法夫酵母產蝦青素發酵工藝的優化

中圖分類號：R978 文獻標識碼：A 文章編號：1001-8751（2025）05-0303-07

Optimization of the Fermentation Process for Astaxanthin Production byXanthophyllomycesdendrorhous

Yu Bing-xin， Ma Tian-yue， Chen Hai-long， Zheng Heng （School ofLife Sciencesand Technology，China Pharmaceutical University，Nanjing ）

Abstract： Objective Using Xanthophyllomyces dendrorhous as the test strain，conduct fermentation process scale-up and optimization in a 5L fermenter to increase the astaxanthin yield of the strain.MethodsOptimize the initial carbon sourcecomponents inthe fermentationmedium，and investigate theeffcts of adding diferent nitrogen sources，anti-foaming agents，amylase，and sodium citrate during the fermentation processon the astaxanthin yield. ResultsThe optimal carbon source for the initial fermentation medium is 10% starch.By varying the agitation speed， the dissolved oxygen is kept above 60% during the fermentation process， which is conducted at 20^°C with an aeration rate of 6L/min . Add 2‰ amylase after 24 hours.The pH at5.8inthe early stage and5.O in the laterstage of the fermentation.Continuouslyaddcarbonsources，andcontrol the concentration of reducing sugars in the fermenter. Add organic nitrogen sources，organic silicon-based antifoaming agents，and sodium citrate.When the fermenter's final sodium citrate concentration is 5g/L ， the astaxanthin yield can reach up to 546.17±17.16mg/L ， representing an increase of 291.30±12.30% compared to the yield before optimization. Conclusion The astaxanthin fermentation yield issignificantlyaffected byfermentation conditions.A significant boost in yieldand the groundwork forits industrial use were established bythis study's employment of the slowly consumed carbon source starch，regulated feeding，and the fermentation enhancer sodium citrate.

Key Words： Xanthophyllomyces dendrorhous； astaxanthin； fermenter； optimize； carbon source

蝦青素（Astaxanthin），化學名為3，3'-二羥基-4，4'-二酮基-ββ胡蘿卜素，是一種雙環類胡蘿卜素，其獨特的分子結構使蝦青素具有很強的抗氧化能力，其抗氧化活性遠高于其他類胡蘿卜素和維生素E，比β -類胡蘿卜素和維生素C高10到6000倍[2-3]。蝦青素具有淬滅單線態氧的能力，可以防止活性氧（ROS）引起的細胞毒性，刺激免疫系統對抗癌癥，減緩衰老過程[4]。此外，蝦青素還具有抗炎和抗菌特性，可以預防和治療多種疾病，包括糖尿病、心血管疾病和神經退行性疾病[5-]。蝦青素用途廣泛，除了作為食品、保健品、化妝品和藥品的常見成分，還被用作水產養殖和畜牧業的飼料添加劑[7-8]。

目前蝦青素主要通過化學合成、動植物提取和微生物發酵生產。但是動植物提取的成本過高，且化學合成的蝦青素多以化合物形式存在，導致蝦青素的生物活性和利用率低。因此生物合成的天然蝦青素更符合市場需求。法夫酵母具有生長速度快，可利用不同碳源，易于培養[10]和便于發酵罐培養等優點，是目前工業生產天然蝦青素的來源之一。但蝦青素的產量是制約法夫酵母在工業中應用的重要因素[11]。本文將從發酵培養基的初始碳源，發酵過程中補加不同種類的氮源和消泡劑，是否添加淀粉酶和檸檬酸鈉等方面進行優化，為提高蝦青素產量和中試放大工藝提供參考。

1試劑與材料

1.1菌種

法夫酵母（Xanthophyllomycesdendrorhous），本實驗室選育保藏。

1.2儀器與試劑

Agilent11o0SeriesHPLC（Agilent公司），HedraODS-2色譜柱（江蘇漢邦科技有限公司），UV-1000型紫外可見分光光度計（上海翱藝儀器有限公司），TD2102電子天平（天津市天馬儀器廠），5L四聯發酵罐（上海萬木春生物工程有限公司），pH電極和溶氧電極（梅特勒托利多公司）。

蝦青素標準品（Sigma公司），酵母粉（Oxoid公司），維生素 B₁ 、維生素B和肌醇（上海惠興生化試劑有限公司），高溫淀粉酶（上海源葉生物科技有限公司），葡萄糖、檸檬酸鈉、3，5-二硝基水楊酸（DNS）和二甲亞礬（DMSO）等（國藥化學試劑有限公司）。

1.3 培養基

平板培養基：葡萄糖 20g/L ，蛋白脈 20g/L ，酵母粉 10g/L ，瓊脂粉 20g/L

種子培養基：葡萄糖 20g/L ，蛋白陳 20g/L ，酵 母粉 10g/L

發酵培養基：葡萄糖 30g/L （或淀粉 100g/L ，麥芽糊精 100g/L ，酵母粉 10g/L ，檸檬酸鈉 5g/L ，MgSO₄.7H₂O 2.05g/L ， KH₂PO₄3g/L ， FeSO₄?7H₂O 0.0876g/L ， ZnSO₄?7H₂O 0.0196g/L ， MnSO₄?H₂O 0.2740g/L ， CoSO₄0.00043g/L ，生物素 0.0130g/L ，維生素 B₁ 0.0143g/L ，維生素 ?B₆ 0.0173g/L ，泛酸鈣0.0175g/L ，肌醇 0.0650g/L 。

2實驗方法

2.1培養條件

平板培養：將保藏的法夫酵母菌挑取適量至種子培養基中，于 20°C ， 200r/min 振蕩培養箱培養48h，然后取菌液適量稀釋 10^-6 至平板培養基中，于20^°C 恒溫培養箱中培養 7d. 0

種子培養：挑取約5個活化單菌落接種至裝有30mL種子培養基的 500mL 的三角瓶中，于 20°C ，200r/min 培養 48h 。

發酵罐培養：將種子液以 3.6% 的接種量接種到5L發酵罐中（裝量 40% 0，發酵控溫 20°C ，通氣6mL/min ，溶氧級聯，維持溶氧 （DO）60% 以上，控制pH5.0～5.8. 0

2.2 測定方法

2.2.1 還原糖濃度測定[12]

取離心后的發酵液上清液 1mL 于試管中，加入1mL DNS溶液，混勻，沸水浴 2min ，迅速冷卻至室溫，定容至 25mL ，搖勻、避光靜置 15min ，于紫外分光光度計 540nm 處測定吸光值。取不同濃度葡萄糖標準溶液 1mL ，用上述方法操作制作標準曲線，對應標準曲線計算發酵液中還原糖含量。

2.2.2 總糖濃度測定[13]

將離心后的發酵液上清液加入等體積6mol/L鹽酸煮沸 20min ，水解總糖。取 150μL 水解液用 6mol/ΩL氫氧化鈉溶液中和后，加水稀釋至 1.5mL 。取 1mL 稀釋液，加入1mLDNS溶液，混勻，沸水浴 2min 迅速冷卻至室溫，定容至 25mL ，搖勻、避光靜置15min，于紫外分光光度計 540nm 處測定吸光值。

2.2.3 蝦青素的提取與測定[14-15]

取 100μL 發酵液稀釋至 1mL ， 12000r/min 離心3min ，棄上清，沉淀稱重計算菌體濕重，然后置于50^°C 水浴中預熱 ：5min ，加入1mL已預熱的DMSO，震蕩，充分破壁后， 12000r/min 離心 ?3min ，取上清液，用乙醇多次抽提至菌體沉淀呈無色，將提取的上清液合并，用乙醇定容至 10mL ，使用高效液相色譜法測定蝦青素含量。色譜柱為HedraODS-2， ID5μm ，4.6μm×250μm ；流動相為甲醇；波長： 487nm ；柱溫：30°C ；流速： 1.0mL/min ；進樣量： 20μL 。

2.3分析研究

2.3.1不同初始碳源對補料發酵的影響

在5L發酵罐中，分別考察了以葡萄糖、淀粉和麥芽糊精作為初始碳源，對法夫酵母的菌量和蝦青素產量的影響。初始葡萄糖濃度為 30g/L ，淀粉和麥芽糊精濃度均為 100g/L ，發酵24h后流加酵母粉，72～168h補加葡萄糖溶液，控制還原糖濃度在 5～10g/L 。

2.3.2 流加氮源對補料發酵的影響

在 5L 發酵罐中，分別考察了流加酵母粉或硫酸銨，對法夫酵母的菌量和蝦青素產量的影響。24～120h后流加 20% 酵母粉或 10% 硫酸銨共 ?1L ，120～168h補加葡萄糖，控制還原糖濃度在 5～10g/L 。

2.3.3 消泡劑對補料發酵的影響

分別考察了有機硅類和豆油兩種消泡劑，對發酵工藝中法夫酵母菌量和蝦青素產量的影響。初始發酵培養基添加消泡劑，含量為 2‰ 。發酵過程中持續流加消泡劑，由消泡電極控制。0h流加酵母粉，144～168h補加葡萄糖，控制還原糖濃度在 5～10g/L 。

2.3.4添加淀粉酶補料發酵的影響

當初始發酵培養基為 10% 淀粉時，對比發酵過程中是否添加淀粉酶對法夫酵母菌量和蝦青素產量的影響。0h流加酵母粉， 24h 后添加淀粉酶至罐內最終酶活力為 40 000U/mL （淀粉酶用 0.22μm 濾膜過濾除菌，以補料的形式一次性流加 5mL ），144～216h補加葡萄糖，控制還原糖濃度在 5～10g/L 。

2.3.5 添加檸檬酸鈉對分批補料蝦青素發酵工藝的 影響

對比了在發酵過程中是否流加檸檬酸鈉，對法夫酵母的菌量和蝦青素產量的影響。0h流加酵母粉， 144～240h 補加葡萄糖，控制還原糖濃度在5～10g/L ，144h時添加檸檬酸鈉到發酵罐直至終濃度為 15g/L 。

在最佳補料條件下重復發酵三批，測240h結束時的發酵產量。

3結果與分析

3.1初始碳源對補料發酵的影響

法夫酵母中含有淀粉酶基因，可以利用包括葡萄糖、果糖和淀粉在內的多種碳源[16]，工業中使用成本更低、效果更好的碳源，有利于擴大產值。故分別考察，當發酵罐內初始培養基碳源為葡萄糖、淀粉和麥芽糊精時，對酵母菌重和蝦青素產量的影響。如圖1所示，發酵培養48h時，淀粉組的酵母菌重和蝦青素產量都要低于葡萄糖組；當發酵培養至 120h ，三組的酵母菌重和蝦青素產量都有了明顯的提升，葡萄糖組和淀粉組的酵母菌重均達到 30% 左右；到發酵末期，無論是酵母菌重和蝦青素產量，淀粉組都要優于其他兩組。在分批補料的情況下，淀粉組的菌重及蝦青素產量能達到 43.32% 和 364.97mg/L 。結果所示，在蝦青素發酵工藝放大中，使用淀粉作為初始碳源不僅有利于酵母菌重增長和蝦青素的積累，而且能降低發酵培養的成本，促進工業化的發展。

3.2流加無機或有機氮源對分批補料蝦青素發酵工 藝的影響

氮源是正常微生物生長必不可少的營養物質。當微生物在密閉的環境中發酵培養時，會不斷消耗培養基中的氮源導致其消耗殆盡，影響微生物后續的生長。在發酵過程中添加合適且適量的氮源，可以促進菌體快速增加。因此分別考察了在發酵培養過程中，流加無機氮源-硫酸銨和有機氮源-酵母粉對酵母菌重和蝦青素產量的影響。如圖2所示，在發酵工藝中流加氮源，均能使酵母菌量和蝦青素產量得到一定程度的提高。在發酵培養至72h時，硫酸銨組的蝦青素產量達到 79.96mg/L ，高于酵母組的64.99mg/L 。而此時酵母粉組的菌重為 22.14% ，硫酸銨組的菌量為 11.93% ，可能是酵母將所攝取的營養著重用于生長，而并非用于積累蝦青素所導致的暫時效應。當到發酵結束 144h 時，酵母粉組的菌量突破了 49.33% ，蝦青素也有顯著的提高，達到260.42mg/L ，對比硫酸銨組高了 52.69% 。結果顯示，在蝦青素發酵工藝中流加氮源可以有效提高酵母菌重和蝦青素產量，且流加有機氮源的效果更好。

3.3不同消泡劑對分批補料蝦青素發酵工藝的影響

發酵罐培養時，攪拌、通氣和微生物呼吸等原因會產生大量的氣泡，若任氣泡堆積會導致頂罐等威脅，招致染菌的風險。因此在培養基中添加消泡劑是工業發酵時的常用方法。消泡劑有許多種，其中就包含有機硅類等常用消泡劑，油類物質稠潤且無毒也可做消泡劑。故分別考察有機硅類和豆油充當消泡劑，對蝦青素發酵的影響。如圖3所示，發酵 120h 時，有機硅類組的蝦青素產量達到 172.35mg/L ，略高于豆油組的 102.03mg/L 。發酵末期，有機硅類組和豆油組的菌重均維持在 40% 左右，蝦青素產量分別達到 453.59mg/L 和 402.85mg/ L。結果顯示，當有機硅類和豆油充作消泡劑時，可有效控制發酵過程中泡沫的產生，且兩者之前對蝦青素產量的影響相差不大。

3.4添加淀粉酶對分批補料蝦青素發酵工藝的影響

淀粉酶可水解淀粉為還原糖。法夫酵母在發酵生長過程中，能產生淀粉酶將淀粉不斷水解成還原糖供自身利用，但在發酵前期菌量累積少，淀粉含量高，還原糖含量低，為了在發酵前期提高還原糖的濃度，加速菌量積累，考察了在發酵培養時添加淀粉酶對蝦青素發酵工藝的影響。如圖4所示，在發酵對數生長期，添加淀粉酶后，酵母菌重達到了 27.2% ，高于未添加淀粉酶組 17.60% 。到216h發酵結束，未添加淀粉酶組的菌重維持在 30% 左右，其蝦青素產量能達到 300.16mg/L ，而添加淀粉酶組的菌重維持在 40% 左右，其蝦青素產量達到 482.52mg/L ，比未添加淀粉酶組高 60.76% 。結果顯示，在發酵前期添加淀粉酶，能加速淀粉水解，提高罐內還原糖的含量，促進前期酵母菌量的累積，有利于增加蝦青素的產量。

3.5添加檸檬酸鈉對分批補料蝦青素發酵工藝的影響

檸檬酸鈉是蝦青素合成的乙酰輔酶a前體，能促進胞內蝦青素的積累[16。如圖5所示，對比未添加檸檬酸組，添加檸檬酸鈉組的發酵趨勢有所改變，酵母菌重略有下降，但蝦青素的產量卻快速升高，到發酵結束后菌重維持在 40% 左右，蝦青素產量能達到 546.17mg/L ，對比未添加檸檬酸鈉組的蝦青素產量提高了 17.42% 。結果顯示，檸檬酸鈉確實可以促進蝦青素的積累。

在最佳補料工藝條件下重復三批驗證，于240h測定發酵產量達 546.17±17.16mg/L ，相對應以淀粉為初始碳源，補加有機氮源、淀粉酶、有機硅類消泡劑和葡萄糖，酵母菌重在144h到達平臺期，菌重維持在 40% 0通過優化，可使蝦青素產量提高 219.30±12.3% 。

4討論

液體發酵廣泛用于大規模工業生產微生物產物[17-18]。法夫酵母生產蝦青素時，高濃度的葡萄糖會抑制細胞生長，積累乙醇和乙酸等導致葡萄糖利用率降低，影響生物量的積累[19-20]。單批發酵培養時將淀粉作為初始碳源，有利于酵母在生長過程中不斷水解淀粉為還原糖，既解除了高葡萄糖的反饋抑制效果，還能在發酵過程中持續利用還原糖進行蝦青素合成，減輕了分批補料對碳源控制的負擔。添加淀粉酶能有效地促進淀粉水解，緩解因罐內菌量不足導致初始還原糖偏低的情況，加速酵母對淀粉的利用和前期菌量積累，使得蝦青素產量提高了60.76% 。當培養基中的C/N比較低時，利于細胞快速生長；而培養基中的C/N比較高時，利于蝦青素合成[21]。因此在細胞生長階段提高C/N比，能有效地促進菌體積累。有機氮源的氮源質量要優于無機氮源，對于前期菌體生長的作用更強。

發酵過程中大量的泡沫會影響蝦青素工藝的控制，使用消泡劑能減少或消除泡沫，是工業發酵最直接常用的方法。有機硅類消泡劑表面張力低、化學性質穩定、安全性能高且與各類物質不相容，具有良好的消泡和抑泡能力[2]。非有機硅類礦物油型消泡劑也可用于抑制泡沫的產生，但其消泡性能有限，常常需要向礦物油中添加脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪酰胺和有機磷酸酯等消泡活性物質，以提高消泡性能[23]。豆油無毒且成本低廉，實驗中也能有效地抑制泡沫的產生。本實驗中，有機硅類和豆油消泡劑均有良好的抑泡能力，末期蝦青素產量分別453.59mg/L 和 402.85mg/L ，各有優劣。因此發酵工藝中，常常根據實際需要選擇最合適的消泡劑。外源添加三羧酸（TCA）循環中的特定中間體，可以顯著刺激法夫酵母的多種生物過程，包括脂肪酸和類胡蘿卜素的代謝。在發酵過程中添加檸檬酸鈉，能促進葡萄糖消耗，調節三羧酸（TCA）循環，為蝦青素合成提供更多能量和底物[16]。在蝦青素發酵工藝中添加檸檬酸鈉，能促進蝦青素產量提高。最終優化發酵條件為：初始發酵培養基為 10% 淀粉，發酵過程中添加 2‰ 的淀粉酶，流加 20% 的有機氮源，選擇有機硅類或豆油充當消泡劑，發酵后期葡萄糖，控制還原糖濃度為 5～10g/L ，并流加檸檬酸鈉，控制罐內檸檬酸鈉的終濃度為 5g/L ，可以提高蝦青素的產量到 546.17±17.16mg/L 。后續研究中將進一步優化分批補料方式以提高蝦青素發酵產量。

參考文獻

[1]Ambati R，Phang SM，Ravi S，et al.Astaxanthin： sources， extraction，stability，biological activities and its commercial applications-a review[J].Marine Drugs，2014，12（1）：128- 152.

[2]Fakhri S，AnevaIY，Farzaei MH，etal. The neuroprotective effects of astaxanthin： therapeutic targets and clinical perspective[J].Molecules，2019，24（14）：2640.

[3]Mc Call B，Mc Partland C， Moore R， et al. Effects of astaxanthin on the proliferation and migration of breast cancer cells in vitro [J]. Antioxidants，2018，7（10）：135.

[4]Zhou D， Yang X， Wang H，et al. Biosynthesis ofastaxanthin by using industrial yeast[J]. Biofuels Bioprod Bioref， 2022， 15： 2449.

[5]Li J， Zhu D， Niu J， et al. An economic assessment of astaxanthin production by large scale cultivation of Haematococcus pluvialis[J].Biotechnology Advances，2011， 29（6）： 568-574.

[6]Wang X， Willen R， Wadstrom T. Astaxanthin-rich algal meal and vitamin C inhibit Helicobacter pylori infection in BALB/cA mice[J].Antimicrob Agents Chemother，2000， 44（9）： 2452-2457.

[7]Cheng X Y， Xiong YJ， Yang M M， et al. Preparation ofastaxanthin mask from Phaffia rhodozyma and its evaluation[J].Process Biochemistry，2019，79：195-202.

[8]Jiang G L， Zhu M J. Preparation of astaxanthin-encapsulated complex with zein and oligochitosan and its application in food processing[J].LWT，2019， 106：179-185.

[9]孫克誠，胡丹丹，袁文華，等.高產蝦青素的紅法夫酵母菌 株選育研究進展[J].中國畜牧雜志，2024，60（5）：12-17.

[10] Wu S，Li W， Zhou W， etal. Large-scale one-step synthesis of carbon dots from yeast extract powder and construction of carbon dots/PVA fluorescent shape memory material[J]. Advanced Optical Materials，2018， 6（7）： 1701150.

[11] Luna-flores C H， Wang A，Von hellens J， et al. Towards commercial levels of astaxanthin production in Phaffia rhodozyma[J].JBiotechnol，2022，350： 4-54.

[12] 趙凱，許鵬舉，谷廣燁.3，5-二硝基水楊酸比色法測定還原 糖含量的研究[J].食品科學，2008，8：534-536.

[13] 詹夢濤，婁水珠，劉仙花，等.3，5-二硝基水楊酸法測定 液體糖中總糖含量[J].云南民族大學學報（自然科學版）， 2020，29（4）： 317-321.

[14] 周凡，屈云，譚家聲，等.一種快速測定蝦青素含量的方法 [J].云南化工，2024，51（3）：91-93.

[15] 胡翠，謝柏艷，覃娟.高效液相色譜法檢測化妝品中蝦青 素含量[J].分析試驗室，2022，41（10）：1208-1213.

[16]PanXH，LiTG，WangBB，etal.Metabolic mechanismof astaxanthinbiosynthesisinXanthophyllomycesdendrorhous in response to sodium citrate treatment[J]. Bioresour Bioprocess，2023，10：29.

[17] 海梅，何正有，肖文艷，等.中藥發酵技術研究現狀與展望 [J].國外醫藥（抗生素分冊），2023，（6）：361-366， +378

[18]牛春.幾種抗生素發酵菌種產業化的新方法[J].國外醫藥 （抗生素分冊），2024，45（2）：73

[19]Liu Y S，WuJY.Modeling of Xanthophyllomyces dendrorhous growth on glucose and overflowmetabolism in batch and fed-batch cultures for astaxanthin production[J] Biotechnol Bioeng，2008，101：996-1004.

[20]ReyndersMB，Rawlings DE，Harrison STL.Demonstration ofthecrabtree effectin phaffarhodozyma duringcontinuous andfed-batchcultivation[J].BiotechnolLett，1997，19：549- 552.

[21]YamaneYI，HigashidaK，NakashimadaY，etal.Influence ofoxygen and glucose on primary metabolism and astaxanthinproductionbyPhaffiarhodozymainbatchand fed-batch cultures：kinetic and stoichiometric analysis[J]. AEM，1997，63（11）：4471-4478.

[22].劉運鈺，楊倫，季永新.有機硅基RAFT試劑制備聚醚改性 有機硅消泡劑[J].精細化工，2024，41（05）：1043-1049.

[23]唐李興.礦物油型消泡劑的技術進展[J].河南化工，2022， 39（10）：5-8.