不同劑量凱西萊治療肝豆狀核變性模型鼠的實驗研究

摘要：目的 探討不同劑量凱西萊對肝豆狀核變性模型鼠銅代謝變化的影響。方法 用銅負荷飲食法復制肝豆狀核變性疾病動物模型，將模型大鼠分為3個治療組與1個模型組，3個治療組分別給予50 mg／(kg·d)、100mg／(kg·d)、200 mg／(kg·d)凱西萊(靜脈輸注)。觀察各組大鼠谷丙轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、總蛋白、白蛋白、肝銅、24h尿銅變化情況。并觀察病死率及生長發育情況。結果 各治療組病死率明顯降低，100mg／kg組、200 mg／(kg·d)組肝銅含量較模型組明顯降低(P<0．05或P<0．01)，24 h尿銅明顯升高。結論 凱西萊能降低銅負荷大鼠肝銅含量，降低其病死率。

關鍵詞：凱西萊；銅負荷模型；肝豆狀核變性：肝銅

中圖分類號：R589 R285．5

文獻標識碼：A

文章編號：1672－1349(2007)06—0508—02

凱西萊又名硫普羅寧(tiopronin，MPO)，是一種新型的含巰基甘氨酸類藥物，其化學名為N－(2巰基丙酰基)甘氨酸，凱西萊首先作為改善肝功能藥物應用于臨床，后義發現有絡合重金屬的作用，國外長期使用證實該藥具有療效確切、安全可靠等特點。凱西萊可能對銅代謝障礙疾病肝豆狀核變性(HLD)的過量銅沉積有治療作用。本實驗探討了不同劑量凱西萊對肝豆狀核變性模型鼠銅代謝變化的影響，獲得了預期的效果。

1材料與方法

1．1動物 純系健康雄性Wistar大鼠60只，體重220g～280g，購于安徽醫學科學研究所實驗動物中心。動物房為普通級飼養室，實驗前先適應性飼養1周。

1．2藥品、試劑與儀器凱西萊：新誼藥業股份有限公司生產，規格：0．1g，每盒12片，批準文號：國藥準字H41020799。谷丙轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、總蛋白、白蛋白測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。去離子水：安徽大東方藥業提供。硫酸銅、硝酸：優級純，合肥大藥房提供。原子吸收分光光度計：北京WFX－1A型原子吸收分光光度計。721型分光光度計：上海第三分析儀器廠。

1．3動物分組與治療 第1步：取Wistar雄性大鼠60只，體重為220 g～280 g，1周后開始造模。隨機取10只作為正常組，另50只喂飼含硫酸銅1g／kg的粉狀飼料和0．185％硫酸銅的去離子水造模4周(銅負荷飲食)。第2步：由于在第1步造模過程中造模組有8只大鼠死亡，故第2步給予如下分組與治療：正常組喂普通飼料，其余繼續給予銅負荷飲食。正常組10只；模型組12只；50 mg／kg組10只，靜脈輸注凱西萊50mg／(kg·d)；100 mg／kg組10只，靜脈輸注凱西萊100 mg／(kg·d)；200 mg／kg組10只，靜脈輸注凱西萊200 mg／(kg·d)；第8周結束，在禁食18h后處死大鼠，取血測ALT、AST、總蛋白、白蛋白、肝組織標本測肝銅。大鼠處死前5d置代謝籠連續留取3天的24 h尿液，做24h尿銅檢查。

1．4觀察指標與測定方法 實驗動物一般情況觀察：實驗動物的飲食、毛色、活動度、排泄物、生長情況。血ALT、AST、總蛋白、白蛋白測定，按試劑盒說明書操作；肝組織標本先用生理鹽水反復洗凈，再用干凈濾紙吸干并秤取濕重500mg，用濃硝酸(分析純)10mL低溫加熱進行消化，等組織完全溶解至黃色澄清透明后，采用原子吸收分光光度計測量、火焰法測定銅含量。24h尿銅測定：單只置于代謝籠，收集24h尿液，搖勻后，用量筒準確量出尿液體積，并記錄總毫升數，測定時取2 mL尿液加0．1 mL H2SO4混勻待測。采用原子吸收分光光度計測量、火焰法測定。

1．5統計學處理 計量資料以均數±標準差(±s)表示，采用SPESS 11．0軟件包，不同組間兩兩比較時用t檢驗。

2結果

2．1 實驗動物觀察 在造模過程中大鼠對飼料的消耗及飲水量明顯減少，約為正常組的1／2，活動減少，毛色欠光澤，在前4周造模過程中造模組相繼有8只鼠死亡，正常組無死亡。在后4周模型組又死亡5只，50mg／kg組死亡2只，200 mg／kg組死亡2只，100 mg／kg組無死亡且狀態較為活躍，毛色有光澤，與正常組無二，采食及飲水量明顯增加。造模及治療過程中未發現大鼠腹瀉、溶血、黃疸、貧血等表現。治療前后各組間體重差異并不明顯，各組內大鼠體重均有明顯增長，各組增長幅度無明顯差異。

2．2各組動物血清ALT、AST總蛋白、白蛋白變化情況 治療后血清ALT、AST模型組較正常組升高(P<0．05)，ALT模型組與凱西萊各組比較無明顯差異；100mg／kg組、200mg／kg組AST較模型組、50mg／kg組明顯降低(P<0．05或P<0．01)。本實驗示模型組較正常組血清總蛋白無統計學意義，白蛋白有明顯降低(P<0．01)；200 mg／kg組較50 mg／kg組、100 mg／kg組不論總蛋白還是白蛋白均減少(P<0．05)；100mg／kg組與模型組比較白蛋白升高(P<0．05)。詳見表1。

2．3各組動物肝組織銅、24h尿銅變化情況 模型組肝銅較正常組明顯升高(P<0．01)，凱西萊各組隨劑量增大肝銅含量減少(P<0．05或P<0．01)；50 mg／kg組與模型組無明顯差異，100 mg／kg組、200 mg／kg組較模型組降低(P<0．05)。24h尿銅：模型組較正常組升高(P<0．05)；凱西萊各組間無統計學意義(P>0．05)；50 mg／kg組，100 mg／kg組、200 mg／kg組較模型組升高(P

與模型組比較，1)P<0．05，2)P<0．01；與正常組比較，3)P<0．05．4)P<0．01

3討論

肝豆狀核變性是一種常染色體隱性遺傳性銅代謝障礙疾病。銅過量沉積于腦、肝、腎臟等臟器的神經系統疾病。本病主要臨床表現為銅代謝障礙引致的肝硬化、腦基底神經核尤其是豆狀核變性、腎功能損害及角膜色素環(K—F環)形成等。銅過量沉積是主要原因。多余的銅毒性很強，并且可作為氧化物前體促進自由基和有害的脂及蛋白氧化物形成。蓄積的銅損害肝細胞，引起慢性肝炎。最初多余的銅蓄積在肝中而引起肝細胞損傷，隨著肝中銅量的增加，銅被釋放入循環并在其他器官中蓄積，繼而銅介導的氧化開始損傷到其他器官、系統，包括腦、腎。雖然目前沒有任何一種動物模型可以完全復制HLD的全部臨床特征。但可以確定的是銅負荷飲食可在大鼠肝、腎組織產生類似于HLD的銅沉積。

本試驗表明，凱西萊可明顯降低肝豆狀核變性模型大鼠死亡率，減少其肝銅含量，增加24h尿銅排泄，升高白蛋白，降低轉氨酶。凱西萊通過提供巰基，并活化體內超氧化物歧化酶，化解有害的自由基，增強肝臟解毒功能，對抗各種肝損傷，穩定細胞膜和線粒體膜，起到保護肝臟的作用。本實驗凱西萊治療組白蛋白較模型組升高，與文獻報道一致，說明凱西萊通過酶水解生成甘氨酸參與嘌呤類核酸的合成。多篇文獻證明凱西萊降低AST療效確切，本實驗也證明凱西萊可減輕由銅沉積所致的肝功能損傷。對重金屬和藥物有解毒作用。巰基是蛋白質和酶的正常成分，在體內主要以半胱氨酸形式存在。重金屬中毒時，常通過與金屬酶中蛋白質的巰基結合，從而使含巰基酶因失去這種活性巰基而失活，當有外源性巰基進入時，一方面可直接與重金屬絡合，另一方面可與失活的含巰基酶因置換而使金屬酶恢復活性。含巰基的凱西萊降低了銅負荷鼠肝銅蓄積量，說明凱西萊有促進肝臟沉積銅排出的作用，從尿排出是其排泄途徑之一。給予大鼠100 mg／(kg·d)的凱西萊灌胃對減少銅負荷模型鼠肝銅含量和死亡率有顯著作用，且未見不良反應，是較為合適的劑量。凱西萊各組肝銅含量較模型組低但較正常組高，有明顯差異，說明短時間難以將沉積于肝臟的銅完全絡合。