基于網絡藥理學探討丹參-穿心蓮藥對治療冠心病心絞痛的分子作用機制

《中國心血管健康與疾病報告2020》1顯示，我國心血管病患病率處于持續上升階段，推算心血管病現患人數3.3億人，冠心病1139萬人。城鄉居民疾病死亡人數中 40% 死于心血管事件，為城鄉居民總死亡原因的首位，我國防治心血管疾病面臨極大挑戰。冠心病心絞痛是臨床常見和多發的心血管疾病，是由冠狀動脈供血不足、心肌缺血缺氧所致的胸痛綜合征，嚴重影響著居民的生命健康及生活質量[2。丹參是唇形科植物丹參的干燥根與根莖，《婦人明理論》認為其功善活血祛瘀“一味丹參散，功同四物湯”3]；穿心蓮為爵床科植物穿心蓮干燥地上部分，是具有代表性的清熱解毒中藥，兩者配合使用具有活血解毒的功效?，F代藥理學研究表明，丹參的活性成分主要有丹參酮類、酚酸類等[4]，穿心蓮的活性成分主要為穿心蓮內酯[5。有研究表明，丹參酮ⅡA能激活人臍靜脈內皮細胞中磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（AKT）信號通路，抑制白細胞介素-6（IL-6）單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）分泌，促進白細胞介素-8（IL-8）分泌[；丹參多酚酸可有效抑制人體血清溶性CD40配體（sCD40L）E-選擇素（E-selectin）、P-選擇素（P-selectin）水平，具有改善內皮功能和抗炎穩斑的作用[7。另有研究表明，穿心蓮可通過抑制核因子-kB（NF- ?κB ）、信號傳導轉錄激活因子3（STAT3）等信號通路的激活，減少下游炎性因子合成與釋放[8。中醫藥治療疾病具有多靶點、多途徑的特點。本研究通過網絡藥理學對丹參-穿心蓮治療冠心病心絞痛的潛在靶點及通路進行篩選，分析丹參-穿心蓮配伍用藥治療冠心病心絞痛的作用機制，以期為后續心絞痛的中醫藥研發及臨床治療提供理論依據。

1資料與方法

1.1藥物化學成分及靶點篩選

通過中藥系統藥理學數據庫和分析平臺[9]（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）檢索丹參、穿心蓮兩味中藥的主要成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB） 230% 及藥物相似性（drug-likeness， 作為閾值，篩選出所需的活性化合物及對應的蛋白靶點。然后將在TCMSP數據庫中獲取的蛋白靶點輸入UniProt數據庫[10]（https：/www.uniprot.org/）限定物種為人類（human）和已驗證的（reviewed），獲得靶點對應的基因信息文件并采用Cytoscape3.9.1軟件構建\"藥物-化合物-靶點基因網絡圖”。

1.2心絞痛疾病靶點預測及藥物-疾病交集靶點篩選

以“anginapectoris”為關鍵詞在GeneCards數據庫[11]（https：//www.genecards.org/）中檢索，設置Relevancescore ≥1 為篩選條件，獲取與心絞痛相關度較高的疾病靶點基因。將藥物潛在作用靶點基因及心絞痛相關靶點基因輸入Venny2.1在線軟件（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），繪制韋恩圖并得到藥物疾病共同靶點。

1.3蛋白-蛋白互相作用（PPI）網絡構建

將藥物-疾病共同靶點輸入STRING11.5平臺[12]（https：//cn.string-db.org/），設置最低要求互動得分（minimumrequiredinteractionscore）大于O.4，構建PPl網絡圖。下載網絡圖的TSV（listsonlyone-wayedges：A-B）文件導入Cytoscape軟件，設置度值（Degree） ≥2 倍中位數作為關鍵靶點，按照Degree值由大到小從內向外構建同心圓PPI網絡。

1.4基因本體（GO）功能富集分析、京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

將藥物和疾病的共同關鍵靶點導人Metascape平臺[13]（https：//metascape.org/），物種設置為H.sapiens（91），即可獲得GO功能富集分析及KEGG信號通路富集分析結果。采用微生信在線軟件（https：//wwwbioinformatics.com.cn/）繪制GO[生物過程（BP）37個細胞組分（CC）、53個分子功能（MF）J富集三合一柱狀圖及KEGG富集分析氣泡圖。

1.5構建藥物-共同靶點-通路網絡

將藥物-疾病共同作用靶點及KEGG富集通路名稱輸人Cytoscape3.9.1軟件，根據Degree值設置藥物、基因靶點和通路的圖形大小。其中綠色矩形代表靶點，橢圓形代表藥物成分，紅色矩形代表通路，構建藥物-共同靶點-通路網絡。

2結果

2.1丹參-穿心蓮化學成分篩選及靶點信息獲取通過TCMSP數據庫篩選出化合物82個，其中丹參59個、穿心蓮23個，詳見表1、表2。分別獲取各化合物的靶蛋白后去除重復靶點輸入UniProt數據庫進行基因注釋，最終共得到153個藥物作用靶點基因。將藥物名稱、TCMSP中篩選出的化合物以及UniProt中獲取的靶點基因導人Cytoscape3.9.1軟件構建丹參、穿心蓮-成分-靶點相互作用網絡圖（見圖1），設置節點大小與Degree呈正相關。通過Cytoscape軟件分析得到含有224個節點、1319個相互關系的網絡圖，其中排名前5位的化合物為毛地黃黃酮（luteolin）、漢黃芩素（wogonin）、丹參酮ⅡA（tanshinoneIIA）、丹參酮（salviolone）二氫丹參酮內酯（dihydrotanshinlactone）。

表1丹參化合物

表2穿心蓮化合物

圖1丹參、穿心蓮-成分-靶點相互作用網絡圖

（橙色圓形節點代表藥物名稱；綠色菱形節點代表丹參活性成分；紅色菱形節點代表穿心蓮活性成分；藍色圓形節點代表藥物作用靶點；連線代表藥物、化合物及靶點之間的相互作用關系）

2.2疾病相關靶點預測及藥物-疾病靶點韋恩圖

在GeneCards數據庫中檢索到的心絞痛相關靶點 基因經過Relevancescore篩選后，將目標疾病關聯靶點與藥物靶點導入Venny2.1繪制韋恩圖，得到疾病與藥物共同作用靶點基因。GeneCards數據庫中共獲得1707個疾病相關靶點，丹參、穿心蓮兩味藥有153個作用靶點，兩者韋恩圖取交集獲得91個共同靶點。詳見圖2。

圖2藥物-疾病共同靶點韋恩圖

2.3 構建PPI網絡

將韋恩圖中交集得到的91個藥物疾病共同靶點導人STRING平臺中構建丹參-穿心蓮治療心絞痛潛在靶點的PPI網絡（見圖3），網絡中共有90個節點和1305個相互作用線條。將PPI網絡中度值排名前20位靶點排序繪制成條形圖（見圖4）。選取Degree值≥2倍中位數得到9個可能為丹參-穿心蓮治療心絞痛的核心靶點，分別為蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）白細胞介素6（IL6）、腫瘤壞死因子（TNF）、轉錄因子TP53（TP53）、血管內皮生長因子A（VEGFA）雌激素受體（ESR1）、STAT3、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3（CASP3）、FOS原癌基因（FOS）。

圖3丹參、穿心蓮治療心絞痛的PPI網絡圖

圖4PPI網絡中Degree值排名前20位靶點

2.4共同靶點基因GO及KEGG富集分析

將91個共同靶點基因導入Metascape平臺進行GO及KEGG富集分析分別獲得833個GO條目和149個KEGG條目。GO功能富集分析包括BP、CC、MF3個方面。其中BP富集結果包括648個條目，主要富集在轉錄調控、基因表達、內皮增殖、凋亡過程、炎癥反應、缺氧反應、血管舒縮等方面；CC富集結果共包含68個條目，集中在質膜、高分子復合物、細胞表面、薄膜筏、受體復合體、突觸前膜、突觸后膜、胞膜窖、蛋白激酶全酶復合物等方面；MF富集結果共有117個條目，主要涉及蛋白結合、相同蛋白結合、酶結合、蛋白質同二聚活性、蛋白激酶結合、轉錄因子結合、蛋白酶結合、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子活性，配體激活的序列特異性DNA結合、類固醇結合、血清素結合等方面。根據 P 值大?。?Plt;0.05 將排名前10位的富集條目繪制三合一條形柱狀圖。詳見圖5。

圖5 GO功能富集分析

將KEGG通路富集分析結果根據信號通路中富集的基因數目進行降序排序，根據 P 值大小進行升序排序，將排序處理后的前20條通路進行可視化處理（見圖6）。圖中Y軸為富集條目； x 軸為GeneRatio，為通道富集基因數占總基因數的比例；圖中顏色代表 P 值變化，顏色越偏紅 P 值越小，富集結果越明顯；圖中氣泡大小代表基因數，氣泡越大代表通路上富集的基因越多。結果顯示，基因主要富集在PI3K-AKT信號通路（PI3K-AKTsignalingpathway）糖尿病并發癥中的糖基化終末產物及其受體（AGE-RAGE）信號通路（AGE-RAGEsignalingpathwayindiabeticcomplications）、白細胞介素-17（IL-17）信號通路（IL-17 signaling pathway）等。

圖6KEGG信號通路富集分析

2.5共同靶點-通路網絡的構建

將KEGG信號通路按照 P 值大小升序排序，選取前20條信號通路構建藥物-共同靶點-通路網絡圖（見圖7）。如圖7所示，該網絡中包括91個藥物疾病共同靶點，82個藥物成分，20條信號通路，199個節點和967條相互作用連線。其中節點越大表示此節點與其他節點關聯更多，Degree值越大在網絡中發揮更重要的作用。排名前10位的靶點節點分別為AKT1、TP53、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、周期蛋白基因1（CCND1）抑制因子α（NFKBIA）細胞凋亡調節因子（BAX）細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶（CASP）9、CASP3、STAT3。

圖7共同靶點-通路網絡圖

（綠色矩形代表共同靶點；紅色矩形代表通路）

3討論

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是以動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）易損斑塊破裂導致血栓形成為基礎的一種心腦血管血栓性疾病。其中，心絞痛是臨床常見病和多發病，中醫學稱之為“胸痹”，病機為血脈瘀阻[14]。但現代醫學研究發現，血栓形成過程中不僅有血小板病理性活化及黏附、聚集等“血瘀證”的表現，也有組織缺血壞死，炎性介質增多等“毒”邪致病的現象[15-16]。丹參活血通經、祛瘀止痛，穿心蓮性味苦寒，清熱解毒，兩者合用具有活血解毒之功，已被證實治療冠心病心絞痛效果優于單純活血化瘀。本研究基于網絡藥理學分析活血解毒藥對丹參-穿心蓮治療冠心病心絞痛靶點和信號通路。本研究共篩選出82個丹參-穿心蓮的有效成分，91個藥物疾病共同靶點，按照Degree值篩選出9個核心靶點，主要涉及等方面，包括AKT1、IL6、TNF、TP53、VEGFA、ESR1、STAT3、CASP3、FOS。

AKT1是絲/蘇氨酸蛋白激酶AKT3個亞型之一，是PI3K-AKT信號通路下游重要的靶激酶，參與調控血管內皮和平滑肌細胞的凋亡、增殖、遷移與炎癥反應等多個過程，在動脈粥樣硬化、血管重塑等心血管疾病中扮演重要角色[17]。IL6是一種的炎性細胞因子，是白細胞介素家族的核心成員，可以調節人體炎癥反應和免疫應答，還可以促進血小板活化及血液黏稠度，促進血管內皮增生，在不穩定性冠心病的發生和發展過程中發揮重要作用[18]。TNF是巨噬細胞分泌的一種上游促炎因子，可激活 NF-κB 信號通路，通過復雜的細胞因子網絡促進炎性細胞聚集和活化，加劇動脈粥樣硬化炎癥程度[19]。TP53是一種轉錄因子蛋白，能夠激活等不同靶基因促進細胞自噬，調節血管生成的速度與程度2]。VEGFA是血管內皮生長因子，血漿中VEGFA水平增高時能夠促進血管內皮細胞增殖和新血管生成[21]。ESR1是雌激素受體，其編碼的 ERα 能夠舒張血管、促進心肌細胞凋亡、刺激新血管的形成[22]。STAT3是一種功能多樣的信號傳導轉錄激活因子，能被多種刺激因素激活形成多條信號通路參與心血管疾病的細胞壞死、炎癥反應等病理過程[23]。Caspase-3是Caspase蛋白家族的一員，在細胞凋亡過程中扮演執行者的角色，當受到凋亡刺激后Caspase-3激活和過表達會促進細胞加速凋亡[24-25]。FOS表達產物活化后可形成轉錄因子核酸內切酶-1（AP-1），AP-1可激活細胞核DNA轉錄及核蛋白合成，調控血管細胞的增殖和分化[26]。

在冠心病心絞痛發生發展過程中，炎癥反應貫穿始終。本研究通過構建PPI網絡圖發現，丹參-穿心蓮通過降低IL6、TNF等炎性因子水平，抑制NF- Π_κB 信號通路激活，減輕炎癥刺激對血管內皮結構與功能的損傷，減緩冠心病病理基礎-動脈粥樣硬化及血栓形成的進展。心絞痛病人冠狀動脈狹窄可能導致部分心肌供血不足，心肌細胞缺血壞死，丹參-穿心蓮可以調控Caspase-3蛋白表達，抑制心肌細胞凋亡，減輕心肌缺血損害，盡可能保留更多有功能的心肌。丹參-穿心蓮還可以調控TP53、VEGFA、FOS等基因表達調節血管內皮細胞增殖和血管生成。

GO富集分析結果顯示，丹參-穿心蓮治療冠心病心絞痛的生物進程集中在轉錄調控、基因表達、內皮增殖、凋亡過程、炎癥反應、缺氧反應、血管舒縮等方面。KEGG分析結果表明，疾病藥物共同靶點主要集中在PI3K-AKT、AGE-RAGE、IL-17等信號通路。根據共同靶點-通路網絡圖，可以得出26個靶點參與了PI3K-AKT信號通路，其中關鍵靶點有IL6、TP53、AKT1、VEGFA；有20個靶點參與了AGE-RAGE信號通路，其中關鍵靶點有CASP3、VEGFA、TNF、AKT1、IL6、STAT3；16個靶點參與了IL-17信號通路，其中關鍵靶點有IL6、FOS、CASP3、TNF。

PI3K/AKT信號通路可調控血管平滑肌細胞及內皮細胞增殖、凋亡及血管再生等生理病理過程，與冠狀動脈內環境關系密切[27]。有研究表明，PI3K/AKT可促進VEGF分泌，保護血管內皮和促使新血管生形成[28]。此外PI3K/AKT還可以激活 NF-κB 信號通路，促進IL-6、TNF- α 等炎癥細胞因子聚集活化，引起炎癥的聯級瀑布反應[29-30]。冠狀動脈粥樣硬化是冠心病心絞痛的病理基礎，慢性炎癥反應貫穿動脈粥樣硬化始終，平滑肌細胞向血管內膜的增殖和遷移是動脈粥樣硬化形成的重要原因。AGE-RAGE通路激活后可提高血管壁炎性因子TNF- α IL-8及IL-6等濃度，從而促進冠狀動脈粥樣硬化的發生發展[31]。向敏等[32]研究發現，AGE-RAGE通路阻斷后，血管平滑肌細胞增殖遷移得到明顯抑制。IL-17通路激活后促進1L-6、IL-8、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）等細胞因子表達并募集浸潤在血管局部，加重心血管內皮細胞損傷，加速動脈粥樣硬化過程[33]

綜上所述，丹參-穿心蓮藥對通過AKT1、IL6、TNF、TP53、VEGFA、ESR1、STAT3、CASP3、FOS等核心靶點與PI3K-AKT、AGE-RAGE及IL-17等多條關鍵信號通路發揮抑制炎癥反應與血小板活化、調節細胞增殖與凋亡、舒張血管等作用來治療冠心病心絞痛。本研究為后續開展丹參-穿心蓮治療冠心病提供了新思路，后續還需進行體內、體外試驗加以驗證。

參考文獻：

[1]國家心血管病中心.中國心血管健康與疾病報告2020[J].心肺血管病雜志，2021，40（10）：1005-1009.

[2]杜中平，石可松.血府逐瘀湯配合針灸治療冠心病心絞痛的療效研究[J].中國全科醫學，2021，24（S1）：158-160.

[3]林岷瑜“一味丹參散，功同四物湯\"之管見[C].：2008臨床中藥學學術研討會論文集，2008：137-138.［4］萬新煥，王瑜亮，周長征，等.丹參化學成分及其藥理作用研究進展[J].中草藥，2020，51（3）：788-798.

[5]張曉，唐力英，吳宏偉，等.穿心蓮現代研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2018，24（18）：222-234.

[6]童星麗，談勇，殷燕云，等.基于PI3K/Akt信號通路探討丹參酮ⅡA調控血管內皮細胞活化因子表達的實驗研究[J].中國中藥雜志，2022，47（13）：3589-3596.[7］楊溶海，方長庚，梁建光.丹參多酚酸鹽對急性心肌梗死患者血清sCD40L、E-選擇素、P-選擇素的影響[J].中國動脈硬化雜志，2014，22（5）：502-504.[8］秦慧真，林思，鄧玲玉，等.穿心蓮內酯藥理作用及機制研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2022，28（6）：272-282

[9]RUJL，LIP，WANG JN，et al.TCMSP：a database systemspharmacology fordrug discovery from herbalmedicines[J].Journal Cheminformatics，2014，6：13.

[10]UniProt： theuniversal protein knowledgebase in 2021[J].NucleicAcids Res，2021，49（D1） ：D480-D489.

[11]STELZERG，ROSENN，PLASCHKESI，etal.The GeneCardssuite：from genedata mining to disease genomesequenceanalyses[J].CurrentProtocols in Bioinformatics，2016，54（1）：1.30.1-1.30.33.

[12]SZKLARCZYKD，MORRIS J H，COOK H，etal.The STRINGdatabasein 2017： quality-controlled protein-protein association networks，made broadly accessible[J].Nucleic Acids ，2017，45（D1）：D362-D368.

[13]ZHOU Y Y， ZHOU B， PACHE L， et al. Metascape provides abiologist-orientedresource forthe analysis systems-leveldatasets[J].Nature Communications，2019，10：1523.

[14]陳可冀，李連達，翁維良.血瘀證與活血化瘀研究[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2005，3（1）：1-2.

[15]馬曉娟，郭春雨，殷惠軍，等.活血及活血解毒配伍中藥對急性心肌梗死大鼠模型血小板活化、炎癥反應及凝血狀態的影響[J].中國中西醫結合雜志，2014，34（11）：1329-1334.

[16］劉龍濤，陳可冀，付長庚，等.從“因瘀致毒\"談冠心病的病因病機[J].中國中西醫結合雜志，2015，35（11）：1378-1380.

[17]陳凡，葉俊梅，張玉彬.Akt在心血管疾病中的調控作用[J].藥學研究，2018，37（5）：291-294.

[18］李擁軍，都軍，劉素云，等.血漿細胞因子水平與不穩定型心絞痛厄應分層時相大性[J」.臨床心Ⅲ官病殺志，20U5，2I（0）332-334.

[19]錢承嗣，蔣峻.注射用丹參多酚酸聯合曲美他嗪治療老年冠心病心絞痛患者療效及對炎性因子、血管內皮損傷和血脂的影響[J].中國老年學雜志，2021，41（21）：4614-4617.

[20]林超，劉兆國，錢星，等.自噬在心血管疾病中的作用研究進展[J].中國藥理學通報，2014，30（10）：1347-1349.

[21]尹晶，吳清華，王鵬，等.下肢動脈硬化閉塞癥患者介入術后白細胞介素-8、白細胞介素-18、血管內皮細胞生長因子檢測及意義[J].介入放射學雜志，2021，30（2）：132-135.

[22］馬波江，曹曄，朱艷.雌激素受體基因與微小RNA在冠心病中的相關性[J].中國老年學雜志，2015，35（16）：4481-4483.

[23]許爽，倪煥爾，陳航煒，等.STAT3與動脈粥樣硬化的研究進展[J].醫學新知，2020，30（5）：383-388.

[24]CRYNSV，YUAN JY.Proteases to die for[J].Genesamp;Development，1998，12（11）：1551-1570.

[25]ZHANG Y，GOODYER C，LEBLANC A.Selective and protractedapoptosis in human primary neurons microinjected with activecaspase-3，-6，-7，and-8[J].The Journal Neuroscience，2000，20（22）：8384-8389.

[26]徐會圃，劉長梅，馮義柏.高同型半胱氨酸血癥對球囊損傷大鼠頸動脈核轉錄因子NF- ?κB 和原癌基因表達的影響[J].第四軍醫大學學報，2006，27（6）：501-504.

[27]楊立霞，王楠，劉洋.PI3K/Akt信號通路調節心臟功能的研究進展[J].心臟雜志，2018，30（3）：344-347.

[28]ZHOU Z，ZHAO C K，WANG L X，et al.A VEGFR1 antagonisticpeptide inhibits tumor growth and metastasis through VEGFR1-Pl3K-AKT signalingpathway inhibition[J].American JournalCancer，2015，5（10）：3149-3161.

[29]李咪咪，漢京霞，孫濤，等.含笑內酯衍生物ACT001對肺纖維化的治療作用研究[J].中國藥理學通報，2020，36（12）：1665-1673.

[30]尹琴，楊潔，范存愈，等.化纖散結復方顆粒通過PI3K/AKT/NF-kB信號通路改善大鼠矽肺纖維化[J].中國職業醫學，2022，49（③）：272-279.

[31]JANDELEIT-DAHM K，WATSON A，SORO-PAAVONEN A.TheAGE/RAGE axis indiabetes-accelerated atherosclerosis[J]. and ExperimentalPharmacologyamp;Physiology，2008，35（3）：329-334.

[32]向敏，張雅琴，吳萍萍，等.AGEs-RAGE通路阻斷對血管平滑肌細胞遷移能力的影響[J].中國藥科大學學報，2016，47（2）：199-203.

[33］劉福麗，霍小森，劉芳.Th17/IL-17通路在穩定性冠心病患者心室重構中的作用[J].中國免疫學雜志，2019，35（8）：982-985.（收稿日期：2024-01-22）