支氣管敗血波氏桿菌前噬菌體特征分析

中圖分類號：R446.5 文獻標識碼：A 文章編號：1001-8751（2025）04-0234-10

AnalysisoftheProphage CharacterisationbyBordetella bronchiseptica

Wang Chuan-xu1，YueDong-xue1， Sun Ye-hui1，Cui An-qi1， ZhouLi-sheng1， Liu Wen-hual， Xu Shou-zhen1， Zou Ling1，Ma Jing1， Qu Xue-ting2， Yin Yan-bo2， Zhang Can1 （1 Qingdao Agricultural University，Qingdao 2660oo；2 Qingdao Bolong LaboratoryAnimalCo，Ltd，Qingdao26000）

Abstract： ObjectiveThis study aimed to analyze the prophage in101 strains of Bordetella bronchiseptica（Bb）. MethodsMolecular typing of each Bb strain was carredoutusing theMLSTtool.The prophages in Bb strains were analyzed by the PHASTEST tool. The resistance genes and virulence genes Were analyzed in the CARD or VFDB database.Genomic characterization and evolutionary analysis were conducted for identified prophages.Results The 101 Bb strains were categorized into 37 sequence types （STs）and primarily originate from humans，pigs，and horses in the US， China，Denmark，and Hungary. The genomic length of Bb was concentrated in 4.6～6.0Mb ，and the GC content was 67.5%～69.0% . All of Bb strains carried prophages.A total of 270 prophages were detected， 51 of which were intact prophages. The proportion of prophages in the Bb genome was only 0.1067%～1.069% . The analysis of resistance genes and virulence genes showed that 3O strains of Bb carried9 types of resistance genes，mainly sulfonamide and tetracycline resistance genes.There were two prophages that carried the virulence factor of the type III secretion system （T3SS）.ConclusionProphages，which donotcontribute to the horizontal transferofresistance genes inBb，are frequentlycarriedbyBband may increase the pathogenicityof theBbby making the hostbacterium more virulent.

Key Words： Bordetell bronchiseptica;prophage; drug resistance gene; virulence gene; molecular type; feature analysis

支氣管敗血波氏桿菌（Bordetellabronchiseptica，Bb）是一種具有多形態的革蘭陰性桿菌，屬于β -變形菌綱（Betaproteobacteria）中的波氏桿菌屬（Bordetella）。該菌首次于1910年報道[1]，可引起動物的呼吸道感染，其中豬和貓最易感[2]。在免疫水平較低的豬群中，Bb容易與其他病原體發生混合感染，誘發嚴重疾病。例如，Bb與產毒素多殺巴氏桿菌混合感染，可加重豬萎縮性鼻炎[3]。此外，Bb還可以感染人類，尤其是免疫力低下的兒童和老人[4]。研究表明，Bb攜帶腺苷酸環化酶毒素（CyaA）、絲氨酸蛋白酶（Bsp22）、血紅素結合蛋白（Hbp）等多種毒力因子，通過不同的機制破壞宿主的呼吸道上皮細胞，導致炎癥反應和組織損傷，還可以調節宿主的免疫反應，抑制宿主的免疫細胞功能，從而逃避宿主的免疫監視[5-6]。此外，Bb還可以通過分泌外毒素和內毒素，進一步加重宿主的病理反應7]。

前噬菌體（Prophage）通過質粒的形式或整合的方式在細菌的基因組中廣泛分布，是細菌基因水平轉移的重要載體，與宿主的毒力、生物膜形成和免疫逃避能力等生物學特征的改變和進化密切相關[8]。前噬菌體與宿主菌之間的相互作用是一個復雜的動態過程。溶原狀態下，前噬菌體整合到宿主菌的基因組后長期存活，其基因受宿主菌的基因表達機制調控，進而影響宿主菌的生理功能[9]。當環境條件變化時，細菌的代謝狀態和群體感應能夠調控前噬菌體的溶原-裂解轉換，前噬菌體可以迅速脫離宿主菌基因組，進入裂解周期殺死宿主菌，這種調控機制是維持細菌群體動態平衡的重要因素[10]。大量研究表明，前噬菌體攜帶的耐藥基因可以通過基因水平轉移在細菌群體間傳播，使細菌群體快速獲得耐藥性[11-12]。前噬菌體還可以通過轉導向宿主菌轉移多種毒力因子，增強宿主菌的定植和侵襲能力[13]。其也可以通過群體感應系統影響細菌毒力因子的表達，改變宿主菌的致病力[14]。

前噬菌體在不同細菌群體中的攜帶情況已有報道[15]。有證據表明，在Bb中同樣存在前噬菌體，攜帶毒力基因和耐藥基因，可通過水平轉移增強宿主菌的毒力和耐藥性[16-18]。然而Bb群攜帶前噬菌體情況尚未見報道。本研究對數據庫中101株Bb基因組進行生物信息學分析，明確前噬菌體在Bb基因組的分布情況及特征，以闡明前噬菌體在Bb進化和致病性中的作用。

1材料和方法

1.1Bb的基因組信息采集

從NCBI網站Genome數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/？taxon 1=518 下載已上傳的所有Bb基因組序列共計101株，下載截止時間為2023年12月，對所有菌株的來源地區、宿主來源、基因組大小、鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）含量以組裝完整度等信息進行統計分析。通過MLST工具[19]（https：//pubmlst.org/）對各菌株進行分子分型；通過CARD數據庫（https：//card.mcmaster.ca/）和VFDB數據庫（https：//www.mgc.ac.cn/VFs/）分析各菌株耐藥基因和毒力基因攜帶情況；通過在線網站https：//www.chiplot.online/實現圖形化展示。

1.2 前噬菌體攜帶情況分析

通過在線工具PHASTEST[2o]（https：//phastest.ca/）對下載的101株Bb基因組進行分析，預測前噬菌體攜帶情況。以預測的前噬菌體攜帶編碼序列（CDS）數量以及是否存在噬菌體相關基因作為參數進行打分，根據得分情況判斷每株前噬菌體基因組的完整度，并將其分為三類：完整型（Intact， gt;90 分）、疑似型（Questionable，70～90分）和缺陷型（Incomplete， lt;70 分）。統計每株菌攜帶的前噬菌體的基因組長度和GC% 含量；將預測的前噬菌體序列與GenBank的NR數據庫進行同源性比對（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），根據比對結果中同源性最高的噬菌體分類信息確定前噬菌體的種屬和尾部特征，以同源性最高噬菌體的末端酶大亞基序列為參照，采用鄰接法（Neighbor-Joining）和默認參數構建系統進化樹，確定前噬菌體的種屬信息和進化關系，通過在線網站Chiplot（https：//www.chiplot.online/）進行數據可視化展示。同時對不同菌株攜帶的前噬菌體序列進行同源性比對，當覆蓋率 gt;90% 和同源性 gt;95% 時，認定為相同的前噬菌體[21]。

1.3前噬菌體基因組注釋與分析

選擇各前噬菌體基因組序列，依次使用Pharokka（pypi.org/project/Pharokka/）、Hmmerv3.3.2（http：//hmmer.org/）和HH-suite3（https：//toolkittuebingen.mpg.de/tools/hhpred）工具對其基因組進行功能注釋，當注釋結果不一致時，以Pharokka gt; Hmmer gt; HHpred的注釋結果優先排序，根據注釋結果分析各株前噬菌體可能攜帶的毒力基因和耐藥基因。利用在線網站（http：//rebase.neb.com）對注釋到的甲基轉移酶（Methyltransferase）種類進行分類，對可能攜帶的毒素/抗毒素（Toxin/Antitoxin）系統，以及DNA切割蛋白（DNA scission）進行分析。

2 結果與分析

2.1Bb的分布概況

從Genome數據庫成功下載全部Bb基因組共計101個，包括重疊群（Contig）、支架（Scaffold）、染色體（chromosome）和完整基因組（Complete）四種形式。對其地理分布進行統計，發現菌株主要來源于美國、中國、丹麥和匈牙利四個國家，分別占39.76% ， 27.71% ， 13.25% 和 12.05% 。其余16個菌株分離地域未知（圖1A）。宿主來源包括豬、馬、人類、兔子和火雞等動物，其中以人類、野豬和馬為主要來源，分別占比 26.8% 、 21.65% 和 10.31% 圖1B）。

2.2 Bb基因組特征

101株Bb的基因組大小范圍為 4.6～6.0Mb ，大多數菌株的基因組長度集中在 5.1～5.2Mb （圖2A）。GC含量 67.5%～69.0% ，多數菌株基因組GC含量主要集中在 68.0%～68.5% （圖2B）。

2.3 Bb的分子分型

根據101株Bb的基因組序列利用MLST方法進行分子分型，結果見圖3。圖中所示為菌株之間的進化關系和群體結構，形成了以ST6型和ST33型為中心的若干分支。由圖可知，101株Bb共分為37個ST型，表明其遺傳多樣性較高。其中，ST6型與其他許多的ST型密切相關，是進化過程中一個重要的節點。在各個ST分型中，ST7型最多，占 16.67%（17/101） ；其次為ST31型，占比8.82%（9/101） 。另外，5株Bb屬于未知的ST分型，占比 4.9%（5/101） 。

2.4 Bb的耐藥基因攜帶情況

通過CARD數據庫對Bb攜帶的耐藥基因（ARGs）

圖1101株Bb的分布

A：Bb的地區分布；B：Bb的宿主來源。

圖2101株Bb的基因組信息

圖3Bb的MLST分型

圓圈：ST型；圓圈大小：菌株數量；圓圈之間的連線的長短：分離株間親緣關系的遠近；圓圈連線上的數字：ST分型之間的遺傳距離；圓圈中的數字：菌株在各管家基因位點的等位基因編號；顏色：構成ST分型的等位基因組成。

圖430株Bb的耐藥基因分析

進行預測，結果見圖4。由圖4可知，共有30株Bb基因組檢出耐藥基因，占比 29.7%（30/101） 。這些菌株共攜帶48個耐藥基因，分為9種不同的耐藥類型。耐藥表型以磺胺類（sull、sul2）耐藥最為普遍，占所有耐藥表型的 60%（29/48） 。其次為四環素類[tet（G）] 耐藥。此外，還包括 β. -內酰胺類 （bla_?TEM-229） bla_?TEM-ll6） 、氨基糖苷類 （aph） 、喹諾酮類（floR2）耐藥基因。通過聚類分析得GCF_000690415.1和GCF_000690255.1的耐藥基因特征高度一致，推測兩者有相似的耐藥機制或遺傳背景。基因組GCF000649165.1和GCF_000648965.1的耐藥基因較為相似，可能表現為相似的耐藥表型。

2.5前噬菌體的預測

通過在線工具PHASTEST對101株Bb攜帶的前噬菌體進行預測，結果見圖5。由圖5可知，101株Bb均攜帶前噬菌體，共檢測到270條前噬菌體序列。根據序列完整性，這些前噬菌體可分為三類：51條為完整序列（每株菌0～3條），27條為可疑序列（每株菌0～1條），192條為不完整序列（每株菌0～7條）。從分布情況來看，每株菌攜帶的前噬菌體數量為1～7條，平均每株菌攜帶2條。前噬菌體在宿主基因組中的占比范圍為 0.1067%～1.069% 。其中37株菌攜帶完整的前噬菌體序列，攜帶率為 36.6%（37/101） 。

2.6 前噬菌體基因組特征分析

對預測的前噬菌體基因組進行分析，結果見圖6所示。分析顯示，Bb前噬菌體的基因組長度為0～50kb ，GC含量主要集中在 62%～65% 之間（圖6G和圖6H）。其中，完整型前噬菌體的基因組大小主要為20～50kb ，GC含量同樣集中在 62%～65% 之間（圖6A和圖6B）；疑似型前噬菌體的基因組長度相對較小，主要分布在 10～30kb 范圍內，其GC含量略低，主要集中在 62%～63% 之間（圖6C和圖6D）。缺陷型前噬菌體的基因組長度主要位于 0～30kb ，GC含量主要在63%～65% 之間（圖6E和圖6F）。

對預測的51個完整型前噬菌體做進一步分析?；谌蚪M序列進行同源性比對，根據比對結果構建進化樹。由圖7可知，攜帶這些前噬菌體的宿主菌主要來源于豬（10個）、兔（5個）、犬（1個）和貓（1個）等動物，人源的Bb中也檢測到16個前噬菌體?；蚪M分析顯示，前噬菌體基因組平均長度為 38.7kb ，不同前噬菌體的基因組長度存在較大差異，其中噬菌體AY（ 54.5kb） 最長，噬菌體A （20.1kb） 最短。前噬菌體的平均GC含量為 63.2% ，顯著低于宿主菌Bb的GC含量 （68%） 。平均每個前噬菌體編碼47個蛋白，除AJ、AK和AM三個噬菌體外，其余48個噬菌體均含有未知蛋白。此外，12株前噬菌體攜帶tRNA，結果如圖7所示。地理分布上，美國來源的最多（27個），其次為中國（6個），結果如圖7所示。進化樹分析顯示，有7株噬菌體出現于多個菌株中（7種重復的噬菌體，如H1代表H，I，J3個相同的前噬菌體。），分別為H1（H，I，J）、T2（T，U，V），Q3（Q，R）、M4（M，N）、AB5（AB、AC、AD）、X6（X，Y，Z，AA）和AJ7（AJ，AK）。其中，前噬菌體AJ7不僅出現在豬源Bb，也存在于人源的Bb內。另外，H1、M4和AB5表現出跨地域和跨宿主的傳播特征，而T2、Q3和X6僅存在于美國來源Bb。

2.7前噬菌體的功能基因注釋與分析

51個完整的前噬菌體中存在覆蓋率 gt;90% ，同源性 gt;95% 的相同噬菌體，除去重復的前噬菌體，共計39個不同的前噬菌體。根據39個前噬菌體的注釋信息，將其開放閱讀框（ORF進行功能歸類，發現大多數ORF編碼未知蛋白，已知ORF編碼的蛋白參與前噬菌體的結構組裝和復制轉錄等過程。

圖5 前噬菌體預測

A：不同前噬菌體類型的數目分布情況；B：Bb單個菌株平均攜帶的前噬菌體數目。

圖6前噬菌體基因組特征

A：完整型前噬菌體基因組長度；B：完整型前噬菌體GC含量；C：疑似型前噬菌體基因組長度；D：疑似型前噬菌體GC含量；E：缺陷型前噬菌體基因組長度；F：缺陷型前噬菌體GC含量；G：前噬菌體基因組長度總和；H：前噬菌體GC含量總和。

為了維持自身基因在宿主菌中的穩定性，部分前噬菌體進化出病毒防御蛋白（Viraldefenseprotein）。39個前噬菌體中有26個攜帶了防御蛋白，主要包括DNA-胞嘧啶甲基轉移酶（DNAmethyltransferase，DNMT）和乙?；D移酶（Acetyltransferase，AT）等，這些蛋白可能通過表觀遺傳修飾或蛋白質修飾等方式協助前噬菌體抵御宿主菌的防御系統。此外，在AE前噬菌體的基因組內還發現含有vapE結構域的毒力基因，提示該前噬菌體可能增強宿主菌的致病性。

完整的前噬菌體會攜帶一個裂解組件（Lysiscassette），包括一個編碼裂解素的基因，用以結束噬菌體的裂解循環。在39個前噬菌體中，其中26個前噬菌體預測到裂解組件，其中21個裂解組件內預測到裂解酶（Lysin），結果見圖8。

2.8前噬菌體攜帶耐藥基因和毒力基因的預測通過CARD數據庫未檢測到前噬菌體基因組中攜帶耐藥基因。通過VFDB數據庫對前噬菌體攜帶的毒力基因（VFs）進行預測，發現丹麥馬屬動物來源的波氏桿菌NBRC13691（ZZ_e1d3fbf8f6），攜帶2條前噬菌體，1條為缺陷型，1條為可疑型。兩條前噬菌體基

圖839個前噬菌體的基因組特征

因組內預測到4個毒力基因，編碼波氏桿菌的II型分泌系統（T3SS）毒力因子。

3討論

Bb是一種重要的動物病原菌，廣泛感染多種哺乳動物，引發呼吸道疾病，其致病性與攜帶的毒力因子密切相關[22]。大量研究表明，前噬菌體作為細菌基因組中的重要組成部分，在毒力調控和宿主適應中發揮重要作用[23-24]，然而前噬菌體對Bb的影響尚不明確。因此，本研究對GenBank數據庫中101株Bb的前噬菌體攜帶情況進行了深入分析，明確前噬菌體在Bb基因組中的分布、結構、功能及其對宿主菌致病性的影響。

前噬菌體的跨宿主（如AJ7同時存在于豬源和人源Bb）和跨地域傳播（如H1和M4分布多國）特征，反映噬菌體與宿主的共進化關系[25]。對Bb基因組分析表明，所有Bb均攜帶前噬菌體，平均每株菌攜帶2條前噬菌體，表明前噬菌體在Bb中廣泛存在，在Bb菌群的進化過程中扮演重要的角色。然而，預測到完整型前噬菌體僅占 18.89% ，這可能與選取的Bb基因組的完整性和樣本數量有關[26，也可能受進化壓力的影響，前噬菌體在長期溶原狀態下出現基因缺失現象。其次，前噬菌體對Bb毒力的影響可能涉及對細菌運動性和黏附能力的調控。本研究發現2條前噬菌體攜帶III型分泌系統（T3SS），而T3SS可通過注射效應蛋白干擾宿主細胞信號通路[27]。類似地，噬菌體Morons可編碼黏附素（如入噬菌體Lom蛋白）或通過D3112噬菌體Tip蛋白抑制IV型菌毛組裝，從而平衡噬菌體感染抗性與宿主運動性[28]。此外，前噬菌體可通過群體感應系統（如艱難梭菌前噬菌體phiCDHM1編碼的agr系統）調控宿主毒力基因表達[29]。盡管本研究未檢測到直接調控運動性的基因，但Bb中攜帶的前噬菌體GC含量存在顯著差異，提示其可能通過水平轉移獲得外源毒力基因[30]。據報道，前噬菌體在宿主基因組中的占比最高可達 20% 左右[31]。本研究中Bb攜帶的前噬菌體在宿主基因組中所占比例僅為0.1067%～1.069% ，遠低于之前的報道。這種差異可能反映了不同細菌種屬在基因組結構、進化壓力或防御機制上的不同適應性策略。編碼毒力因子的病原菌的毒力基因可通過噬菌體的水平基因轉移能力在群體間迅速傳播[3]。帶有毒力基因的前噬菌體整合到宿主菌基因組上，宿主菌可表達毒力基因產生毒素，進而表現為菌株的致病力增強[33]。前噬菌體編碼的毒力基因在金黃色葡萄球菌等細菌致病過程中的作用已被證實[34]。目前，Bb中已被報道的毒力基因主要包括外膜蛋白A（OmpA）、脂多糖（LPS）、莢膜多糖、磷脂酶D（PLD）、青霉素結合蛋白（PBP）和外膜囊泡（OMV）等[35]，涉及運動性、黏附性、生物膜的形成和鐵的獲取。本研究僅發現其中一株Bb基因組上的2條前噬菌體攜帶毒力基因，編碼波氏桿菌的III型分泌系統（T3SS）毒力因子。在Bb中，前噬菌體攜帶毒力基因的比例顯著低于炭疽芽孢桿菌中前噬菌體攜帶毒力基因的比例 （?，528%） [36]，Bb的噬菌體展現出廣泛的宿主范圍，能夠在大腸埃希菌中實現復制，然而其攜帶毒力基因的能力相較于金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的噬菌體則相對較弱[37。表明毒力基因通過原噬菌體轉導在Bb群間的傳播風險較低。此外，在本研究發現30株Bb攜帶耐藥基因，主要包括sul1和sul2以及tet（G）。其耐藥表型中以磺胺類藥物為主，其次為四環素類藥物。細菌通過多種作用機制對磺胺類藥物產生耐受。sul1和sul2基因編碼對磺胺類藥物不敏感的二氫葉酸合成酶，從而導致對磺胺類藥物的耐藥性[38]。除了上述機制外，細菌還可能通過獲得編碼抗生素外排泵的基因，增強對磺胺類藥物的耐藥性[39]。此外，雙組分調控系統可賦予細菌對氧化應激和酸性環境更強的耐受性，進而提高對磺胺類藥物的耐藥性[40]。

噬菌體的進化可能受到多種因素的影響，包括宿主適應性、基因水平轉移和地理隔離等[41]。某些噬菌體表現出宿主特異性，主要來源于特定動物（如豬），表明噬菌體與宿主菌之間存在長期共進化關系。部分噬菌體（如AJ7）不僅存在于豬源Bb菌株中，也在人源的菌株中被檢測到，顯示出跨宿主傳播的能力。某些噬菌體（如T2、Q3和X6）僅在美國境內發現，表明地理分布可能對噬菌體的進化有一定影響。部分噬菌體（如H1、M4和AB5）表現出跨地域和跨宿主的傳播特征，表明它們可能具有較高的適應性，能夠在不同環境中傳播。因此，前噬菌體的親緣關系與其宿主菌Bb的來源和地理分布之間的關系復雜，需要進一步研究揭示其背后的機制。

前噬菌體是協助菌群間毒力基因和耐藥基因水平轉移和傳播的重要因素，可以使宿主菌群體快速獲得耐藥性，增強宿主菌的定植和侵襲能力[11-13]。101株Bb分為37個ST型，不同ST型與宿主來源（豬、人和馬等）的地理分布相關，然而前噬菌體在Bb菌株中的分布與Bb的ST分型無明顯關聯，并不集中于特定的ST分型。所有Bb菌株均攜帶原噬菌體，部分原噬菌體（如AJ7、H1等）表現出跨宿主（豬、人）和跨地域（美國、中國）傳播特征。Bb的核心毒力因子（如cyaA、fhaB）由染色體編碼，僅2條前噬菌體攜帶III型分泌系統（T3SS）毒力基因，且未發現原噬菌體攜帶其他毒力基因（如黏附素和毒素等）和耐藥基因。因此，耐藥基因在Bb中通過原噬菌體水平傳播的風險較低，尚需大量的Bb基因組數據分析和試驗驗證。

綜上所述，Bb普遍攜帶前噬菌體，前噬菌體的存在可能通過增強宿主菌的毒力而提升其致病性。未來的研究應進一步揭示前噬菌體的具體作用機制，并探索其在抗菌策略中的應用潛力。

4小結

Bb普遍攜帶前噬菌體，編碼大量未知基因，但前噬菌體基因在Bb基因組中所占比例僅為0.1067%～1.069% 。部分Bb攜帶耐藥基因，以對磺胺類和四環素類藥物耐藥為主。研究提示多個前噬菌體編碼病毒防御蛋白，并可協助抵御宿主菌的防御系統；其中2條前噬菌體攜帶II型分泌系統（T3SS）毒力因子，可能影響Bb的致病力。

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