酶抑制劑篩選的研究進展

中圖分類號：R97 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533(2007)03-0117-03

20世紀60年代初，Umezawa提出了酶抑制的概念，從而將抗生素的研究擴大到酶抑制劑的新領域。酶抑制劑新藥發現的途徑：一是來源于天然化合物，包括動植物和各種微生物等，二是化學合成物。在目前上市的藥物中，以受體為作用靶點的藥物占52%，以酶為靶點的藥物占22%，以離子通道為靶點的藥物占6%，以核酸為靶點的藥物占3%。因此，酶抑制劑的開發是新藥來源的一個主要途徑。以酶為靶點開發新藥存在巨大潛力，今后很長一段時間仍然是發現新藥的重要著手點。

1 我國酶抑制劑篩選的進展

我國對酶抑制劑的研究起步較晚，始于20世紀70年代末，但是我國進行有計劃、有規模的篩選還不到10年，以前的工作沒有成規模的化學合成作基礎，篩選分散，隨機性大。只有最近一些年來，隨著高通量篩選和組合化學及組合生物合成技術的結合，規模化篩選藥物得到了極大的發展，國內許多單位相繼開展了酶抑制劑的篩選工作，福建省微生物研究所、上海醫藥工業研究院、中國醫學科學院醫藥生物技術研究所、四川抗生素研究所等對酶抑制劑進行了大量研究。國內最為顯著的是對血脂調節劑HMG-CoA還原酶抑制劑的研究。高通量篩選技術的發展，是我國篩選酶抑制新藥的重大突破，1998年，中國醫學科學院藥物研究所引進了國內第一臺微量閃爍計數器（microplate scintillation lurminescense counter）對96孔板進行快速的放射性活性測定，使放射免疫實驗及放射配基實驗自動化、微量化，實現了從整體動物模型向高通量篩選模型的轉化，為酶抑制劑的大規模篩選奠定了基礎。目前，國內利用高通量篩選每周可篩選數萬個化合物。

2 酶抑制劑源

目前，酶抑制劑主要來源于植物、微生物和化學合成。微生物產生酶抑制劑是來源于微生物的初級代謝產物和次級代謝產物，研究最多的是放線菌，也是產生微生物藥物最多的類群，其中最重要的是鏈霉菌屬（streptomyces）；細菌、真菌也是酶抑制劑的重要藥源微生物。除了傳統的藥源菌篩選分離外，研究人員的注意力更集中到了各種新的微生物類群中，如海洋微生物、極端微生物［1］。自然界植物種類豐富，但僅有不到10%被測定過某種生物活性，從植物中篩選酶抑制劑存在巨大的潛力，在未來相當長時間內仍是酶抑制劑新藥的主要來源。植物源酶抑制劑篩選的難點就在于植物粗提物中“假陽性”結果太多，干擾真正有效成分的篩選，目前，國外對此采取了一系列措施，篩選前先通過純化，采用提取物通過HPLC或固相萃取后結合質譜作出化合物指紋圖譜庫，與已有的經驗數據庫進行比較，有新成分的粗提物再進一步進行藥理活性篩選， 再者，他們還可以先將粗提物通過HPLC來鑒別出是否存在吸收光譜有特征的化合物，這樣可以減少篩選的盲目性［2］。新藥篩選的化合物庫中有70%左右為有機化學產物，因此，合成藥是新藥的主要來源，將高通量篩選技術與組合化學和組合生物合成技術的結合，實現了酶抑制劑大規模篩選，是世界許多大制藥公司篩選酶抑制劑新藥的主要渠道。

3 篩選模型

酶抑制劑的篩選模型分為三類：整體動物水平模型、組織器官水平模型和細胞分子水平模型。整體動物模型通常效率低、耗費多，篩選的樣品量多而篩選出的化合物卻很少，并不適合作為藥物初篩的模型。而組織器官模型是藥物篩選的一大進步，它在一定程度上克服了整體動物模型的不足，減少了篩選樣品量，降低了勞動強度，擴大了篩選規模，減少了動物用量，提高了篩選效率，降低了篩選成本，但是盡管這樣，還是存在規模小、效率低、樣品量較大等缺點，不易實現一藥多篩。隨著酶和受體作為靶分子的闡明及分子生物學和細胞生物學技術的發展，分子藥理學的不斷深入，細胞分子水平藥物篩選模型應運而生，此模型克服了前兩者的缺點，實現了大樣本量的篩選和一藥多篩，已成為目前藥物篩選的主要方法，使傳統的手工篩選形式轉變為由計算機控制的自動化大規模篩選的新技術體系，從而產生了高通量篩選［3，4］。高通量篩選始于20世紀80年代后期，在20世紀90年代后期得到極大發展，已成為酶抑制劑新藥發現的主要手段，篩選快速、高效，其篩選的過程為： 粗篩→復篩→深入篩選→確證篩選。其先進的檢測方法使每周篩選數萬個化合物成為可能，對酶抑制劑的篩選大多數情況測定酶活性即可檢測，其檢測方法主要為：放射免疫檢測（RIA）、熒光檢測（FA）、閃爍接近檢測（SPA）、比色法檢測等。Flotow通過放射法已成功建立了P56kk激酶抑制劑的高通量篩選模型。Taft等［5］也利用此法建立了（1.3）β-葡萄糖合酶抑制劑的高通量篩選方法。基于放射性的閃爍接近檢測（SPA）技術已成功應用于激酶抑制劑、肝炎C病毒（HCV）NS3蛋白酶抑制劑等的藥物篩選。用熒光檢測法篩選逆轉錄酶抑制劑、HIV-1蛋白酶抑制劑、中性內肽酶抑制劑等均獲成功。利用比色法已成功篩選出了脂氧合酶抑制劑，次黃嘌呤核苷-5’-單磷酸脫氫酶抑制劑、α-葡萄糖苷酶抑制劑、蛋白酪氨酸激酶抑制劑等［5～7］。

由于很多因素會影響與酶靶點作用的化合物的藥理作用，在體外對靶分子或細胞作用較強的物質在生物體內可能會被迅速降解或通過旁路途徑功能的調整而降低或消除活性成分的作用，許多在體外作用強度較高的酶抑制活性成分在生物體內往往顯示不出理想的作用效果，僅僅依靠分子水平模型的結果全面認識化合物的藥理作用還有一定距離。因此，通過高通量篩選的藥物必須通過動物模型進行復篩。

4 篩選方法

酶抑制劑篩選的方法主要分為體內和體外篩選，體內篩選即利用動物進行篩選，體外篩選包括體外試管篩選和體外細胞篩選，以下介紹幾種酶抑制劑的篩選方法。

4.1 HMG-CoA還原酶抑制劑的篩選

HMG-CoA還原酶是合成膽固醇過程的限速酶，抑制其活性即可抑制膽固醇的合成，從而起降血脂作用。其篩選方法為：（1）固醇脂質合成的同位素摻入法［8］。用鼠肝微粒體或胞漿酶作為粗酶制劑，在反應體系中加入同位素標記的合成前體如［¹⁴C］-乙酸或D，L-［¹⁴C］HMG-CoA，或D，L［¹⁴C］-甲羥戊酸作為底物，反應后測定形成的固醇中同位素的摻入率，樣品抑制固醇脂質合成能力可以通過與對照組數據對比求得。（2）利用對某些真菌的抑制活性及其用加酶催化產物抵消試驗來篩選。(3)應用酶聯免疫吸附測定法將已知的 β-羥-β -甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑compactin與蛋白質交聯，其交聯物免疫動物獲得抗體。酶標抗體作為探針在發酵液中定向尋找目標物。采用雙抗體法進行篩選［9］。（4）動物實驗。用于進一步的活性測定，方法是從大鼠尾靜脈注射tritonWR-1339鹽水溶液，注射后立即停止喂食，并持續使其處于饑餓狀態，被檢測的大鼠在注射triton后分幾次給藥，在注射triton 24 h后取肝和血漿測總膽固醇和甘油酯，評價樣品降血脂的效果［8］。

4.2 法呢基轉移酶抑制劑的篩選

法呢基轉移酶（farnesyltransferase，FTase）是Ras蛋白脂類共價修飾過程中最關鍵的酶， 尋找FTase抑制劑已成為近年來抗癌藥物研究領域的熱點之一。FTase抑制劑一方面來自對天然產物的篩選，另一方面來自人工合成。已有的篩選方法建立在三個水平上：無細胞水平、細胞水平和體內水平。（1）無細胞水平的篩選。即直接用純化的FTase在人工反應體系中測定化合物對它活性的抑制作用。FTase活性測定方法有多種，最常用的一種是測定［3H］法呢基從［³H］FPP轉到Ras蛋白的數量。一個酶活力單位定義為：1 h內在標準反應條件下(37 ℃ ，pH 7.4)把l pmol法呢基轉移到Ras蛋白上去的酶量。這種方法的關鍵是要能夠完全分離標記的反應產物，分離的方法主要有：凝膠電泳法、過濾法、免疫沉淀法。（2）細胞水平的篩選。目前人們已采用各種細胞模型包括GPAL酵母突變株、Ras細胞、HeLa細胞、蛙卵母細胞及人腫瘤細胞等。其中GPAL酵母突變株應用較廣，手霉素(manumycin)族抗生素類的三種抑制劑UCF-A、UCF-B、UCF-C就是用這種方法從鏈霉菌屬中篩選出來的；利用Ras細胞篩選是以抑制Ras轉化細胞的停泊非依賴性生長和單層培養生長作為合適指標；HeLa細胞模型是通過檢測FTase抑制劑引起前核纖層蛋白A在HeLa細胞中積累的數量，來評價抑制劑的活性。（3）體內水平篩選。可利用線蟲、裸鼠等進行篩選，利用線蟲篩選FTase抑制劑可以通過抑制法呢基化抑制Let-60 Ras蛋白功能，從而抑制發生了gf突變的C. elegans幼蟲Muv表型的發生，并且具有劑量依賴關系，可以用來評價FTase抑制劑的活性， 不過線蟲的結構和生理功能畢竟遠不及哺乳動物復雜，因此這個模型的實用意義還有待于進一步研究。

4．3 醛糖還原酶抑制劑的篩選

醛糖還原酶（AR）是多元醇通路中的關鍵限速酶，抑制它的活性能減少山梨醇在細胞內的堆積，防止一系列糖尿病并發癥的發生，因此，篩選醛糖還原酶抑制劑是糖尿病新藥來源的重要途徑。其篩選也分為體外篩選和體內篩選：（1）體外篩選。目前醛糖還原酶抑制劑的體外篩選主要利用高通量篩選，即直接用純化的AR在人工反應體系中測定化合物對AR活性的抑制作用。其篩選方法為：以DL-甘油醛為底物，還原型輔酶Ⅱ（NADPH）為輔酶，建立ARIS的高通量篩選模型，楊喆［10］，彭劍等人［11］應用96孔石英板，建立了AR的微量高通量篩選模型，一個酶活單位定義為：反應體系在37 ℃，pH 6.2下，在340 nm處吸光度每分鐘下降0.001為一個單位，以不含底物的樣品為空白對照，測試樣品對AR的抑制活性，AR粗酶抑制率按以下公式計算：I = （ΔA_對照-ΔA_樣品）/（ΔA_對照-ΔA_空白）。（2）體內篩選。主要采用動物模型向動物給藥，提取分離血漿中的紅細胞，體外測定紅細胞中AR的活性。目前測定紅細胞中AR活性的方法有：柱層析法、熒光法和ELISA［12～14］。

5 酶抑制劑產品

目前，已上市的酶抑制劑藥種類很多，針對各種疾病篩選出的酶抑制劑新藥源源不斷地進入市場。血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）是治療心血管疾病的一類重要藥物，最早上市的血管緊張素酶抑制劑是卡托普利，以后陸續上市了伊那普利、賴諾普利、西拉普利、雷米普利、培哚普利、福辛普利等。α-葡萄糖苷酶抑制劑能降低進食后血糖上升及血清胰島素的增加，1995年上市的阿卡波糖和1997年上市的伏格列波糖被列為治療糖尿病藥。此外米格列醇也是一種α-葡萄糖苷酶抑制劑。針對糖尿病并發癥，醛糖還原酶（AR）抑制劑托瑞司他和依帕司他在歐洲和日本已上市 。羥甲戊二酰輔酶A（HMG-CoA）抑制劑是一類降血脂藥，目前上市的HMG-CoA抑制劑有洛伐他丁、西伐他丁、普伐他丁、氟伐他丁、阿伐他丁和辛伐他丁。抗腫瘤方面，包括TOPOⅠ抑制劑拓撲替康和伊立替康等，TOPOⅡ抑制劑甲柔紅霉素、吡喃阿霉素及鬼臼噻吩苷等。蛋白酪氨酸激酶（PTK）抑制劑，有三羥異黃酮等。抗HIV方面，已上市的蛋白酶抑制劑藥包括：沙奎那韋(saquinavir) 、利托那韋(ritonavir)、奈非那韋(nelfinavir)、茚地那韋(indinavir)和洛匹那韋(1opinavir)。此外，還有增加青霉素抗耐藥菌能力的β-內酰氨酶抑制劑：棒酸、青霉烷砜等；解熱鎮痛抗炎的環氧合酶抑制劑：阿司匹林、吲哚美辛、塞來昔布、布洛芬等；抗痛風的黃嘌呤氧化酶抑制劑：別嘌呤等酶抑制劑。

6 結語

我國天然資源豐富，但是被利用的卻不多，天然來源的酶抑制劑存在很大的潛力，有待進一步開發；而組合化學和組合生物合成技術為合成酶抑制劑篩選打下了堅實的基礎，它們是合成藥發展的不懈動力。藥物篩選模型是發現酶抑制劑新藥的重要條件，新模型的建立必將帶來新型藥物的出現，分子生物學、細胞生物學、計算機科學的發展為建立新的藥物篩選模型提供了重要條件，有理由相信，隨著酶靶點的擴展和高通量篩選技術的應用，會有更多、更有效的酶抑制劑被發現。

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