基于mTOR通路探討雷帕霉素對(duì)高磷誘導(dǎo)的大鼠血管外膜細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響

血管鈣化是一種引發(fā)血管硬化和功能障礙的疾病，其發(fā)生可歸因于動(dòng)脈壁的被動(dòng)鈣沉積和主動(dòng)成骨[1]。血管鈣化的嚴(yán)重程度通常伴隨著不良心血管事件風(fēng)險(xiǎn)的增加和死亡率的升高[2]。盡管已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究來探索血管鈣化的機(jī)制，但仍有大量的細(xì)胞生物學(xué)途徑尚未被確定。當(dāng)前研究認(rèn)為血管鈣化主要包括血管內(nèi)膜鈣化和中膜鈣化3，而在臨床實(shí)踐中，通過CT血管成像（CTA）或冠狀動(dòng)脈造影術(shù) + 冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)超聲等檢查，發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)膜、中膜和外膜均有不同程度的鈣化。因此，血管外膜已成為治療血管功能異常的新靶點(diǎn)。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，屬磷脂酰肌醇3-激酶相關(guān)激酶家族，參與多種細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)傳導(dǎo)[45]。mTOR信號(hào)通路在成骨分化中起著重要調(diào)控作用[6-7]。Zhan等[8通過高磷誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞體外鈣化研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞鈣化時(shí)mTOR表達(dá)增加，抑制mTOR表達(dá)后，細(xì)胞鈣化程度減輕。由此可見，mTOR通路在高磷誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞鈣化中可能具有重要調(diào)節(jié)作用。然而mTOR通路在血管外膜成纖維細(xì)胞鈣化過程中的調(diào)控作用尚未見報(bào)道。本研究以高磷誘導(dǎo)建立大鼠血管外膜鈣化模型，檢測(cè)磷酸化mTOR（p-mTOR）及鈣化相關(guān)因子成骨相關(guān)分子核心結(jié)核因子α1（Cbfα1）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）的表達(dá)，進(jìn)一步給予mTOR抑制劑雷帕霉素干預(yù)，以闡明mTOR通路在血管外膜鈣化中可能的調(diào)控作用。

1材料與方法

1.1試劑

胎牛血清購自翊圣生物；青霉素、鏈霉素均購自Gibco（美國）;茜素紅S溶液、 β.ββ -甘油磷酸、抗壞血酸、地塞米松、雷帕霉素均購自Sigma（美國）；抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、p-mTOR（S2448）Cbfα1和BMP2抗體（CST），堿性磷酸酶（ALP）檢測(cè)試劑盒、鈣（Ca）檢測(cè)試劑盒均購自南京建城生物工程研究所；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）試劑盒均購自TAKARA。

1.2大鼠血管外膜細(xì)胞分離與培養(yǎng)

采用組織外植體培養(yǎng)法獲得大鼠血管外膜成纖維細(xì)胞[9]。取8周齡雄性Wistar-Kyoto大鼠胸主動(dòng)脈，去除內(nèi)膜和中膜后，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）將外膜漂洗3次，將外膜剪成小塊（ （1～2mm³ ），置于培養(yǎng)皿中。使用添加 10% 胎牛血清（Gibco）、 青霉素和0.1mg/mL 鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco）在 、 5% （204 CO₂ 的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞增殖至80%～90% 融合時(shí)，用 0.25% 胰酶消化傳代。使用第3代～第6代的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究獲得深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（編號(hào)：2021045DW）。

1.3體外鈣化模型的建立

使用添加 10% 胎牛血清，10mmol/L β -甘油磷酸鈉， 0.05mmol/L 抗壞血酸和 100mmol/L 地塞米松的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠血管外膜細(xì)胞，3d更換1次新鮮培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng) 15d 。

1.4 細(xì)胞分組

將第3代～第6代細(xì)胞以 5×10⁵/mL 的密度接種于 3.5cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿，分為對(duì)照組、造模組、雷帕霉素低濃度組、雷帕霉素高濃度組。對(duì)照組：高糖DMEM培養(yǎng)基 +10% 胎牛血清；造模組：高糖DMEM培養(yǎng)基 +10% 胎牛血清 +10mm°l/L β -甘油磷酸鈉 +0.05 mmol/L抗壞血酸- +100mmou 地塞米松；雷帕霉素低濃度組：高糖DMEM培養(yǎng)基 +10% 胎牛血清 +10 mmol/L β -甘油磷酸鈉 +0.05mmol/L 抗壞血酸 + 100mmol/L地塞米松 雷帕霉素；雷帕霉素高濃度組：高糖DMEM培養(yǎng)基十 10% 胎牛血清十 -10min°VL β -甘油磷酸鈉 +0.05mmol/L 抗壞血酸 + 100mmol/L地塞米松 雷帕霉素。連續(xù)培養(yǎng)15d后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.5 ALP活性測(cè)定

細(xì)胞鈣化誘導(dǎo)15d后，棄去培養(yǎng)基， 1× 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗細(xì)胞3次，加入裂解液 500μL （ 1% TritonX-100），使用移液槍充分吹打均勻，冰上裂解 40min 后，將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000r/min離心 5min ，取上清液。根據(jù)試劑盒說明書檢測(cè)上清液中ALP活性及總蛋白含量。

1.6細(xì)胞內(nèi)鈣含量檢測(cè)

細(xì)胞鈣化誘導(dǎo)15d后，棄去培養(yǎng)基， 1×PBS 洗細(xì)胞3次，每孔加入 500μL0.6mol/L 鹽酸 4^°C 脫鈣過夜，取上清，根據(jù)鈣測(cè)試試劑盒說明書檢測(cè)鈣含量。將脫鈣后的細(xì)胞用預(yù)冷PBS洗3次，每孔加入 500μL NaOH/0.1% 十二烷基硫酸鈉（SDS），使用移液槍充分吹打均勻，冰上裂解 40min 后，將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中， 12000r/min 離心 5min ，取上清液，用二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)定細(xì)胞總蛋白含量。

1.7茜素紅S染色

細(xì)胞鈣化誘導(dǎo)15d后，棄去培養(yǎng)基，洗細(xì)胞3次，加人 0.5mL4% 多聚甲醛室溫固定 15min 1×PBS 洗3次，加人 1mL0.1% 茜素紅染液室溫孵育 15min ，棄去染液，雙蒸水洗3次，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。1.8實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)

細(xì)胞鈣化誘導(dǎo)后，棄去培養(yǎng)基， 1×PBS 洗細(xì)胞3次，使用TrizoI提取總RNA，使用TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將所提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，通過SYBRGreenI嵌合RT-qPCR檢測(cè)Cbfα1、BMP2和GAPDH的表達(dá)量。引物序列見表1。

表1引物序列

1.9 蛋白免疫印跡法（WesternBlot）

細(xì)胞鈣化誘導(dǎo)15d，棄去培養(yǎng)基， 1×PBS 洗細(xì)胞3次，加入細(xì)胞裂解液充分吹打混勻，置于冰上孵育30min ，收集所有裂解液，12000r/min離心 15min ，此時(shí)上清液中含細(xì)胞總蛋白。使用 10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳分離后，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上， 5% 脫脂牛奶封閉1h，加入一抗（Cbfα11：1000 ，BMP21：1000，GAPDH 1：1000 稀釋液， 4^°C 孵育過夜；加入二抗稀釋液（1：10000）室溫孵育1h后，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑（enhancedchemiluminescence，ECL）發(fā)光試劑盒顯影并計(jì)算p-mTOR灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差 表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。以 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1建立血管外膜細(xì)胞鈣化模型

使用鈣化誘導(dǎo)培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)大鼠血管外膜細(xì)胞15d后檢測(cè)ALP活性和胞內(nèi)鈣含量。鈣化誘導(dǎo)15d后，造模組細(xì)胞內(nèi)ALP活性和鈣含量明顯高于對(duì)照組（ Plt;0.05） 。對(duì)鈣化誘導(dǎo)15d的細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色，結(jié)果顯示，鈣化組細(xì)胞可觀察到大量的橘紅色鈣化結(jié)節(jié)，而對(duì)照組未見明顯鈣化。提示已成功建立大鼠血管外膜體外鈣化模型。詳見圖1、圖2。

圖1造模組、對(duì)照組ALP活性和鈣含量比較

（A為造模組、對(duì)照組ALP活性比較;B為造模組、對(duì)照組鈣含量比較。與對(duì)照組比較， ?Plt;0.05 ）

圖2造模組、對(duì)照組鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色圖 （×100 ）

2.2對(duì)照組、造模組Cbfα1和BMP2蛋白及mRNA表達(dá)比較

有研究發(fā)現(xiàn)，血管鈣化與成骨細(xì)胞特異性標(biāo)志物如Cbfα1和BMP2表達(dá)增加有關(guān)[10]。因此，本研究通過RT-qPCR和WesternBlot檢測(cè)大鼠血管外膜細(xì)胞鈣化過程中Cbfα1和BMP2表達(dá)。WesternBlot結(jié)果顯示，造模組Cbfa1和BMP2蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增加（ Plt;0.05） 。RT-qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，造模組成骨細(xì)胞特異性標(biāo)志物Cbfα1和BMP2mRNA表達(dá)量明顯增加（ Plt;0.05） 。提示大鼠血管外膜鈣化可能與血管外膜成纖維細(xì)胞向成骨樣表現(xiàn)轉(zhuǎn)化有關(guān)。詳見圖3、圖4。

圖3對(duì)照組、造模組Cbfα1和BMP2蛋白表達(dá)比較（A為Cbfα1和BMP2蛋白表達(dá)條帶圖；B為Cbfα1蛋白表達(dá)比較；C為BMP2蛋白表達(dá)比較。與對(duì)照組比較， ）

圖4對(duì)照組、造模組Cbfα1和BMP2mRNA表達(dá)比較（與對(duì)照組比較， ）

2.3對(duì)照組、造模組血管外膜細(xì)胞mTOR信號(hào)通路蛋白比較

與對(duì)照組相比，造模組p-mTOR蛋白表達(dá)上調(diào)，灰度分析結(jié)果顯示，造模組 p -mTOR/GADPH比值明顯高于對(duì)照組（ ?Plt;0.05） ，提示mTOR信號(hào)通路在大鼠血管外膜細(xì)胞鈣化過程中被激活。詳見圖5。

圖5對(duì)照組、造模組血管外膜細(xì)胞mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較

（A為p-mTOR蛋白表達(dá)條帶圖;B為p-mTOR蛋白表達(dá)柱狀圖。與對(duì)照組比較， ?Plt;0.05 ）

2.4雷帕霉素對(duì)血管外膜細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響

為了進(jìn)一步研究mTOR信號(hào)通路在大鼠血管外膜細(xì)胞鈣化過程中的作用，使用mTOR抑制劑雷帕霉素處理細(xì)胞。通過RT-qPCR檢測(cè)Cbfα1和BMP2mRNA表達(dá)變化，結(jié)果顯示，雷帕霉素高濃度組和低濃度組Cbfa1和BMP2mRNA表達(dá)水平較造模組降低C Plt;0.05） ，詳見圖6。WesternBlot結(jié)果顯示，雷帕霉素明顯抑制mTOR磷酸化，與造模組相比，雷帕霉素高濃度組和低濃度組 p -mTOR表達(dá)水平明顯降低（ Plt;0.05） ，且具有劑量依賴性，詳見圖7、圖8。雷帕霉素低濃度組、高濃度組鈣化程度比造模組減輕，橘紅色鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量和大小都有所減少，詳見圖9。WesnternBlot結(jié)果證明，雷帕霉素可抑制大鼠血管外膜細(xì)胞鈣化過程中Cbfa1和BMP2兩種成骨相關(guān)分子的表達(dá)，且具有濃度依賴性。

圖63組Cbfa1和BMP2mRNA表達(dá)比較（與造模組比較， ?Plt;0.05 ）

圖73組p-mTOR、Cbfα1和BMP2蛋白表達(dá)條帶圖

圖83組p-mTOR、Cbfα1和BMP2蛋白表達(dá)柱狀圖（A為Cbfa1蛋白表達(dá)柱狀圖;B為BMP2蛋白表達(dá)柱狀圖;C為p-mTOR蛋白表達(dá)柱狀圖。與造模組比較， ）

圖93組鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色圖（ ×100 ）

3討論

既往研究認(rèn)為，血管鈣化是由于鈣鹽的被動(dòng)沉積導(dǎo)致的不可避免的退行性病變過程[1]。但是越來越多研究證據(jù)表明，血管鈣化是一個(gè)類似于生理性骨形成的病理過程，是一個(gè)可受調(diào)控的主動(dòng)過程[12]。當(dāng)前研究認(rèn)為血管鈣化主要發(fā)生于血管中膜及內(nèi)膜，然而，在臨床工作中通過血管內(nèi)超聲及血管CTA等檢查發(fā)現(xiàn)大量的血管外膜鈣化病例。因此，血管外膜鈣化的發(fā)現(xiàn)將為血管鈣化類型提供重要補(bǔ)充。血管外膜成纖維細(xì)胞是構(gòu)成血管壁的主要細(xì)胞成分，正常生理情況下血管外膜細(xì)胞主要對(duì)血管中膜細(xì)胞起到營養(yǎng)支持的作用，同時(shí)血管外膜細(xì)胞可分泌多種活性因子，參與細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、增殖、凋亡、遷移以及膠原合成等，從而在血管生長、功能調(diào)節(jié)、血管重塑和纖維化等過程中發(fā)揮重要作用[13-14]

已有研究表明，高磷培養(yǎng)基體外培養(yǎng)可誘導(dǎo)血管中膜細(xì)胞發(fā)生鈣化[1.15-16]。本研究使用高磷培養(yǎng)基體外培養(yǎng)大鼠血管外膜細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)造模組大鼠血管外膜細(xì)胞鈣含量、ALP活性升高，茜素紅染色結(jié)果顯示橘紅色鈣化結(jié)節(jié)增多，提示高磷體外誘導(dǎo)大鼠血管外膜細(xì)胞發(fā)生鈣化，成功建立血管外膜細(xì)胞鈣化模型。血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化是血管鈣化過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)血管平滑肌細(xì)胞可分化為表達(dá)成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和骨基質(zhì)相關(guān)蛋白的成骨樣細(xì)胞[17-18]。高磷誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)成骨標(biāo)志物 Cbfα1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP2和ALP[19-20]。前期研究亦利用鈣培養(yǎng)基成功誘導(dǎo)血管外膜成纖維細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換[21-22]，因此，推測(cè)血管外膜鈣化過程中同樣發(fā)生成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化并表達(dá)成骨相關(guān)標(biāo)志物。WesternBlot、RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，造模組成骨樣分化標(biāo)志Cbfa1、BMP2的mRNA及蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組，提示高磷體外誘導(dǎo)大鼠血管外膜細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

mTOR通過接受生長因子、胰島素、磷脂酸及氧化應(yīng)激等刺激因素刺激，從而調(diào)控細(xì)胞生長、蛋白翻譯、能量代謝等多種生理活動(dòng)[23]。研究表明，mTOR信號(hào)通路在成骨分化中起重要調(diào)控作用。Pantovic等[24]研究發(fā)現(xiàn)，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化受到mTOR通路正向調(diào)控。Xian等[25]研究發(fā)現(xiàn)，mTOR抑制劑雷帕霉素可明顯抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鈣化，但不影響細(xì)胞增殖。Zhan等通過高磷誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞體外鈣化研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞鈣化時(shí)mTOR表達(dá)增加，而沉默mTOR后，細(xì)胞內(nèi)各種成骨分子的表達(dá)受到抑制，鈣化程度亦減輕。吳小麗2通過檢測(cè)Cbfα1和骨橋蛋白（OPN）兩種重要的鈣化相關(guān)因子，進(jìn)一步證實(shí)mTOR通路在高磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化中具有增強(qiáng)鈣化作用，而mTOR抑制劑雷帕霉素可逆轉(zhuǎn)這一過程。在本研究中也觀察到，與對(duì)照組相比，造模組p-mTOR的表達(dá)增強(qiáng)。為進(jìn)一步確定mTOR通路是否在血管外膜細(xì)胞鈣化過程中發(fā)揮作用，使用mTOR抑制劑雷帕霉素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，WesternBlot結(jié)果顯示，與造模組相比，雷帕霉素低濃度組、高濃度組p-mTOR表達(dá)下降。茜素紅染色結(jié)果顯示，雷帕霉素高濃度組、低濃度組鈣化程度輕于造模組。WesternBlot、RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，雷帕霉素高濃度組、低濃度組成骨相關(guān)因子Cbfα1和BMP2的mRNA及蛋白表達(dá)水平均低于造模組，提示雷帕霉素通過下調(diào)成骨相關(guān)分子的表達(dá)從而抑制血管外膜細(xì)胞向成骨樣表型轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步驗(yàn)證了mTOR通路激活在高磷誘導(dǎo)血管外膜鈣化過程中的作用。

綜上所述，在高磷誘導(dǎo)的大鼠血管外膜細(xì)胞鈣化模型中，mTOR信號(hào)通路被激活，mTOR信號(hào)通路抑制劑雷帕霉素可通過降低mTOR的磷酸化活性從而抑制血管外膜細(xì)胞向成骨樣表型轉(zhuǎn)化，防止血管鈣化的發(fā)生。

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（本文編輯 郭懷印）