胰島素對全腦缺血再灌注大鼠腦ＨＳＰ７０表達的作用

摘要：目的 探討胰島素對腦缺血再灌注損傷的中樞保護機制。方法 通過胸部擠壓建立心臟驟停后完全性全腦缺血再灌注模型，觀察HSP70在腦組織的表達情況。結果 與對照組相比，胰島素并不能顯著上調缺血大腦的HSP70表達。結論 胰島素對全腦缺血大鼠大腦的HSP70表達沒有顯著影響。

關鍵詞：胰島素；腦缺血；再灌注損傷；HSPT0

中圖分類號：R743．31 R255．2

文獻標識碼：A

文章編號：1672—1349(2007)06—0506—02

細胞受熱及其他刺激后發生熱休克反應，誘導熱休克基因的轉錄和翻譯，生成熱休克蛋白(HSP)，HSP通過發揮分子伴侶等功能對細胞損傷具有保護作用。HSPT0在正常腦組織中不表達，多種應激所致腦組織損傷可誘導HSP70基因表達，對損傷細胞有保護作用。HSP70的存在代表損傷處于可修復階段，也是腦缺血損傷后敏感且可靠的標志。HSP70在完全性全腦缺血再灌注腦組織的表達情況如何，胰島素對完全性全腦缺血再灌注腦組織HSPT0的表達的影響和其腦保護作用如何均未見報道。近年有較多實驗觀察到胰島素能明顯改善腦缺血的神經功能障礙及病理損害，對缺血腦組織具有不依賴于其降糖作用的直接保護作用。胰島素腦保護的可能機制有增加細胞外r-氨基丁酸的水平、促進細胞內Ca2外流、清除自由基、激活Na+-K+-ATP酶及抑制除極等。本實驗通過胸部擠壓建立一種心臟驟停后完全性全腦缺血再灌注模型，觀察HSP70在腦組織的表達情況，研究胰島素對完全性全腦缺血再灌注的腦保護作用與HSP70的關系。

1材料和方法

1．1動物準備和實驗分組 成年健康SD大鼠36只，200g～300 g，隨機分成正常對照組(對照組，非手術大鼠)、安慰劑組(生理鹽水治療)、治療組。治療組予胰島素4U／d。各組又分別以治療天數不同分為兩組，每組6只。

1．2模型制作和給藥方法 心臟驟停模型制作：大鼠麻醉后仰面固定，3kg重量壓迫胸腔，心電圖全程紀錄，造成心臟驟停(心電圖呈直線)20s后，移開重物，心臟自主電活動恢復。麻醉方法：腹腔內注射氯胺酮60 mg／kg麻醉。治療組(每日注射胰島素4U)，10％葡萄糖10 mL+胰島素4U，腹腔內注射，每日兩次，每次5mL。安慰劑組予等量生理鹽水注射。

1．3免疫細胞化學和組織病理學觀察 完成試驗后，迅速處死大鼠。開胸暴露心臟，經升主動脈插管，生理鹽水100mL快速灌洗，4％多聚甲醛緩沖液(4℃)灌注115h，最后用15％蔗糖溶液灌注30min，4℃冰箱過夜。額部到枕部，進行石蠟切片。(5～8)μm用HE染色，光學顯微鏡下進行病理組織學觀察。4 0tan切片采用ABC法，即將40pm的切片在30％Triton X-100液中孵育30min，把切片浸入鼠抗HSP70單克隆抗體(1：2 000，Sigma，USA)孵育48 h(4℃)。經過PBS洗約15min后，切片浸入生物素結合兔抗鼠IgG(1：200，Sgima，USA)室溫孵育3h。再經PBS洗后，切片浸入ABC復合物(1：200，Sigma，USA)孵育3h。用PBS充分洗后，采用DBA法顯色。空氣中干燥，酒精梯度脫水、透明、中性樹膠封固，在光學顯微鏡下觀察HSP70表達。

1．4計算機輔助圖像分析 經過免疫細胞化學染色的切片在光學顯微鏡下放大200倍，圖像經過攝像機轉變為電信號，再轉換成可被計算機直接處理和儲存的數字信號，并可同時在監視器上顯示。每組大鼠取同部位切片，每張切片在皮層HSP70表達區選5個視野，進行著色細胞圖像分析，然后計算HSP70陽性細胞的個數，進行半定量測量。

1．5統計學處理 用x2檢驗。

2結果

在對照組即假手術組中未見HSP70蛋白表達，在安慰劑組與治療組中HSP70的表達均有顯著增高，但兩組對比無明顯差異，并且治療時間3d與6d對比，HSP70蛋白表達無明顯差異。詳見表1。]

3討論

熱休克蛋白又稱應激蛋白(stress protein)，是1962年Ri－toy6a在經過非致死性熱處理的果蠅唾液腺細胞中發現的。現已被認為是對缺血性損傷有重要保護作用的應激蛋白，根據相對分子質量不同分為HSP70、HSP90、HSP27等家族，其中HSP70與腦缺血再灌注損傷最為密切。HSP70在正常條件下不表達或表達極少，在應激條件下，當其他蛋白合成明顯受到抑制時，HSP70反而過度表達，因而被認為對機體有保護作用。近年研究表明，正常腦組織中檢測不到HSP70，在短暫非致死性腦缺血后，受損傷細胞的變性蛋白可以誘導HSP70的合成，同時也獲得暫時的對隨后致死性缺血性生損傷的耐受。其機制可能為：HSP70發揮“分子伴侶”的作用，促進新生多肽鏈的正確折疊，阻遏蛋白錯誤折疊。在缺血、缺氧等情況下，核蛋白變性，暴露出疏水區，并相互作用而聚合，并且與自胞質進入到細胞核內的少量HSP70結合，使得本來與HSP70結合的熱休克轉錄因子(HSF)分離，轉移到細胞核中與HSP70基因啟動子中特定的核苷酸序列即熱休克元件(HSE)結合，從而啟動HSP的轉錄，HSP70mRNA轉移到核外大量合成HSP70，在細胞質中與變性蛋白結合，維持蛋白自身穩定；進入核內與核糖體前體及其他核內蛋白結合，防止變性引起生命信息紊亂。

在本實驗中，通過注射胰島素來觀察其對中樞的直接作用機制。從實驗結果可以看出，在對照組中未見HSP70的表達，在缺血再灌注模型的胰島素治療與安慰劑組中，HSP70蛋白均明顯增加。這與以往的文獻報告一致，提示腦缺血再灌注損傷可誘導神經元HSP70的表達。本組實驗還表明，胰島素治療與安慰劑組相比，并不能明顯上調HSP70的表達，并且實驗時間3d與6d組相對比，表明此結果與治療時間無關。

以往有文獻報道，HSP70表達最多的腦區是缺血側皮質周圍及對缺血耐受的海馬齒狀回顆粒細胞層，在缺血中央區以及對缺血敏感的海馬CAI區未見HSP70的表達。Welsh等研究發現愛梗死中央區有HSP70mRNA的大量誘導而無HSP70蛋白的表達，并認為HSP70基因轉錄與翻譯水平的分離是神經元嚴重缺血的標志，與細胞損傷有密切關系。本實驗采用心臟驟停模型造成全腦缺血缺氧，并且標本切片自額部到枕部切片，避免了可能由于結扎頸內動脈仍有其他血管代償或因切片部位的選取而造成的對實驗結果的影響。

有資料顯示，胰島素能減輕腦缺血再灌注后細胞內鈣超載，清除氧自由基，增加腦細胞外r－氨基丁酸的水平，拮抗興奮性氨基酸的毒性作用。胰島素是否通過對上述腦缺血再灌注損傷環節的調節，從而上調HSP 70蛋白的表達，有待進一步的研究。本課題得出的結論說明：胰島素對全腦缺血大鼠大腦的HSP 70表達沒有顯著影響，可能是胰島素對腦保護作用與HSP 70的相關途徑沒有明確的關系，為今后類似的研究方向，提供一些避免損失的證據，當然也需要對類似課題進行進一步的研究和觀察。