MALDI-TOFMS分析聯(lián)合16SrRNA基因測序鑒定人型支原體菌血癥

中圖分類號：R978.1 文獻標識碼：A 文章編號：1001-8751（2025）04-0253-06

Identificationof Mycoplasma hominis Bacteremia byMALDI-TOFMS Combined with 16S rRNA Gene Sequencing

Xu Cheng， Wang Shu， Jiang Lu， Xie Wen-ting， Xu Ying （TaizhouHospitalofTraditionalChineseMedicine，Taizhou，Jiangsu，）

Abstract： ObjectiveTo analyze the blood culture samples of a patient with postpartum fever by Matrixasisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry （MALDI-TOF MS） and 16S rRNA gene sequencing，inorder to identifythe cause of postpartum fever and provide a reference for clinical diagnosis and treatment.MethodsThe positive cultures in the blood culture bottle were transferred to columbia blood AGAR plate and chocolate AGAR plate， incubated in 35^°C ， 5% （2號 CO₂ incubator， and examined by direct gram staining. The target strainson the medium were stainedand identified by MALDI-TOFMS.The target strains were examined for antimicrobial susceptibility based on the results of MS identification，and their identity was confirmed using 16S rRNA gene sequencing techniques.ResultsThe positive culture in the blood culture bottle was detected by Gram staining microscopy，but no bacterial structure was found.Colombia bloodAGAR plateculture for 48 hours can be sen in needle-like transparent smallcolonies，with a chocolate AGAR plate with no bacterial growth. Mycoplasma hominis was identified by MS on columbia blood AGAR with 99.9% confidence. It was resistant to other medications andsensitive tominocycline，doxycycline，lucamycin，and clindamycin，according tothe resultsof the antimicrobial susceptibility test. The nucleotide homology of the 16S rRNA gene sequence of the target strain was 99.71% with that of the standard strain of Mycoplasma hominis ATCC23114. Conclusion The cause of postpartum fever is

Mycoplasma humanemia.The results of MALDI-TOF MS were reliable for the identificationofMycoplasma hominis. 16S rRNA gene sequencing combined with MALDI-TOF MS can improve the diagnostic eficiency and accuracy of rare pathogens.

Key words： Mycoplasma hominis； bloodstream infection; MALDI-TOF MS; 16S rRNA gene sequencing

人型支原體（Mycoplasmahominis，Mh）是一類能夠自行繁殖的最小原核細胞型微生物，通常定植于泌尿生殖道和呼吸道。人型支原體主要與泌尿生殖系統(tǒng)感染有關(guān)，特別是細菌性陰道炎和非淋球菌性尿道炎[1。此外，人型支原體還能引起泌尿生殖器外的感染，如產(chǎn)后熱、術(shù)后傷口感染、盆腔炎和腎盂腎炎等。在新生兒中，人型支原體可導致腦膜炎、腦膿腫和眼部感染。

人型支原體缺乏細胞壁，革蘭染色難于著色呈陰性。另外，人型支原體的營養(yǎng)要求較高，生長緩慢。這就使得傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法和生化反應在鑒定人型支原體上有一定的挑戰(zhàn)性。隨著質(zhì)譜技術(shù)和基因測序在臨床上的推廣和普及，對少見菌和難培養(yǎng)菌所致感染的診斷帶來了新思路。本研究通過基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜分析（Matrix-assistedlaserdesorption/ionization time offlight mass spectrometry，MALDI-TOFMS）和16SrRNA靶向測序技術(shù)，從一例產(chǎn)后發(fā)熱患者的血培養(yǎng)標本中檢出人型支原體。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1 標本來源

2024年4月收住于產(chǎn)科患者順產(chǎn)后24h無明顯誘因發(fā)熱的血培養(yǎng)標本。

1.1.2 試劑

血培養(yǎng)瓶、哥倫比亞血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板及支原體藥敏板均購自鄭州安圖生物有限公司；質(zhì)譜基質(zhì)液（CHCA）購自法國生物梅里埃公司；革蘭染色液及瑞氏染色液購自珠海貝索生物科技有限公司；質(zhì)控菌株ATCC8739來自賽默飛世爾科技有限公司。

1.1.3儀器

BC-120全自動血培養(yǎng)儀購自鄭州安圖生物有限公司，MALDI-TOFMS微生物質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品，BG-Thermo干式恒溫加熱器購自北京百晶生物技術(shù)有限公司，PCR儀購自Takara生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1 血培養(yǎng)及鏡檢

在患者體溫升高初期時采集血培養(yǎng)標本，BC-120全自動血培養(yǎng)儀對血培養(yǎng)瓶進行連續(xù)培養(yǎng)，每10min監(jiān)測一次數(shù)據(jù)，直到儀器提示血培養(yǎng)瓶陽性后取出，將陽性的血培養(yǎng)物接種于哥倫比亞血瓊脂平板和巧克力瓊脂平板，并涂片進行革蘭染色鏡檢。

1.2.2 MALDI-TOFMS分析

將哥倫比亞血瓊脂平板上的目標菌株涂布于靶板對應的孔位，滴加CHCA基質(zhì)液1μL至自然干燥，待孔位結(jié)晶完全干燥后即可輸入菌株信息，加載靶板進行分析鑒定。

1.2.3支原體藥物敏感性試驗

吸取 100μL 基礎液加入C空白對照孔，用無菌棉棒挑取適量哥倫比亞血瓊脂平板上的目標菌株于剩余基礎液中混勻，然后將含有目標菌株的基礎液加入其余各孔，每孔 100μL 。所有孔位均需要加一滴石蠟油以覆蓋液面。將藥敏試驗板加蓋后置于 35^°C 培養(yǎng)箱孵育24h觀察結(jié)果。

1.2.4 16SrRNA基因測序及分析

將哥倫比亞血瓊脂平板的目標菌株用d d H₂O 配制成菌懸液，置于 100℃"min，獲得目的菌株的DNA。采用通用引物 27F（5^° 1AGAGTTTGGATCMTGGCTAG-3'）和 1492R（5^°）. CGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）PCR擴增目標菌株的16SrRNA基因，擴增條件為 95°Cl0min ： 98^°C10s 55^°C30s ， 72^°C30s ，35個循環(huán)， 72^°C7min 。PCR產(chǎn)物進行Sanger測序，委托北京睿博興科生物公司進行。利用BLAST（Basic localalignment search tool）工具，從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載親緣關(guān)系較近的序列作為參考序列，與本研究中檢測到的序列結(jié)果進行比較分析。利用MEGAX軟件，CLUSTALW方法進行序列比對，Maximum-likehood（ML）法構(gòu)建基于16SrRNA的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結(jié)果

2.1血培養(yǎng)及鏡檢

2024年4月25日送檢該患者左右兩側(cè)肘正中靜脈厭氧血培養(yǎng)標本（未做需氧瓶），于上機后1.99d和2.09d報陽，由圖1可見左右兩側(cè)肘正中靜脈細菌生長曲線相似，均提示可能有細菌生長。將陽性血培養(yǎng)物直接涂片做革蘭染色，鏡下未見典型菌體結(jié)構(gòu)。陽性血培養(yǎng)物分別吸取 100μL 接種于哥倫比亞血瓊脂平板和巧克力瓊脂平板各兩塊，其中一塊哥倫比亞血瓊脂平板和巧克力瓊脂平板置于CO培養(yǎng)箱，另一塊哥倫比亞血瓊脂平板和巧克力瓊脂平板則置于厭氧環(huán)境中培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后，兩塊哥倫比亞血瓊脂平板均出現(xiàn)針尖樣半透明小菌落TZ0425（圖2），巧克力瓊脂平板未見細菌生長。挑取哥倫比亞血瓊脂平板上的目標菌落涂片，分別做革蘭染色和瑞氏染色。革蘭染色鏡下未見細菌，瑞氏染色油鏡下可見藍色桿菌呈長鏈狀排列，見圖3。

圖1患者雙側(cè)肘正中靜脈的血培養(yǎng)

1A：指左側(cè)肘正中靜脈樹脂厭氧瓶的血培養(yǎng)標本細菌生長曲線圖；1B：指右側(cè)肘正中靜脈樹脂厭氧瓶的血培養(yǎng)標本細菌生長曲線圖。

圖2哥倫比亞血瓊脂平板培養(yǎng)48h的菌落形態(tài)

圖3哥倫比亞血瓊脂平板菌落鏡下形態(tài)（瑞氏染色， ×1000

2.2 MALDI-TOFMS分析

哥倫比亞血瓊脂平板上的目標菌株TZ0425經(jīng)質(zhì)譜鑒定，MALDI-TOFMS分析圖譜中有9個主蛋白峰值（圖4），各峰分離效果較好。將其與數(shù)據(jù)庫中的圖譜進行比較，得出鑒定結(jié)果為人型支原體，置信度為 99.9% 。

圖4人型支原體MALDI-TOFMS分析圖譜

2.3支原體抗菌藥物敏感性試驗

支原體液體培養(yǎng)基上鑒定結(jié)果為人型支原體，菌落計數(shù)大于 10⁴CFU/mL 。其抗菌藥物敏感性試驗結(jié)果顯示對米諾環(huán)素、多西環(huán)素、交沙霉素和克林霉素敏感，對紅霉素、阿奇霉素、甲砜霉素、克拉霉素、羅紅霉素、司帕沙星、左氧氟沙星及加替沙星耐藥，見圖5。

C-：陰性對照孔； C+ ：陽性對照孔；UU：解脲支原體；MH：人型支原體；MIN：米諾環(huán)素；DOX：多西環(huán)素；ERY：紅霉素；AZI：阿奇霉素；JOS：交沙霉素；THI：甲礬霉素；CLI：克林霉素；CLA：克拉霉素；ROX：羅紅霉素；SPA：司帕沙星；LEV：左氧氟沙星；GAT：加替沙星。

圖5支原體液體培養(yǎng)及其藥敏結(jié)果

2.4 16SrRNA基因測序及分析

測序結(jié)果上傳于Genbank數(shù)據(jù)庫中，序列號為PP916655。運用在線工具Blastn在16S核糖體RNA序列數(shù)據(jù)庫中進行比對分析，與人型支原體標準菌株ATCC23114核苷酸同源性較高，為 99.71% 。進一步構(gòu)建基于16SrRNA序列水平系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖6所示。本研究中的目標菌株TZ0425與人型支原體標準菌株ATCC23114（序列號：NR074603）及人型支原體菌株NBRC14850（序列號：NR113679）處于同一個分支中，親緣關(guān)系較近，自展值百分比接近 100% 。與支原體屬內(nèi)其他菌種的核苷酸同源性較低，有明顯的進化距離。因此本研究中的目標菌株鑒定為人型支原體。

3討論

人型支原體屬于支原體目支原體科支原體屬，于1937年首次從前庭大腺膿腫中分離檢出[2]。人型支原體主要定植于泌尿道和呼吸道，女性泌尿生殖道定植率為 21%～54% ，男性定植率較低，為 4%～13% [3]；在健康的成年人中，上呼吸道的定植水平為 1%～3% ，慢性呼吸道疾病的患者定植率約 8% ，慢性扁桃體炎患者定植率高達 30%^[4] 。人型支原體主要與泌尿生殖系統(tǒng)的感染有關(guān)，但是越來越多的泌尿生殖器外的感染，引起了人們對人型支原體的關(guān)注，包括骨折術(shù)后傷口的支原體感染[5]，支原體感染所致的化膿性縱膈炎[，實體器官移植后支原體引起的嚴重感染[7]，及早產(chǎn)兒人型支原體腦膜炎[8]。大多數(shù)支原體感染的患者均有易感因素，包括免疫抑制劑的使用、創(chuàng)傷和手術(shù)，發(fā)病機制可能為病原體從定植部位經(jīng)血行傳播引起感染。人型支原體引起的菌血癥相對少見，但它在臨床實踐中的報道逐漸增多[9-10]。本研究中的產(chǎn)婦在正常分娩1d后，出現(xiàn)間歇性發(fā)熱，最高體溫為 38.2°C ，在左右兩側(cè)的厭氧血培養(yǎng)瓶中連續(xù)培養(yǎng)2d左右檢出人型支原體。支原體培養(yǎng)所需的營養(yǎng)條件較高，生長較緩慢，且傳統(tǒng)的檢測方法對于支原體的檢測很可能會失敗，因此給臨床病原學診斷帶來了很大的挑戰(zhàn)。支原體缺乏細胞壁，只有細胞膜，革蘭氏染色時不易著色，因此無法通過常規(guī)革蘭染色直接觀察，可用吉姆薩染色法或瑞氏染色法，有助于鏡下觀察。支原體呈明顯多形性，有球形、桿狀和長絲狀等，在含有膽固醇和酵母的固體培養(yǎng)基中，人型支原體的菌落可呈現(xiàn)為典型的“油煎蛋”樣[1l-12]。本研究中陽性瓶細菌生長曲線提示有細菌生

長，采用瑞氏染色法，在油鏡下可觀察到桿狀的菌體呈長鏈狀排列。在哥倫比亞血瓊脂平板中，24h的菌落形態(tài)較小，極易忽略，延長培養(yǎng)48h后，可觀察到針尖樣半透明小菌落。因此，在臨床實際工作中，血培養(yǎng)報陽時應首先查看細菌生長曲線，初步排除假陽性。在血培養(yǎng)陽性物涂片革蘭染色未見病原菌形態(tài)時，可嘗試采用其他染色方法。另外接種物的平板應適當延長培養(yǎng)時間，定期觀察，防止漏檢。有研究指出，人型支原體可以在哥倫比亞瓊脂平板上生長，而其他支原體（如解脲支原體）則很難在哥倫比亞瓊脂平板上生長，因此，當臨床懷疑有支原體感染時，應額外接種支原體液體培養(yǎng)基或利用PCR或宏基因組二代測序（mNGS）等技術(shù)輔助診斷。

MALDI-TOFMS主要使用基質(zhì)輔助激光解吸電離時間飛行質(zhì)譜，通過將細菌的蛋白分子與基質(zhì)共結(jié)晶后，使用激光解吸將其電離，測量離子的飛行時間來確定其分子質(zhì)量及分布，能夠通過比對質(zhì)譜圖譜來快速進行微生物的分類和鑒定。之前也有利用質(zhì)譜技術(shù)來鑒定人型支原體的報道[13-14]，其中一例鑒定失敗主要原因是未建立支原體的質(zhì)譜圖庫。質(zhì)譜技術(shù)雖然具有快速和高通量的優(yōu)勢，但在檢測靈敏度和特異性上仍需要進一步驗證和優(yōu)化。因此我們對目標菌株補充了16SrRNA靶向測序。16SrRNA序列在微生物屬和種的水平上具有相對高的保守性和特異性，是一種有效可靠的檢測手段[15]。但是在PCR擴增時，可能會引入外源性的污染物，對操作的要求較高。同時16SrRNA序列的鑒定依賴于公共數(shù)據(jù)庫的質(zhì)量和完整性，需要定期更新和維護，以確保其適用性。本研究中將質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合應用16SrRNA靶向測序，不僅可以提高微生物鑒定的準確性和深度，還能夠為研究人員提供更加全面的微生物學信息，提高臨床診斷水平。

由于支原體無細胞壁，作用于細菌細胞壁的抗菌藥物都是不被推薦的，如β-內(nèi)酰胺類和萬古霉素。目前關(guān)于支原體引起的血流感染仍無相關(guān)指南來指導治療，主要參照生殖支原體的治療方案，采用多西環(huán)素-莫西沙星或多西環(huán)素-西他沙星序貫治療[。支原體耐藥性的研究也日益受到關(guān)注，主要受到抗生素的選擇壓力影響，由于大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類抗菌藥物的廣泛使用，目前支原體對大環(huán)內(nèi)酯類及喹諾酮類藥物的敏感性普遍偏低[17]，對四環(huán)素類的耐藥率近幾年也有增加的趨勢[18-19]。但是支原體對抗菌藥物的耐藥性呈現(xiàn)地域性和群體性差異。本研究中的病例出現(xiàn)產(chǎn)后發(fā)熱，臨床經(jīng)驗使用頭孢曲松聯(lián)合甲硝唑進行治療，發(fā)熱反復。后根據(jù)支原體藥敏結(jié)果調(diào)整為克林霉素治療，3d后患者體溫、C反應蛋白及血常規(guī)均恢復正常。出院后的回訪中，也未再次出現(xiàn)發(fā)熱。因此，根據(jù)抗菌藥物敏感性試驗來選擇合適的抗生素是提高臨床療效的關(guān)鍵。

綜上，人型支原體因其特殊的微生物學特征和臨床表現(xiàn)，對臨床診斷和微生物學檢驗提出了諸多挑戰(zhàn)。本研究提示MALDI-TOFMS分析技術(shù)對人型支原體的鑒定結(jié)果可靠；通過MALDI-TOFMS分析技術(shù)聯(lián)合16SrRNA基因測序能夠有效提高診斷的準確性和效率，值得推廣應用于少見病原菌的鑒別，助力臨床精準治療。

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