miR-124-3p靶向調節上皮膜蛋白1對急性心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡的影響

急性心肌梗死（AMI是由冠狀動脈急性持續缺血缺氧引起的心肌壞死，其主要特征是心肌細胞凋亡，而梗死引起的心肌細胞凋亡和壞死會進一步引發炎癥反應以及膠原蛋白合成和降解失衡[1]。AMI是最嚴重的缺血性心臟病之一。盡管在過去的幾十年中AMI的死亡率一直在下降，但是AMI的發病率和死亡率仍然很高[2。因此，深入了解心肌細胞凋亡機制將為AMI的治療提供新的方法。微小RNA（miRNAs）作為非編碼RNA小分子，近年來其在心血管疾病發生和發展的重要作用被廣泛證明。miR-124-3p被確定為AMI的潛在調節候選指標，miR-124-3p可通過抑制心肌細胞凋亡來預防 AM∣^（3-4） 。據了解，miRNA主要是通過與靶mRNA的3非翻譯區（ 3^′ -UTRs）互補來介導基因表達，導致mRNA降解或翻譯抑制，進而參與調節各種疾病的發展[5]。上皮膜蛋白（epithelial membraneprotein，EMP）由外周髓鞘蛋白22kDa（peripheralmyelinprotein22kDa，PMP22）基因家族編碼，參與腫瘤細胞的遷移、生長和分化[。EMP1也被稱為CL-40，為腫瘤相關膜蛋白，廣泛存在于消化道、皮膚等上皮組織中，在細胞黏附、增殖、凋亡、腫瘤形成和轉移中起著至關重要的作用[7]。此外，研究發現，EMP1在心血管疾病中也起著重要作用[8]。但是在AMI中，miR-124-3p與EMP1的靶向調節關系尚不清楚。因此，本研究通過生物信息學網站預測miR-124-3p與EMP1之間的靶向結合位點，并深入探討miR-124-3p是否可以靶向調節EMP1來調控AMI大鼠的心肌細胞凋亡。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 動物

無特定病原體（SPF）級Wistar雄性大鼠，8周齡，體質量 270～3009 ，購自北京維通達生物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0002。所有大鼠在溫度 26^°C ，濕度 60% ，12h光/12h暗的條件下適應性飼養。本研究經上海中醫藥大學附屬第七人民醫院動物倫理委員會批準（批件號：2023-7th-HIRB-036）。

1.1.2 主要試劑

人心肌細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司；2% 紅四氮唑（TTC）染色液購自上海酶聯生物科技有限公司（貨號mI2366）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒購自北京凱詩源生物科技有限公司（貨號SOS-320）；B淋巴細胞瘤2（Bc-2）、B淋巴細胞瘤-2相關蛋白（Bax）、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3（CleavedCaspase-3）兔單抗及EMP1兔多抗購自Abcam公司（貨號ab194583、ab32503、ab214430、ab202975）；miRNA一鏈cDNA合成試劑盒和Hieff？miRNAUniversalqPCRSYBRMasterMix購自上海翌圣生物科技股份有限公司（貨號11148ES10、11171ES03）;HiScript Il One Step qRT-PCR SYBRGreenKit購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司（貨號Q221-01）;過氧化物酶標記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）購自上海翌圣生物科技股份有限公司（貨號33101ES60）；攜帶miR-124-3pinhibitor及陰性對照（miR-NC）、si-EMP1及陰性對照（si-NC）的腺病毒質粒由重慶威斯騰生物醫藥科技有限責任公司提供；miR-124-3p、EMP引物設計與合成由上海生工生物工程有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 AMI大鼠模型的建立

使用左前降支（LAD）冠狀動脈結扎法[9制備AMI大鼠模型：將大鼠腹腔注射 1% 戊巴比妥鈉（ 40mg/kg） （2號麻醉并確認完全麻醉狀態后，連接至動物呼吸器進行機械通氣。然后選取20只大鼠作為假手術組，其余大鼠通過開胸術和左側第4肋骨和第5肋骨之間的心包切開術暴露心臟后，用6-0絲線在左心耳尖端下 2mm 處結扎LAD冠狀動脈。假手術組動物只進行開胸，不結扎LAD。通過心電圖觀察到ST段抬高，且發現左心室發白時提示AMI大鼠模型建立成功。

1.2.2 動物分組和干預

將造模成功的大鼠隨機分為模型組、miR-NC組、miR-124-3pinhibitor 組、miR-124-3pinhibitor+si-NC組、miR-124-3pinhibitor+si-EMP1組，每組20只。miR-NC組和miR-124-3pinhibitor組大鼠分別尾靜脈注射攜帶陰性對照miR-NC和miR-124-3pinhibitor的腺病毒C 200μL） ，持續 14d ;miR-124-3pinhibitor + si-NC組和miR-124-3pinhibitor + si-EMP1組大鼠以同樣的方式和劑量將攜帶miR-124-3pinhibitor的腺病毒和攜帶si-NC或si-EMP1的腺病毒共同注射至大鼠體內，持續14d;假手術組和模型組均尾靜脈注射等體積的生理鹽水，持續 14d 。

1.2.3 超聲心動圖檢測大鼠心臟功能指標

實驗結束 后，用 1% 戊巴比妥鈉 40mg/kg） 麻醉大鼠，使用高分辨率成像系統和超聲探頭對大鼠進行經胸超聲心動圖檢查，檢測各組左心室收縮末期內徑（LVESD）左心室舒張末期內徑（LVEDD）左室短軸縮短率（LVFS）和左心室射血分數（LVEF）。

1.2.4TTC染色檢測各組大鼠心肌梗死面積

在每組中隨機選取5只大鼠頸椎脫白處死，解剖胸部分離心臟并在 20°C 快速冷凍 15min 。隨后，將冷凍的心臟切成厚度 2mm 的切片，并置于 2% TTC溶液中在 下孵育 20min ，最后用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗切片，數碼相機拍照，并使用ImageJ軟件分析心肌梗死面積（白色區域）。

1.2.5HE染色檢測各組大鼠心肌組織的病理變化

每組隨機選取5只大鼠麻醉后處死，獲取大鼠的心臟后用冰冷的PBS清洗，置于 4% 多聚甲醛中固定過夜，常規石蠟包埋并切成 4μm 的切片。然后用二甲苯和梯度乙醇脫蠟再水化，然后放入蘇木精、伊紅染色液中染色。最后將染色的切片放在光學顯微鏡下觀察心肌組織的病理形態。

1.2.6脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標 記法（TUNEL）檢測大鼠心肌細胞凋亡水平

取石蠟切片進行脫蠟和再水化后，將切片放入含有 0.3% Triton x-100 的PBS中，加入 50μL TUNEL試劑對細胞進行染色，再用蘇木精進行復染，PBS沖洗切片后用抗熒光猝滅封片劑封片，最后在熒光顯微鏡下隨機選擇5個視野觀察結果，并計算細胞凋亡率，細胞凋亡率 （%）= 陽性染色細胞/總細胞 ×100% 。

1.2.7 蛋白免疫印跡法（WestemBlot）檢測心肌組織中Bcl-2、Bax、CleavedCaspase-3、EMP1蛋白表達

在剩余大鼠中每組隨機選取5只處死并收集獲取心臟組織，預冷PBS沖洗后放入RIPA裂解緩沖液中研磨勻漿，使用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒測量蛋白質濃度。將 20μg 的蛋白質在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）中電泳，轉移到 0.45μm 的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，并在室溫下用 5% 脫脂乳將膜封閉 。隨后，將PVDF膜在 4^°C 下與Bcl-2（1：1000）、Bax（1：1000）、Cleaved Caspase-3（1：5000）、EMP1（1：300）及內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，1：2500 一抗孵育過夜，再與辣根過氧化物酶偶聯的山羊抗兔二抗（ 在室溫下孵育 。最后，使用增強化學發光試劑（enhancedchemiluminescence，ECL）試劑避光顯影。在凝膠成像系統中觀察蛋白表達，并使用ImageJ軟件分析蛋白條帶的強度。

1.2.8實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測大鼠心肌組織中miR-124-3p和EMP1mRNA的表達水平

將剩余大鼠處死并分離心肌組織，利用TRIzol試劑提取組織中的總RNA。然后使用miRNA一鏈cDNA合成試劑盒和Hieff？miRNAUniversal qPCRSYBRMasterMix對組織中miR-124-3p進行定量，使用HiScript II One Step qRT-PCRSYBR Green Kit對EMP1進行定量。以U6或GAPDH為內參，用 2^-ΔΔCt 法分析miR-124-3p和EMP1mRNA的表達水平，引物序列見表1。

表1qRT-PCR引物序列

1.2.9雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-124-3p與EMP1之間的靶向關系

通過生物學信息網站預測miR-124-3p和EMP1在 3^′ -UTR區域的結合位點。然后根據結合位點合成EMP1野生型（WT）或突變體（MUT） 3^′ -UTR序列，并克隆到pmirR-GLO載體中，構建EMP1-WT和EMP1-MUT質粒。再利用Lipofectamine3000轉染試劑將EMP1-WT和EMP1-MUT質粒與miR-124-3pmimic或miR-124-3pmimic-NC共轉染至人心肌細胞中，48h后收集細胞用雙熒光素酶測定系統測量熒光素酶活性。

1.3 統計學處理

采用Graphpadprism8.0軟件進行統計分析。符合正態分布的定量資料以均數 ± 標準差 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩組間比較采用Tukeys事后檢驗。以 Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1 各組大鼠心臟功能比較

與假手術組相比，模型組LVESD、LVEDD升高， LVFS、LVEF降低，差異均有統計學意義（ Plt;0.05 ；與模 型組和miR-NC組相比，miR-124-3pinhibitor組大鼠 LVESD、LVEDD降低，LVFS、LVEF升高，差異均有統計學 意義（ Plt;0.05 ）；與miR-124 ?30 inhibitor組和miR-124- ?3p inhibitor+si-NC組相比，miR-124-3pinhibitor + si-EMP1 組大鼠LVESD、LVEDD升高，LVFS、LVEF降低，差異 均有統計學意義（ Plt;0.05 。詳見表2。

表2各組大鼠心臟功能指標比較

注：與假手術組比較， ① Plt;0.05 ；與模型組比較， ② ）Plt;0.05 ；與miR-124-3p inhibitor組比較， ③ Plt;0.05 ;與miR-124-3p inhibitor+si-NC組比較， ④ rlt;0.05 。

2.2 各組大鼠心肌梗死面積比較

與假手術組相比，模型組大鼠心肌梗死面積增大（ Plt;0.05 ）；與模型組、miR-NC組相比，miR-124-3pinhibitor組大鼠心肌梗死面積減小（ Plt;0.05 ；與miR-124-3pinhibitor組和miR-124-3pinhibitor + si-NC組相比，miR-124-3pinhibitor+si-EMP1組大鼠心肌梗死面積增大（ ?∠0.05 ）。詳見圖1、表3。

圖1TTC染色檢測各組大鼠心肌梗死面積（A為假手術組；B為模型組；C為miR-NC組；D為miR-124-3p inhibitor組；E為miR-124-3pinhibitor + si-NC組;F為miR-124-3pinhibitor + si-EMP1組）

表3各組大鼠心肌組織梗死面積比較 單位： %

注：與假手術組比較， ① （204號 Plt;0.05 ；與模型組比較， ② （204號 Plt; 0.05；與miR-124-3pinhibitor組比較， ③ 2 Plt;0.05 ；與miR-124-3pinhibitor + si-NC組比較， ④ Plt;0.05 。

2.3各組大鼠心肌組織病理形態比較

假手術組大鼠心肌組織中細胞排列整齊，無明顯炎性細胞浸潤和組織水腫；與假手術組相比，模型組大鼠心肌組織中細胞排列紊亂，數量減少，腫脹明顯，且有大量炎性細胞浸潤；與模型組和miR-NC組相比，miR-124-3pinhibitor組大鼠心肌細胞排列較整齊，細胞數量增加，腫脹減輕，且炎癥細胞浸潤明顯減少；與miR-124-3pinhibitor組和miR-124-3pinhibitor+si-NC組相比，miR-124-3pinhibitor十si-EMP1組大鼠心肌組織損傷加重，心肌細胞腫脹，炎性細胞浸潤。詳見圖2。

圖2各組大鼠心肌組織的病理形態（HE染色， ×400 ）

2.4各組大鼠心肌細胞凋亡率比較

與假手術組相比，模型組大鼠心肌細胞凋亡率升 高 Plt;0.05） ；與模型組和miR-NC組相比，miR-124-3p inhibitor組大鼠心肌細胞凋亡率降低（ Plt;0.05 ；與 miR-124-3pinhibitor組和miR-124-3pinhibitor + si-NC 組相比，miR-124-3pinhibitor+si-EMP1組大鼠心肌細 胞凋亡率升高（ Plt;0.05 。詳見圖3和表4。

圖3各組大鼠心肌組織細胞凋亡情況（TUNEL染色， ×400 0

表4各組大鼠心肌細胞凋亡率比較 單位：%

注：與假手術組比較， ① Plt;0.05 ；與模型組比較， ② （20 Plt; 0.05；與miR-124-3pinhibitor組比較， ③Plt;0.05 ；與miR-124-3pinhibitor + si-NC組比較， ④ Plt;0.05 。

2.5各組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax、CleavedCaspase-3、EMP1蛋白表達比較

與假手術組相比，模型組大鼠心肌組織中Bax、CleavedCaspase-3蛋白表達升高，Bcl-2、EMP1表達降低，差異均有統計學意義（ Plt;0.05） ；與模型組和miR-NC組相比，miR-124-3pinhibitor組心肌組織中Bax、CleavedCaspase-3蛋白表達降低，Bcl-2、EMP1表達升高，差異均有統計學意義（ Plt;0.05） ；與miR-124-3pinhibitor組和miR-124-3pinhibitor+si-NC組相比，miR-124-3pinhibitor十si-EMP1組心肌組織中Bax、CleavedCaspase-3蛋白表達升高，Bcl-2、EMP1表達降低，差異均有統計學意義（ Plt;0.05 ）。詳見圖4 和表5。

圖4各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、CleavedCaspase-3、EMP1蛋白表達條帶圖

（A為假手術組；B為模型組；C為miR-NC組；D為miR-124-3pinhibitor組；E為miR-124-3p inhibitor+si-NC組;F為miR-124-3p inhibitor+si-EMP1組）

表5各組心肌組織Bcl-2、Bax、CleavedCaspase-3、EMP1蛋白表達比較

注：與假手術組比較， ① （20 Plt;0.05 ；與模型組比較， ② （204號 Plt;0.05 ；與miR-124-3p inhibitor組比較， ③ （20 Plt;0.05 ；與miR-124-3pinhibitor十si-NC組比較， ④ Plt;0.05 。

2.6各組大鼠心肌組織中miR-124-3p和EMP1mRNA表達比較

與假手術組相比，模型組大鼠心肌組織中miR-124-3p水平升高，EMP1mRNA水平降低，差異均有統計學意義 Plt;0.05） ;與模型組和miR-NC組相比，miR-124-3pinhibitor組心肌組織中miR-124-3p水平降低，EMP1mRNA水平升高，差異均有統計學意義（ ?∠2=9.05 ；與miR-124-3pinhibitor組和miR-124-3pinhibitor + si-NC組相比，miR-124-3pinhibitor + si-EMP1組心肌組織中miR-124-3p水平升高，EMP1mRNA水平降低，差異均有統計學意義 Plt;0.05 。詳見表6。

表6各組心肌組織中miR-124-3p和EMP1mRNA表達比較 （204號

注：與假手術組比較， ① （2號 Plt;0.05 ；與模型組比較， ② （204號 Plt;0.05 ；與miR-124-3pinhibitor組比較， ③ （20 Plt;0.05 ；與miR-124-3pinhibitor+si-NC組比較， ④ Plt;0.05 。

2.7miR-124-3p與EMP1的靶向關系驗證通過生物信息學網站預測發現miR-124-3p與EMP1在 3^′ -UTR區域存在靶向結合位點，詳見圖5。然后雙熒光素酶報告基因實驗發現，miR-124-3pmimic和EMP1-WT共轉染的細胞相對熒光素酶活性明顯低于miR-124-3pmimic-NC與EMP1-WT共轉染的細胞（ Plt;0.05） ，詳見圖6。

圖6雙熒光素酶報告基因實驗鑒定miR-124-3p與EMP1的靶向關系（與miR-124-3pmimic-NC、EMP1-WT共轉染比較， ）

3討論

AMI是一種常見的心血管疾病，其發病率和死亡率較高，主要是由于冠狀動脈閉塞使流向心肌的血流損失而導致的心肌細胞死亡和心肌重塑。AMI后的心臟重塑降低了左心室的收縮力，最終導致心力衰竭[10-11]。因此，本研究利用LAD結扎法對大鼠進行造模，檢測心功能及梗死面積發現，模型組大鼠心功能指標LVESD、LVEDD以及梗死面積較假手術組增加，LVFS、LVEF較假手術組降低，提示AMI大鼠模型復制成功。據報道，近幾年miRNA在心血管疾病中的作用引起了廣泛關注，并已確定了多種miRNA是AMI潛在的診斷生物標志物和治療靶點[12]。miR-26a可通過激活糖原合酶激酶3β信號通路抑制AMI后的心肌細胞凋亡；miR-124-3p靶向沉寂信息調節因子1（SIRT1）促進大鼠AMI中的細胞調亡、炎癥反應和氧化應激[13-14]。因此，本研究通過抑制AMI大鼠體內的miR-124-3p發現，miR-124-3pinhibitor組大鼠LVESD、LVEDD以及梗死面積較模型組縮小，LVFS、LVEF較模型組升高，提示抑制miR-124-3p可以促進AMI大鼠的心臟功能改善，并抑制心肌梗死和心力衰竭。

心肌細胞凋亡在AMI后的心功能不全和心肌結構變化中發揮重要作用，其可以誘導炎癥，刺激纖維細胞增殖，且在很大程度上影響病人的心臟功能。因此，抑制早期AMI中的心肌細胞凋亡對于改善心臟功能，防止心肌纖維化和心肌重塑非常重要[15-16]。本研究通過HE染色和TUNEL染色發現，模型組大鼠心肌組織中細胞排列紊亂，腫脹明顯，并伴有大量炎癥細胞浸潤，且細胞凋亡率升高，細胞數量減少，而miR-124-3pinhibitor組大鼠心肌細胞排列較為整齊，腫脹減輕，炎癥細胞浸潤明顯減少，且細胞凋亡率降低，細胞數量增加，提示抑制miR-124-3p可以減輕AMI大鼠心肌組織損傷，抑制心肌細胞凋亡。在心肌細胞凋亡的過程中，Bcl-2家族是一個非常重要的調節因子，根據功能主要分為促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bc-2，這些因子可以相互作用，共同調節心肌細胞的凋亡[17]。已知Bax可介導線粒體中的凋亡啟動因子細胞色素C（CytC）的釋放，并激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）-9將凋亡信號傳遞至Caspase-3，使Caspase-3活化并誘導細胞凋亡[18]。當Bcl-2蛋白表達增加時，越來越多的Bax二聚體相互分離，形成更穩定的Bax-Bcl-2異二聚體，從而中和Bax二聚體誘導的凋亡作用[17]。本研究結果顯示，模型組大鼠心肌組織中Bax、CleavedCaspase-3蛋白表達升高，Bcl-2表達降低，miR-124-3pinhibitor組大鼠心肌組織中Bax、CleavedCaspase-3蛋白表達降低，Bcl-2表達升高，進一步揭示了miR-124-3p被抑制可以抑制大鼠AMI后的心肌細胞凋亡。

大量研究表明，miRNAs作為一種內源性的小RNA，缺乏蛋白質編碼功能，其主要通過調節靶mRNAs的表達在轉錄后水平上進行切割或翻譯抑制，在動植物中發揮重要的調節作用[19]。因此，為了解miR-124-3p的具體作用，本研究通過生物信息學網站篩選其靶mRNA，結果發現miR-124-3p與EMP1存在結合位點，并推測EMP1可能是miR-124-3p的下游靶基因。EMP1被稱為腫瘤相關膜蛋白，是細胞增殖、遷移和死亡的關鍵調節因子，參與多種人類惡性腫瘤的發展[20]。EMP1可作為miR-95-3p的潛在下游靶基因調節胃癌順鉑耐藥性，作為miR-361-3p的靶mRNA來調節宮頸癌的發展[21-22]。但關于EMP1在AMI等心血管疾病中的作用研究甚少。本研究結果顯示，模型組大鼠miR-124-3p水平高于假手術組，EMP1mRNA水平及蛋白表達均低于假手術組，這與先前的研究結果保持一致；而當miR-124-3p受到抑制后，EMP1mRNA水平及蛋白表達升高，提示抑制miR-124-3p可能靶向上調EMP1的表達。為了明確兩者之間的靶向關系，本研究通過雙熒光素酶報告基因實驗進行驗證，結果發現EMP1-WT與miR-124-3pmimic共轉染的細胞相對熒光素酶活性明顯低于其與miR-124-3pmimic-NC共轉染的細胞，揭示miR-124-3p與EMP1之間存在靶向關系。隨后，本研究進一步在抑制miR-124-3p的基礎上進行EMP1敲低實驗，結果顯示，EMP1被敲低后，miR-124-3p抑制對AMI大鼠心肌損傷的保護作用被逆轉。因此，本研究推測下調miR-124-3p抑制AMI大鼠心肌細胞凋亡的作用機制可能與其靶向上調EMP1的表達有關。

綜上所述，抑制miR-124-3p可能通過靶向上調EMP1的表達來抑制AMI大鼠的心肌細胞凋亡。本研究為AMI的治療提供了潛在生物標志物及其理論依，但有關EMP1在AMI中的具體作用機制還有待進一步深入探索。

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