線拴法建立小鼠局灶性腦缺血再灌注模型的經驗總結

摘要：目的 建立小鼠局灶性腦缺血再灌注模型，并總結經驗教訓。方法 從頸外動脈插入栓塞線至頸內動脈，選擇性栓塞大腦中動脈，造成大腦中動脈閉塞的動物模型。通過控制再灌注時間，觀察其對小鼠神經行為學、腦缺血程度及存活期的影響。結果 除假手術組未制成腦缺血模型外，其他3組均于手術后24h出現神經行為學異常，腦切片TTC染色可見缺血病灶。結論 小鼠局灶性腦缺血再灌注模型制造成功，小鼠術后的成活率、梗死體積、神經行為學表現與手術方法密切相關。

關鍵詞：小鼠；大腦中動脈閉塞；動物模型；線拴法

中圖分類號：R743．3l R255．2

文獻標識碼：A

文章編號：1672—1349(2007)06—0511—03

在臨床缺血性腦血管病中，最為常見的是火腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)引起的，因此在動物實驗中也較常采用大腦中動脈閉塞的動物模型。由于大鼠的腦血管分布與人類相似，并且易存活、抵抗力強，同時便于進行動物智能測試及電生理檢查，因而目前MCAO模型大都以大鼠為主。而小鼠因為其體積小、操作困難，盡管動物成本低廉，仍然使其應用受到限制。但隨著醫療設備、實驗器材以及技術水平的提高，已經克服了上述困難，加上轉基因小鼠的日益應用，使得小鼠局灶性腦缺血／再灌注模型被廣泛采用。本實驗根據國外制作小鼠MCAO模型的先進經驗和國內現有報道，將實驗操作方法及所得經驗教訓簡述如下，以便同行交流。

1材料與方法

1．1材料的準備 健康6周齡雄性昆明小鼠(購自山東大學西校區動物中心)40只，體重(22～25)g。2，3，5一氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazoliu chloride，TTC，上海國藥集團生化公司生產)，MOTIC手術顯微鏡(SMZ系列)，顯微手術剪刀，系結鑷子，開瞼器(均為六六視覺公司生產)。栓塞用線：使用藍色6－0號單纖絲尼龍線，剪成長2cm的線段，用酒精燈將兩端燒成圓球形以備用。

1．2實驗方法

1．2．1動物分組 40只小鼠隨機分為4組，即永久閉塞組、缺血0．5 h再灌注24h組、缺血1h再灌注24h組、假手術組，每組10只。

1．2．2模型制作 用10％的水合氯醛(350 mg／kg)將小鼠腹腔麻醉，仰臥位固定于手術臺上，保持呼吸通暢。用酒精棉球擦拭頸部，在頸正中切口，鈍性分離下頜下腺，顯微鏡下游離左側頸總動脈，使用微血管夾夾閉。游離左側頸外動脈，用6—0號絲線結扎其遠端，在左頸總動脈分叉至前一頸外動脈結扎線之間打一松結，游離左頸內動脈并用微血管夾夾閉。用顯微眼科手術剪刀在兩結扎線之間剪一小口，將栓塞線向下插入至頸總動脈處，將松結扎緊，在頸外動脈遠端結扎處下方、栓塞線插入的上方剪斷左頸外動脈，撤離頸內動脈處的微血管夾，并使栓塞線插入端在左頸總動脈分叉處。將頸外動脈拉向外下方，使其與頸內動脈處于同一直線。將栓塞線向頸內動脈方向插入1cm左右，直至感受到阻力，為防止出血將6—0絲線扎緊。永久閉塞組此時即可將頸總動脈處微血管夾撤離，縫皮；缺血0．5h再灌注24 h組、缺血1 h再灌注24 h組即是在缺血0．5h和1h后將栓塞線和左頸總動脈處微血管夾撤出，保持動脈流暢24h。假手術組不插入栓塞線，剪斷左頸外動脈后，左頸總動脈夾閉1h后撤血管夾，縫皮。術后將小鼠置于放有清潔墊料的飼養盒中，室溫保持在(25～28)℃自由飲水、進食。

1．2．3神經行為學評分 術后24h，采用5 min對小鼠的神經功能缺損進行評分。0分：無神經缺損癥狀；1分：右前肢不能完全伸直；2分：向右旋轉；3分：行走向右側傾倒；4分：不能自發行走，意識喪失。1分～4分為有效動物缺血模型。

1．2．4腦梗死體積的計算 術后24 h斷頭取腦，迅速置－20℃冷凍箱中冷凍20 min后取出，在操作臺上迅速由前向后行厚2．0mm的冠狀切片，將切片立即置于質量分數為1％的TTC磷酸鹽緩沖液中，避光37℃恒溫孵育30 min。用數碼相機按順序拍攝染色后的腦片，用計算機軟件(NIH Image 1．54)計算每一腦片缺血區的面積(SIN)以及雙側大腦面積(SN)，按公式A＝XSIN／XSN×100％計算腦梗死區占整個大腦體積的百分比。

1．3統計學處理 采用SPSS統計軟件進行數據統計，計量資料采用t檢驗、配對t檢驗等方法；計數資料采用r2檢驗；等級資料采用Ridit分析。

2結果

2．1神經行為學評分(見表1)觀察術后小鼠表現，經統計分析，除假手術組無明顯的缺血行為表現外，其他3組均表現出神經行為學異常，為有效動物缺血模型。但經觀察，缺血后再灌注的兩組神經行為學改變更明顯，缺血0．5h再灌注24h組比缺血1h再灌注24h組的癥狀出現晚。永久閉塞組的癥狀較缺血再灌注組出現得早，癥狀卻輕些，存活時間長。分析可能是缺血后再灌注損傷使小鼠癥狀加重。假手術組偶有出現偏癱癥狀者，可能與小鼠個體解剖差異有關。

2．2腦梗死體積的大小 除假手術組未見梗死灶外，其他3組均有缺血病灶，體積大小略有差異，缺血再灌注組比永久閉塞組9．6％±4．7％的梗死體積大，缺血1h再灌注24h組13．2％±6．5％比缺血0．5 h再灌注24 h組11．6％±5．9％的梗死體積稍大。經統計永久閉塞組與缺血再灌注組比較有明顯差異(P<0．05)，而缺血0．5h和缺血1h再灌注24h組比較未見明顯差異。

3討論

通過實驗發現，永久閉塞組雖然癥狀出現早，但存活時間長。缺點是不能再灌注，可能引起頸內動脈起始部位的側支閉塞引起單側偏盲。缺血0．5h再灌注24h組比缺血1h再灌注24h組癥狀出現晚，但腦切片TTC染色沒有明顯差異，隨著再灌注時間的延長，其癥狀逐漸趨于一致。缺血再灌注組的存活時間比永久閉塞組短，可能是再灌注損傷造成的。假手術組基本上沒有神經行為學上的表現，TTC染色也大都未見缺血病灶，存活時間也未見影響。實驗證明可以通過栓塞法制造大腦中動脈閉塞的動物模型，并且效果很可靠。所以可以根據實驗要求選擇實驗的方法，以滿足課題的需要。

因為小鼠手術后的存活期和手術時間及熟練程度等有很大關系，所以本實驗僅觀察了小鼠手術后的生存狀態及存活期限而未列出觀察數據。

實驗證明：不同的實驗方法對小鼠的存活率、腦梗死的體積以及神經行為學的影響是不同的。手術過程中很多因素都決定著小鼠腦缺血模型是否能夠成功，現將在實驗過程中發現的經驗教訓總結如下。

3．1 麻醉是實驗成功與否的關鍵 給予10％的水合氯醛(350mg／kg)完全能夠將小鼠麻醉，麻醉程度不宜過深。小鼠在術后0．5h后能夠醒來的麻醉程度是適合的。如果麻醉不完全切忌補藥，容易使小鼠在手術過程中死亡。

3．2手術時間的長短是小鼠是否能長期成活的關鍵 手術過程中要盡量避免損傷小鼠頸部周圍組織、血管、迷走神經等。尤其是迷走神經，如果麻醉過深不但不利于小鼠手術后的蘇醒，在實驗過程中一旦刺激迷走神經，很容易引起小鼠呼吸、心跳的停止。手術時間越短，小鼠術后的存活期越長，反之則很容易使其消瘦、不欲進食而死亡。

3．3小鼠種系、大小的選擇 昆明小白鼠的生存能力是最強的，因此在前期造模實驗中主要選擇了昆明小白鼠。小鼠的體重以25 g左右比較合適，30 g左右的小鼠過重，脂肪多，增加了剝離血管的難度，容易引起出血。20 g以下的小鼠抵抗力差，雖然很好操作，但是難以成活。

3．4栓塞線段的處理 本實驗采用進口的6—0藍色單纖絲尼龍線，此種尼龍線經酒精燈燒制頭端容易成球形，無邊刺。而且可以通過控制線頭球形的大小來適應所需造模小鼠血管的要求，例如小鼠大、血管粗的可以選擇頭端大的線段。其對應關系需要在練習時注意尋找規律。

3．5其他問題 術中要注意小鼠的體溫，肛溫保持在37℃左右為宜。栓塞線在插入頸內動脈時容易誤插于翼腭動脈(ptery－gopalatine artery，PPA)，在反復插入時注意避免戳穿血管的問題。手術中不需結扎或切斷分支小血管，盡量減少出血的可能性。頸外動脈上的松口結的松緊度要合適，松了容易引起出血，緊了會增加栓塞線進入的難度。