基于 NF-κB 信號通路探討麝香通心滴丸治療痰熱瘀阻證冠心病的作用機制

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病簡稱冠心病（coronaryheartdisease，CHD），是臨床常見的高發病率、高致死率疾病，是全球每年導致人類死亡的重大疾患之一，也是醫療耗費最高的疾病1。冠心病是臨床常見病，其主要病理變化是動脈粥樣硬化[。關于動脈粥樣硬化發病學說非常多，目前認為炎性因子引起內皮損傷而致一系列病理變化是動脈粥樣硬化的主要發病機制[]。

中醫認為冠心病歸屬于“胸痹心痛”等范疇，病機主要概括為本虛標實。本虛為氣血陰陽虧虛，尤以氣虛居多，標實為氣滯、寒凝、痰濁、血瘀等，尤以血瘀為要。研究表明，中醫藥治療冠心病的機制具有多靶點、多層次的特點，如改善血液理化性質、降低血脂、保護內皮功能、抑制血管平滑肌細胞增殖、防治血小板聚集、改善心肌收縮力、抑制冠狀動脈局部炎癥反應、相關基因表達的調控等[4-5]。

麝香通心滴丸是痰熱癡阻證冠心病治之有效的中成藥，對其防治冠心病的機制研究不斷增加。研究顯示，核因子 ?κB（NF-κB） 信號轉導通路是各個炎癥發生發展的主要通路。冠心病是嚴重的血管疾病，NF-κB信號通路在冠心病的發生和發展中發揮重要作用8。痰熱瘀阻證大多伴隨炎癥反應，麝香通心滴丸治療痰熱瘀阻證冠心病有效，故麝香通心滴丸對痰熱瘀阻證冠心病的治療機制與NF- κB 信號通路降低炎癥反應是否有密切關系。因此，本研究基于 NF-κB 信號傳導通路相關因子探討麝香通心滴丸治療痰熱瘀阻證冠心病的機制，為中醫藥治療冠心病的機制研究提供參考。

1材料與方法

1.1 實驗動物

無特定病原體（SPF）級SD雄性大鼠69只，體質量 180～2009 ，由河南省動物實驗中心提供，生產許可證書：SCXK（豫）2017-0001。采用尾部記號筆標記動物，飼養與于河南中醫藥大學動物實驗中心獨立通風系統（IVC）動物房，每籠3只大鼠，日光燈光源控制，12h/12h 晝夜節律，環境相對濕度控制在 40%～60% ，室溫控制在 20～25^°C 。實驗動物設施使用許可證號：SYXK（豫）2015-0005。本研究獲得河南中醫藥大學第三附屬醫院倫理委員會批準（編號：2021H2-006）。

1.2 實驗藥物

麝香通心滴丸（內蒙古康恩貝藥業有限公司圣龍分公司，生產批號：170104），卡拉膠Solarbio（生產批號：528E021），青霉素鈉針（華北制藥，生產批號：F8112103），水合氯醛（國藥試劑有限公司，生產批號：20180304），維生素D3（北京索萊寶科技有限公司，生產批號：V8070-1g），酵母懸液（安琪酵母，生產批號：81001639）， 75% 醫用乙醇（生產批號：20190103），0.9% 氯化鈉注射液[華仁藥業（日照）有限公司，生產批號：19052290，規格：每瓶 100mL] 。

1.3 實驗試劑

大鼠白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子- α （TNF- α ）、核因子 -κB（NF-κB） p65酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均購自深圳市達科為生物工程有限公司，生產批號分別為1310122、1310602、1317202、RTFI00989。低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）測試盒均購自南京建成生物工程研究所，生產批號分別為A113-1-1、A112-1-1、A110-1-1、A111-1-1。

1.4儀器設備

精密電子天平（上海天平儀器廠）；酶標儀（Bio-rad680）；心電圖機（BL-420F）；超低溫冰箱（SANYO公司）；低溫高速離心機（德國SIGMA）；大鼠灌胃針（北京冀諾泰ZH06-T16）；醫用凈化工作臺（蘇州馮氏CJ-2F）；獨立送風隔離籠具（蘇州馮氏IⅣC-Ⅱ）。

1.5 實驗方法

1.5.1 實驗分組

從69只雄性SPF級SD大鼠選取9只作為空白組，余60只大鼠通過藥物和手術復制痰熱瘀阻證冠心病模型，假手術組9只，余冠狀動脈結扎手術成功且存活大鼠隨機分成模型組、麝香通心滴丸低劑量組（低劑量組）麝香通心滴丸中劑量組（中劑量組）麝香通心滴丸高劑量組（高劑量組）。實驗過程中有6只大鼠死亡，其中模型組、高劑量組各2只，低劑量組、中劑量組各1只。

1.5.2 造模方法

本實驗采用高脂飼料、維生素D3、卡拉膠、酵母懸液、冠狀動脈結扎的方式復制冠心病痰熱瘀阻證模型。心電圖以ST段進行性抬高甚至弓背向上（較正常至少抬高 2mV， 為評定結扎成功與否標準。

1.6 實驗給藥

造模結束后，麝香通心滴丸低劑量組、中劑量組、高劑量組分別按麝香通心滴丸 20，30，40mg/kg 灌胃給藥；空白組、假手術組、模型組按 10mL/kg 等量生理鹽水灌胃。

1.7 觀察指標

1）觀察記錄大鼠的進食、進水、排便、排尿、毛發情況，包括大鼠的爪色、唇色、耳色、糞質及體質量；2）觀察冠狀動脈結扎手術前后及實驗結束時大鼠心電圖的變化；3）采用酶法測定各組大鼠血脂（TG、TC、LDL-C、HDL-C）水平;ELISA法檢測IL-1β、IL-6、TNF- α 、NF-KB蛋白水平。

1.8 統計學處理

采用SPSS19.0統計軟件導入peidate3.0中的數據。符合正態分布的定量資料以均數 ± 標準差（x±s）表示，采用方差分析（ANOVA），如不滿足正態分布采

用數據轉換法，兩兩比較采用SNK法，方差不齊采用Dunnet3法。以 Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1冠狀動脈結扎手術前后心電圖ST段拾高比較 與空白組比較，模型組大鼠心電圖ST段明顯升高 （ Plt;0.05 ，提示大鼠心肌缺血模型成功。詳見表1。

單位：mV

表1冠狀動脈結扎手術前后心電圖ST段比較（x士s）

注：與空白組相比， ① 1lt;0.05 。

2.2各組大鼠一般情況

空白組大鼠爪色、唇色、耳色呈淡紅色，糞色棕黃，糞質正常；與空白組相比，模型組大鼠造模后，體型肥胖，術后有短時間減重，4～5d后恢復正常，體溫升高，被毛蓬松、無澤，大便黏膩臭穢，尾部有明顯瘀血，血部位逐漸壞死脫離，耳、唇、舌、爪顏色深紫。干預后，麝香通心滴丸低劑量組、中劑量組、高劑量組與模型組相比，耳、唇、舌、爪顏色不同程度變淡，大便成型，黏膩臭穢程度減輕。

2.3各組血脂水平比較

與空白組相比，模型組和假手術組TC、TG、LDL-C水平明顯升高，HDL-C水平明顯降低，差異均有統計學意義（ Plt;0.05 ，模型組與假手術組比較差異無統計學意義（ Pgt;0.05 ；與模型組比較，麝香通心滴丸各劑量組TC、TG、LDL-C水平明顯降低，HDL-C水平明顯升高，差異均有統計學意義（ Plt;0.05 ；與低劑量組相比，中劑量組和高劑量組TC、TG、LDL-C水平均明顯降低（ Plt;0.05 ，與中劑量組相比，高劑量組TG、LDL-C水平均明顯降低（ Plt;0.05） ，麝香通心滴丸各劑量組HDL-C水平比較差異無統計學意義 。詳見表2。

單位：mmol/L

表2各組血脂水平比較（x士s）

注：假手術組、模型組與空白組相比， ① （204號 Plt;0.05 ；低、中、高劑量組與模型組相比， ② （204號 Plt;0.05 ;中、高劑量組與低劑量組相比， ③ Plt;0.05 ；高劑量組與中劑量組相比， ④ （20號 Plt;0.05 。

2.4各組NF- κ_KB 信號通路相關因子IL-1β、IL-6水平 比較

與空白組相比，模型組IL-1 、IL-6水平明顯升高（ Plt;0.05? ;與模型組比較，中劑量組與高劑量組IL-1β、IL-6水平均有明顯下降（ Plt;0.05） ，低劑量組IL- 1β 、IL-6水平與模型組比較差異無統計學意義（ Pgt;0.05 ；中劑量組與高劑量組IL-1β、IL-6水平低于低劑量組，差異均有統計學意義（ Plt;0.05 ）。詳見表3。

2.5各組 NF-kB 信號通路相關因子TNF- α 、NF-kB水平比較

與空白組相比，模型組TNF- α NF- ?κB 水平明顯升高（ Plt;0.05 ；與模型組比較，中劑量組與高劑量組TNF- α 、NF- κB 水平均有明顯下降（ Plt;0.05 ，低劑量組TNF- α NF- κB 水平與模型組比較差異無統計學意義 Pgt;0.05 ；中劑量組與高劑量組TNF- α 、NF- κB 水平低于低劑量組（ Plt;0.05 。詳見表4。

表4各組TNF- 、NF-KB水平比較 單位： pg/mL

注：假手術組、模型組與空白組相比， ① Plt;0.05 ；低、中、高劑量組與模型組相比， ② Plt;0.05 ；中、高劑量組與低劑量組相比， ③ Plt;0.05 。

3討論

隨著社會環境與飲食等因素的改變，冠心病證候也呈現出新的特點，痰熱瘀阻已成為冠心病常見證候之一，冠心病痰熱瘀阻證也逐漸被重視。麝香通心滴丸由麝香、牛黃、蟾酥、熊膽粉、冰片、人參莖葉總皂苷、丹參組成，具有化痰清熱、活血祛瘀之功效，在理論上適用于痰熱瘀阻證[9。以人工麝香及人工牛黃共為君藥，蟾酥、冰片、熊膽粉為臣藥，人參莖葉總皂苷、丹參為佐藥，共奏化痰清熱、活血化瘀之功效。

現代藥理研究表明，麝香或其有效活性成分具有強心、保護心肌細胞等心血管系統作用，人工牛黃能降壓，蟾酥具有抗炎作用，熊膽能降血脂、抑制血栓形成，冰片減慢心率，降低心肌氧耗量，人參能降血脂、降糖[10-14]。麝香通心滴丸中麝香、冰片、人參皂苷、丹參等具有改善心肌細胞缺血癥狀及保護心肌的作用。有研究表明，麝香通心滴丸能有效改善病人中醫證候積分，在治療后總有效率為 100% ，且能明顯改善病人胸悶、心痛、氣短、肢體困重、多痰、面紅、目赤、口苦等癥狀，在平板運動試驗指標方面，能有效改善病人ST段最大下降幅度[15]。因此，麝香通心滴丸能有效改善冠心病痰熱癡阻證病人的臨床證候，因為其具有清熱化痰、活血通脈的功效。

研究表明，動脈粥樣硬化是一個血管受損后的炎癥反應過程[1]。動脈壁內皮細胞、平滑肌細胞與活性氧族、氧化低密度脂蛋白發生反應，以及大量炎性因子激活，構成了動脈粥樣硬化病理變化中最明顯的特征，因而炎癥貫穿了動脈粥樣硬化從血液中性粒細胞向血管壁聚集到動脈粥樣斑塊破裂始終的全過程。NF- Π_κB 參與炎癥過程中的多種信號傳導途徑，并且在動脈粥樣硬化晚期參與平滑肌細胞增殖的生長因子亦可由NF-κB 調控，因而認為NF- κB 的激活是動脈粥樣硬化發生發展的始動機制之一[17]。NF- ?κB 信號通路是由細胞因子介導的經典的信號傳導通路，對多種促炎性因子、黏附因子等表達起著關鍵的調控作用。

血管內皮細胞是動脈粥樣硬化進程中最先激活的細胞，且其效應部分通過NF- κB 途徑來實現[18]。在動脈粥樣硬化早期和中晚期，在內皮層完整或部分損傷的情況下均可見活化的NF- Π_κB 。血管內皮受損后，血管細胞黏附分子-1、細胞間黏附分子-1等表達增強是繼 NF-κB 活化后才顯現的，干預NF- ?κB 的活化可以抑制血管細胞黏附因子-1表達。動脈粥樣硬化進程中，NF- ?κB 的激活是平滑肌細胞的必經和始動環節[19]。平滑肌細胞從收縮表型向合成表型轉變，促進動脈粥樣硬化的進展。巨噬細胞貫穿于動脈粥樣硬化發生發展的全過程，具有識別T淋巴細胞抗原，清除血管壁積聚的有害物質，分泌多種生長因子及炎癥介質等功能活化的 NF-κB ，可調控多種巨噬細胞分泌的生長因子和細胞因子的基因表達，如TNF- ?α 白細胞介素-1（IL-1）、IL-6、白細胞介素-8（IL-8）白細胞介素-18（IL-18）組織因子和細胞間黏附因子等[20]。大量研究表明，IL-1β、IL-6和TNF- α 作為生物體炎癥反應的重要因子，不僅參與NF- ?κB 信號通路的激活，還是其表達的下游響應因子[21]，均與NF- ?κB 信號通路密切相關，可通過觀察IL-1β、IL-6、TNF- α 的表達情況反映藥物作用機制與 NF-κB 信號通路的相關性。

本研究結果顯示，與模型組相比，麝香通心滴丸低劑量組、中劑量組、高劑量組TC、TG、LDL-C明顯降低（ Plt;0.05 ，HDL-C明顯升高 Plt;0.05 ；中劑量組、高劑量組TC、TG、LDL-C均明顯低于低劑量組（ Plt; 0.05），高劑量組TG、LDL-C低于中劑量組（ ?Plt;0.05） 0說明麝香通心滴丸可改善血脂水平，減少內皮損傷。本研究結果還顯示，與模型組比較，中劑量組、高劑量組IL-1β、IL-6、TNF- α 均有明顯下降 Plt;0.05. ；中劑量組、高劑量組IL-1β水平低于低劑量組（ Plt;0.05 ，高劑量組IL-6和TNF- α 水平低于低劑量組（ Plt;0.05 ），中劑量組、高劑量組IL-6和TNF- α 水平比較差異無統計學意義（ Pgt;0.05 ）。提示中劑量麝香通心滴丸可以降低炎性因子IL- 1β 、IL-6和TNF- α 水平，目前認為多種因素導致炎性因子升高，引起內皮損傷是動脈粥樣硬化的主要發病機制，IL-1β、IL-6和TNF- α 為冠心病發病機制中關系密切的炎癥指標，提示麝香通心滴丸治療痰熱瘀阻證的冠心病的機制與抑制或降低炎癥物質的產生和釋放有關。

本研究結果還顯示，與空白組相比，假手術組和模型組NF- ?κB 表達明顯升高（ Plt;0.05 ，模型組和假手術組比較差異無統計學意義（ Pgt;0.05 ；與模型組相比，中劑量組、高劑量組NF- κB 表達均有明顯下降（ Plt; 0.05）；中劑量組、高劑量組NF- Π_κB 表達均低于低劑量組（ Plt;0.05） ，中劑量組、高劑量組 NF-κB 表達比較差異無統計學意義（ Pgt;0.05） 。提示假手術會造成NF- Π_κB 的表達增加，中劑量麝香通心滴丸可減少NF- Π_κB 的表達，不會隨著用藥劑量的增加而增加療效。說明麝香通心滴丸治療痰熱瘀阻證冠心病與 NF-κB 蛋白有密切關系，麝香通心滴丸通過抑制或減少 NF-kB 的含量，調控 NF-κB 信號通路炎癥相關因子表達而阻斷炎性因子的進一步產生，控制冠心病的發展。

綜上所述，通過麝香通心滴丸可降低IL-1β、IL-6、TNF- α NF- Π_κB 表達，提示麝香通心滴丸能有效抑制炎性因子IL-1β、IL-6、TNF- α 的產生和釋放以及減少NF- ?κB 蛋白的表達。根據 NF-κB 信號通路傳導的特點，可以推測麝香通心滴丸降低了其活化的 NF-κB 蛋白含量，進而抑制了炎癥相關基因表達，阻斷了NF- Π_κB 信號通路的負反饋，從而減少炎性物質的進一步釋放，炎癥物質的釋放減少， NF-kB 信號通路的經典通路會因為IkB的抑制作用而停止 NF-kB 蛋白的進一步活化，再加上麝香通心滴丸具有降脂、降炎性因子的作用，可減少內皮損傷，從而達到治療的效果。總之，麝香通心滴丸可通過調節炎性因子IL-1β、IL-6、TNF- α 含量和NF- ?κB 蛋白的表達，激活NF- κB 信號轉導通路，降低心肌細胞凋亡，對痰熱瘀阻證冠心病大鼠具有一定的保護作用，但其更深的機制還需進一步研究。

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（本文編輯郭懷印）