrapExploris TM480 質譜計進行分析。

1.3.5Westernblotting法驗證。采用Westernblotting法驗證蛋白質組學分析結果。所有大鼠分別剪取下丘腦組織約 0.1g ，加入細胞裂解液 1000μL ，然后離心提取上清液，將蛋白樣品按 1：4 加入蛋白上樣緩沖液，每孔加 10μL 樣品，濃縮膠電壓為 90V 下 30min ，分離膠電壓為 120V 下 ^1h ，當條帶移至底端，停止電泳，轉膜并封閉，參考一抗說明書用 5% （M/V）脫脂奶粉稀釋抗體，按照 1：1 000 的稀釋比例配制一抗稀釋液，室溫下孵育 2h ，加入含聚山梨酯20的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（TBST）洗滌3次， 5min/ 次，參考二抗說明書用 5% （M/V）脫脂奶粉稀釋抗體，按照 1：5000 的稀釋比例配制二抗稀釋液，室溫孵育 1.5h ，然后加人TBST洗滌液，洗滌3次， 5min/ 次，采用ECL發光底物試劑盒檢測蛋白。將蛋白印跡顯影圖掃描。利用ImageJ軟件對條帶灰度值進行分析，目的蛋白表達水平等于目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1.4 統計學方法

采用統計軟件SPSS23.0進行數據分析，符合正態分布的計量資料采用 ）描述，組間比較符合方差齊性檢驗采用單因素方差分析，多重比較采用 LSD-t 檢驗。偏態分布的計量資料采用 M （ P₂₅ ， P₇₅ ）描述，進行非參數檢驗。差異蛋白表達量變化超過1.5倍和lt;1/1.5 作為顯著上調和下調的變化閾值。篩選出的差異蛋白采用基因本體論（GeneOntology，GO）、京都基因與基因組百科全書（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）通路進行功能注釋、富集和聚類分析，根據蛋白序列，通過String蛋白網絡互作數據庫觀察差異蛋白互作關系。以 Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1PCPA大鼠模型制備

造模后 24h ，分別對空白組、模型組和治療組大鼠進行戊巴比妥鈉翻正反射實驗檢測，結果顯示，3組大鼠的潛睡眠時間和睡眠持續時間比較，差異均有統計學意義（ Plt;0.05 ）；其中模型組、治療組與空白組相比，潛睡眠時間延長，睡眠持續時間縮短，差異均有統計學意義（ Plt;0.05 ），見表1。結果提示，本研究大鼠均造模成功。

表1造模后戊巴比妥鈉翻正反射實驗測試結果（ ，min） Table1Test results of sodium pentobarbital after molding

注：“表示與空白組比較 Plt;0.05_?lt;

2.2失眠大鼠模型行為學測試結果

治療7d后，對各組大鼠進行自發活動測試、水迷宮測試和體質量測量。結果顯示，3組大鼠的自發活動測試、水迷宮測試和體質量測量比較，差異均有統計學意義（ Plt;0.05 ）；其中自發舉爪次數試驗顯示，模型組與空白組比較，自發舉爪次數增加，差異均有統計學意義（ Plt;0.05 ）。治療組與模型組比較，自發舉爪次數減少，差異均有統計學意義（ Plt;0.05 ）；水迷宮測試結果顯示，模型組與空白組比較，大鼠尋找平臺的時間增加，差異均有統計學意義（ Plt;0.05 ），治療組與模型組比較，大鼠尋找平臺的時間縮短差異均有統計學意義（ Plt;0.05 ），見圖1。

造模后體質量測試結果顯示，模型組與空白組比較，體質量下降，差異均有統計學意義（ Plt;0.05 ）；治療組與模型組比較，體質量升高，差異均有統計學意義（ Plt;0.05. ），見表2。

2.3差異蛋白表達的鑒定

模型組與空白組比較有360個蛋白顯著上調，124個蛋白顯著下降。治療組與模型組比較有105個蛋白顯著上調，58個蛋白顯著下降。其中有17個蛋白與兩組的差異蛋白有交集，上調蛋白有15個（圖2A），下調蛋白有2個（圖2B）。通過查找相關文獻，進一步篩選其中表達差異較大且符合睡眠相關的代表性蛋白質，其中模型組與空白組比較有17個蛋白，包括11個上調蛋白［Prl、Gh1、 S100a9 、早老素-1（Psenl）、肌酸激酶（ Ckm ）、Abl2、 Em14 、Slc1a5、 Hp 、Srsf9、Pold1]，6個下調蛋白［γ-氨基丁酸受體亞基 α-5 （Gabra5）、Dbndd2、Tnfaip8、組蛋白去乙酰化酶4（Hdac4）、Prep」，見表3、圖2C。治療組與模型組比較有10個蛋白，包括7個上調蛋白（Gabra5、Rbm5、Sncb、Slc35b2、Cdh18、Atp5if1、Hdac4），3個下調蛋白[ Ckm 、Psen1、Fbln5」，見表4、圖 2D 。

S LA注：A為空白組大鼠尋找平臺軌跡熱圖，B為模型組大鼠尋找平臺軌跡熱圖，C為治療組大鼠尋找平臺軌跡熱圖。

表2治療后各組大鼠行為學測試及體質量變化結果 ））

Table2 Results of behavioral test and weight change of rats in each group after treatment

注：“表示與空白組比較 Plt;0.05 ，表示與模型組比較 Plt;0.05， 0

蛋白表達定量分析顯示，蛋白中符合治療變化規律的主要有Psen1、Gabra5、Hdac4、 Ckm 。模型組與空白組相比，Psen1、 Ckm 表達升高，Gabra5、Hdac4表達降低，差異有統計學意義（ Plt;0.05 ）；經過7d治療后，治療組與模型組相比，Psen1、Ckm表達降低，Gabra5、Hdac4表達升高，差異有統計學意義（ Plt;0.05 ），見表5。

2.4差異表達蛋白GO注釋

將篩選的差異表達蛋白從細胞組分（cellularcomponent，CC）、分子功能（molecularfunction，MF）和生物過程（biologicalprocess，BP）3個層面進行GO功能注釋，模型組/空白組的上調蛋白主要分布于細胞外空間，MF主要集中于蛋白質二硫異構酶活性，參與蛋白激活級聯生物過程（圖3A）；下調蛋白主要分布于核內體膜的外來成分，MF主要集中于堿金屬離子結合，參與線粒體組織的調節過程（圖3B）。治療組/模型組的上調蛋白主要分布于高爾基膜的組成部分中，MF集中于銅離子結合，參與β-聯蛋白/TCF復合物調節（圖3C）；下調蛋白主要是超分子復合物，MF主要集中于激素活性，參與橫紋肌組織發育等生物過程（圖3D）。

2.5差異表達蛋白KEGG通路富集分析

將差異表達蛋白與KEGG數據庫進行對比分析，結果顯示，與對照組相比，模型組上調信號通路主要為補體和凝血級聯（ rno04610 Complement andcoagulationcascades）、內質網的蛋白質加工（ rno04l4lProtein processing in endoplasmic reticulum）、蛋白質輸出（ rno03060 Proteinexport）等（圖4A）；下調的信號通路主要為線粒體自噬通路（ rno04137 Mitophagy-animal）、癌癥微型核糖核酸通路（ rno05206 MicroRNAsincancer）等（圖4B）；與模型組相比，治療組上調信號通路主要為神經活性配體-受體相互作用（ rno04080 Neuroactive ligand-receptor interaction）、造血細胞譜系（ rno04640 Hematopoietic cell lineage）等（圖4C），下調的信號通路主要為 Wnt 信號通路（ rno04310 Wnt signalingpathway）、PI3K-Akt信號通路（ rno04l51 PI3K-Akt signaling pathway）等（圖4D）。

表4治療組和模型組失眠大鼠下丘腦差異蛋白表達差異

表3模型組和空白組失眠大鼠下丘腦差異蛋白表達差異 Table3Difsiexpresalpoesosofstsoodeioddgo

Table4ifciotcdetialpoteexpsfoaatsforeeantitgoddeop

表53組大鼠Psenl、Ckm、Gabra5和Hdac4蛋白質表達水平測定 ）Table 5Determination of protein expression levels of Psen1，Ckm，Gabra5 and Hda（

注：“表示與空白組比較 Plt;0.05 ，表示與模型組比較 Plt;0.05 。

圖23組大鼠差異蛋白venn圖、火山圖 Figure2Venn diagram and volcano plot of differential proteins in3 groups of rats

注：A為模型組與空白組、治療組與模型組上調差異表達蛋白 τ_venn 圖，B為模型組與空白組、治療組與模型組下調差異表達蛋白 τ_venn 圖，C 為模型組與空白組差異蛋白火山圖，D為治療組與模型組差異蛋白火山圖。

2.6 蛋白互作網絡分析

將治療組/模型組中顯著差異表達的蛋白序列與STRING蛋白網絡互作數據庫進行對比分析，結果顯示，上調蛋白中D3ZZT9、A0A1W2Q690相互作用的蛋白較多，下調蛋白中F1MQ63、Q923Z2相互作用的蛋白較多（圖5）。

圖5蛋白互作網絡分析Figure5Protein interaction network analysis

注：A為模型組/空白組上調差異蛋白信號通路富集分析，B為模型組/空白組下調差異蛋白信號通路富集分析，C為治療組/模型組上調差異蛋白信號通路富集分析，D為治療組/模型組下調差異蛋白信號通路富集分析。

圖4差異蛋白表達KEGG通路富集分析氣泡圖

Figure 4 Bubble chart of KEGG pathway enrichment analysis for differential protein

2.7 Westernblotting法結果

Westernblotting法檢測結果顯示：模型組與空白組比較，大鼠腦組織中Psen1蛋白表達升高，差異有統計學意義（ Plt;0.05 ）；治療組與模型組比較，大鼠腦組織中Psen1蛋白表達降低，差異有統計學意義（ Plt;0.05 ）。模型組與空白組比較，大鼠腦組織中 Ckm 蛋白表達升高，差異有統計學意義（ Plt;0.05 ）；治療組與模型組比較，大鼠腦組織中 Ckm 蛋白表達降低，差異有統計學意義（ Plt;0.05 ）。模型組與空白組比較，大鼠腦組織中Gabra5蛋白表達降低，差異有統計學意義（ Plt;0.05 ）；治療組與模型組比較，大鼠腦組織中Gabra5蛋白表達升高，差異有統計學意義（ Plt;0.05 ）；模型組與空白組比較，大鼠腦組織中Hdac4蛋白表達水平降低，差異有統計學意義（ Plt;0.05 ）；治療組與模型組比較，大鼠腦組織中Hdac4蛋白表達水平升高，差異有統計學意義（ Plt;0.05 ）。通過Westernblotting法驗證蛋白質組學分析的數據，結果顯示4種被檢測的蛋白中有3種蛋白（Psen1、Ckm和Gabra5）的趨勢與質譜分析一致，見圖6、表 6

3討論

失眠嚴重威脅人體健康，不僅會引起疲勞、精神狀態不佳等癥狀，還會對機體器官功能產生影響。研究表明，失眠與胃腸道疾病密切相關[9]，并且腦腸理論越來越受到臨床和科研人員的重視。本研究以腦腸相互作用理論為基礎，通過腹部振動和腹部環揉治療失眠。既往臨床研究證實了腹部推拿治療失眠的有效性和存在腦腸互動效應，且與下丘腦密切相關[6]。在動物實驗中可觀察到PCPA失眠模型大鼠的胃腸道內積累了大量糞便，且體質量減輕。在對失眠大鼠進行腹部推拿治療期間，動物持續大量排泄糞便，脫毛減少[10]。基于既往研究成果，需要明確失眠大鼠在造模后下丘腦表達變化，以及經腹部推拿治療癥狀減輕后下丘腦蛋白表達變化，并確定這些蛋白之間的相互作用。因此，本研究采用蛋白質組學技術分析腹部推拿治療失眠大鼠下丘腦中差異蛋白表達的變化。

本研究采用戊巴比妥鈉翻正反射實驗、大鼠自發舉爪活動實驗、Morris水迷宮和體質量分析進行行為學評價。戊巴比妥鈉翻正反射實驗結果顯示造模后大鼠潛睡眠時間延長，睡眠持續時間縮短，則證明模型成功。在通過腹部推拿治療7d后，在自發活動測試中，模型組大鼠自發舉爪次數多于空白組，治療組大鼠自發舉爪次數少于模型組，說明腹部推拿治療能夠降低大鼠神經興奮程度。Morris水迷宮實驗顯示，模型組大鼠尋找平臺的時間長于空白組，而治療組大鼠尋找平臺的時間少于模型組，說明腹部推拿治療能改善大鼠記憶和空間定向。此外各組大鼠體質量隨飼喂量的增加而增加，其中模型組體質量增加顯著低于空白組，治療組體質量增加高于模型組。綜上所述，失眠大鼠模型造模成功以及腹部推拿治療具有有效性，能夠開展對下丘腦蛋白質組學的檢測和分析。

注： Psen1= 早老素 ^-1 ， Ckm= 肌酸激酶， Gabra5=γ -氨基丁酸受體亞基 α-5 ， Hdac4= 組蛋白去乙酰化酶4圖63組大鼠腦組織內 Psen1 ！ Ckm 、Gabra5和Hdac4蛋白表達水平電泳圖Figure6Electrophoretogram ofPsen1， Ckm ，Gabra5，andHdac4protein expression levelsin brain tissues of 3 groups of rats

表63組大鼠Psen1、Ckm、Gabra5和Hdac4蛋白質表達水平（ ）Table6Protein expression levels of Psenl， Ckm ，Gabra5and Hdac4of3 groups of rats

注： Psen1= 早老素 ^-1 ， Ckm= 肌酸激酶， Gabra5=γ- 氨基丁酸受體亞基 α_α-5 ，Hdac4組蛋白去乙?；?；‘表示與空白組比較Plt;0.05 ，表示與模型組比較 Plt;0.05 。

本研究應用定量蛋白質組學技術分析腹部推拿治療后PCPA失眠模型大鼠下丘腦蛋白表達水平的變化，通過生物信息學技術分析腹部推拿改善大鼠失眠的潛在作用機制[]，發現造模后，模型組和空白組之間差異蛋白共484種，其中與睡眠相關蛋白17種。治療組和模型組相比，有163種差異蛋白，其中10種與睡眠關系密切。對比3組差異蛋白后發現，造模后Psen1和Ckm上調，腹部推拿后下調；Gabra5和Hdac4在造模后下調，腹部推拿后顯著上調。

進一步對所有差異蛋白進行GO注釋，結果發現這些差異表達蛋白主要參與蛋白激活級聯、能量代謝、炎癥反應、橫紋肌組織發育等生物過程，說明腹部推拿能夠通過調控多靶點、多種生物過程發揮治療效用。Psen1通常被認為與早老性癡呆有關，其前gerin基因缺乏會導致神經前體細胞數量的減少[12]，Psenl通過基因突變會影響 γ- 分泌酶的活性或選擇性，導致 Aβ 肽的產量或毒性增加，從而引發神經系統病變，所以其變化通常被認為是阿爾茨海默病、睡眠障礙等神經系統疾病的重要靶點[13]。 Ckm 分布于細胞質中，與能量代謝有關，也被證明會影響神經功能，過度疲勞、熬夜通常會導致Ckm升高，相關研究不僅發現睡眠剝奪后大鼠心肌細胞受損，而且與對照組相比，功能形態改變，Ckm升高，這與下丘腦內Ckm表達的趨勢一致。同時，與 Ckm 相關的阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征的研究也證明了這一現象［14］。Gabra5參與 γ- 氨基丁酸（GABA）受體基因的表達。GABA受體是神經系統的抑制性神經遞質受體，在大腦中普遍存在，在失眠、癲癇、精神分裂癥和阿爾茨海默病等多種疾病中，GABA受體通常介導喚醒、焦慮、疼痛和記憶等神經功能。下丘腦中有兩個主要系統調節清醒和睡眠。除單胺類組成的激活系統外，抑制系統發源于視交叉腹側核，主要由GABA神經遞質系統組成。GABA的抑制作用是由不同受體介導的，有研究表明，腹腔注射PCPA后下丘腦GABA及GABA受體陽性細胞數量減少，針刺治療后增加[15]，這與Gabra5蛋白定量結果一致。Hdac4主要表達于細胞核，是一種誘導組蛋白去乙?；{節細胞周期、細胞分化和凋亡的酶。有研究報道，kin-29與Hdac4相互作用在細胞核內調節睡眠中起作用［16]。本研究結果提示， kin-29 與感覺神經內分泌細胞核中的Hdac4相互作用將低細胞能量電荷轉化為能量儲存的動員，從而促進睡眠。海馬內Hdac4與睡眠節律和睡眠剝奪有關[17]。下丘腦內蛋白質組學研究結果與相關文獻論述，Psen1、 Ckm 、Gabra5等蛋白驗證與蛋白質組學定量分析趨勢一致，說明腹部推拿治療可能通過調節下丘腦的蛋白質輸出、維生素消化和吸收、神經活性配體－受體相互作用和蛋白質消化與吸收等途徑起作用。

睡眠和覺醒方面具有關鍵作用。既往臨床研究證實腹部推拿治療失眠具有腦腸相互作用，可改善5-HT、P物質、神經肽Y、腦啡肽等腦腸肽的改變。有調查表明，睡眠和清醒期間下丘腦低頻振蕩（LFOs）的變化表明睡眠與下丘腦有關，下丘腦的CRH-HCRT通路在應激性失眠/高喚醒中起作用[18］。此外，GABA在下丘腦。谷氨酸（Glu）可以調節睡眠相關神經元的興奮和抑制[19-20]。隨著生物醫學的逐漸發展，在下丘腦中已經發現了5-HT、GABA、Glu、CRH及其受體等許多物質與睡眠有關，但這還不夠充分，其他與睡眠有關的蛋白質和物質仍未發現。Psen1在前腦巨噬細胞神經元和腦干中表達，尤其在Notch信號通路中起激活作用，具有調節質膜黏附的功能，對神經功能的發育和維持具有重要作用[21]。

組間差異蛋白KEGG通路分析，發現腹部推拿調控失眠大鼠的過程主要涉及神經活性配體-受體相互作用、造血細胞譜系等信號通路。研究顯示，神經活性配體－受體相互作用在睡眠調節中起重要作用［22]，可能通過調節中樞杏仁核中差異表達蛋白的數量進而調節失眠，5-HT作為調節睡眠節律的重要神經遞質以及抑醒／促眠的重要物質在此通路中發揮了關鍵作用［23]，可進一步通過腦-腸互動參與胃腸運動、大腦活動、黏膜炎癥及免疫反應等，不僅影響睡眠，還與焦慮、抑郁等密切相關[24]。腹部推拿通過造血細胞譜系通路改善失眠，可能通過干細胞的自我更新和分化能力來修復受損的神經組織，促進分泌多種生長因子和神經營養因子。造血細胞譜系通路紊亂會改變造血干細胞的表觀基因組，并促進其向髓系細胞分化，導致造血干細胞功能異常，降低其自我更新和分化能力，影響造血和免疫系統短時間內快速識別和殺死人侵細菌的功能，引發或加劇炎癥反應，進而影響睡眠質量[25]。以上結果綜合表明腹部推拿可顯著作用于神經活性配體-受體相互作用、造血細胞譜系等信號通路實現對睡眠的調節作用，其具體的調控機制有待進一步深入研究，這也為未來研究的重點和目標提供了思路。

盡管本研究為腹部推拿改善失眠提供了有力的實驗依據，但仍存在一定局限性：本研究中Hdac4蛋白的Westernblotting法驗證與蛋白質組學定量分析趨勢出現差異，考慮原因可能與數據分析方法、技術原理差異有關，未來還需通過優化樣品處理，改進數據分析方法等進一步對Hdac4蛋白進行驗證與分析；其次，本研究樣本量較小，不足以完全覆蓋所有可能的生物變異性和個體差異，且生物通路存在復雜性和交互性，本研究發現的差異表達蛋白可能僅涉及部分已知的通路機制，而更多未知的、未被充分挖掘的通路可能也在推拿治療失眠的過程中發揮重要作用。在未來的研究中，有待擴大樣本量，結合多組學技術如轉錄組學、代謝組學等，進行更為全面和深入的分析，以便更全面地揭示腹部推拿對失眠大鼠下丘腦的影響及其潛在機制。

4結論

綜上所述，腹部推拿能夠通過調節失眠相關途徑中的蛋白質來改善失眠癥狀，并與Psen1、Ckm、Gabra5蛋白的調控密切相關，且神經活性配體-受體相互作用、造血細胞譜系是腹部推拿治療作用的主要信號通路，為腹部推拿治療失眠提供了重要的依據。

作者貢獻：張紅石進行研究的構思與設計及可行性分析、設計研究方案，后期數據收集整理、統計分析并撰寫論文；曲子涵、孫雪峰參與設計研究方案，進行動物造模、實驗干預、數據收集整理及統計分析；王宇峰進行論文及英文的修訂；叢德毓、張野負責文章的質量控制及審校，對文章整理負責，監督管理。

本文無利益沖突。

參考文獻

[1] GERLACHF，EHRING T，WERNER GG，et al. Insomnia-relatedinterpretational bias is associated with pre-sleep worry［J].JSleepRes，2020，29（1）：e12938.D0I：10.1111/jsr.12938.

[2]LIU DQ，LI WF，MA C Y，et al.A common hub for sleepand motor control in the substantia nigra[J].Science，2020，367（6476）： 440-445.DOI： 10.1126/science.aaz0956.

[3]ASARNOW L D. Depression and sleep： what has the treatmentresearch revealed and could the HPA axisbe a potentialmechanism？[J].Curr OpinPsychol，2020，34：112-116.DOI：10.1016/j.copsyc.2019.12.002.

[4] CMM A，YI B，CK C，et al. Endorsement of Europeanguideline for the diagnosisand treatment of insomnia by the WorldSleepSociety[J].Sleep medicine，2021：81.DOI：10.1016/j.sleep.2021.01.023.

[5]FRANTZI M，LATOSINSKA A，KONTOSTATHIG，et al.Clinicalproteomics：closing the gap from discovery to implementation[J].Proteomics，2018，18（14）：e1700463.D0I：10.1002/pmic.201700463.

[6］張紅石.基于“腦－腸互動”下的腹部推拿對心脾兩虛型PI的fMRI及BGP影響的研究［D］.長春：長春中醫藥大學，2020.

［7］范英蘭，張宏，甘雨，等.抗失眠中藥復方對KM小鼠戊巴比妥鈉催眠作用影響隨機平行對照研究［J].實用中醫內科雜志，2016，30（9）： 90-94.D0I： 10.13729/j.issn.1671-7813.2016.09.34.

［8］郅曉宇.振腹環揉法治療心脾兩虛型慢性失眠的過度覺醒機制研究［D］.長春：長春中醫藥大學，2023.

［9］嚴開偉，楊潔，梁繁榮.淺議中醫“和胃安神”療法與失眠的關系［J].遼寧中醫雜志，2016，43（11）：2289-2292.DOI：10.13192/j.issn.1000-1719.2016.11.018.

［10］張野.基于腦腸互動理論探討振腹環揉法介導CRH/CRHR1通路治療失眠的代謝機制研究［D］.長春：長春中醫藥大學，2022.

［11］宮莉，康經武.基于化學蛋白質組學的藥物靶標鑒定［J].色譜，2020，38（8）： 877-879.DOI：10.3724/SP.J.1123.2019.12014.

[12] GREENOUGH M A. The role of presenilin in protein traffickinganddegradation-implications formetal homeostasis[J].JMolNeurosci，2016，60（3）：289-297.D01：10.1007/s12031-016-0826-4.

「13]改音干DS1DSAD和DR6的相萬聯系保講細胞調廣的機制研

究［D］.長春：吉林大學，2020.

[14］周多奇，龔莉，錢振宇.肌酸激酶的生理功能與運動[J].安慶師范學院學報（自然科學版），2016，22（3）：113-118.DOI：10.13757/j.cnki.cn34-1150/n.2016.03.029.

［15］周艷麗，高希言，王培育，等.針刺不同腧穴對失眠大鼠下丘腦 γ -氨基丁酸和 γ -氨基丁酸A受體的影響［J].針刺研究，2012，37（4）：302-307.D0I： 10.13702/j.1000-0607.2012.04.010.

[16]GRUBBSJJ，LOPESLE，VANDERLINDENAM，etal.Asalt-inducedkinaseisrequired forthemetabolicregulationofsleep[J].PLoSBiol，2020，18（4）：e3000220.DOI：10.1371/journal.pbio.3000220.

[17]FUJII S，EMERY P，AMREIN H. SIK3-HDAC4 signalingregulates Drosophila circadianmale sex drive rhythm via modulatingtheDN1clock neurons[J].ProcNatl Acad SciUSA，2017，114（32）：E6669-6677.DOI： 10.1073/pnas.1620483114.

[18]LISB，BORNIGERJC，YAMAGUCHIH，etal.Hypothalamiccircuitryunderlyingstress-induced insomniaand peripheralimmunosuppression［J].SciAdv，2020，6（37）：eabc2590.DOI：10.1126/sciadv.abc2590.

［19］林炳岐，李峰，馬捷，等.基于GABA能系統通路探討失眠的機制［J].現代生物醫學進展，2018，18（3）：565-568.DOI： 10.13241/j.cnki.pmb.2018.03.037.

［20］曾雪愛，黃俊山，周春權，等.松郁安神方對失眠大鼠腦組織氨基酸類神經遞質的影響［J].福建醫藥雜志，2015，37（5）：1-3，23.D01：10.20148/j.fmj.2015.05.001.

[21]胡沿每，劉子重，郭美娜，等.早老素Ps1突變基因對阿爾茨海默病模型鼠表觀有效性的影響［J].中國藥理學通報，2020，36（8）：1076-1083.D0I：10.3969/i.issn.1001-1978.2020.08.009.

[22]解俊樊.神經肽S及受體系統抗焦慮樣行為與睡眠的作用和機制［D］.蘭州：蘭州大學，2017.

[23]MIYAGISHIH，TSUJIM，MIYAGAWAK，etal.Possibleroleoftranscriptional regulationof5-HT1A receptorinthemidbrainonunadaptationtostressinmice[J].BrainRes，2O22，1783：147859.DOI： 10.1016/j.brainres.2022.147859.

[24］單貝貝，李娜，劉佳瑋，等.基于網絡藥理學及分子對接技術探討四逆散“異病同治”失眠和功能性胃腸病的共同作用機制［J/OL].環球中醫藥，2024：1-11.[2024-05-28].http：//kns.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx？filename=HQZY20240524001amp;dbname=CJFDamp;dbcode=CJFQ.

[25]PRAMEKUMARK，NICHOLLSAJ，WONGCHY.Partners incrime：neutrophilsand monocytes/macrophagesin inflammationand disease［J].Cell TissueRes，2018，371（3）：551-565.DOI： 10.1007/s00441-017-2753-2.（收稿日期：2024-11-10；修回日期：2025-03-20）（本文編輯：趙躍翠）