二甲基氨氯吡咪及氨氯吡咪對心肌肥厚大鼠離體乳頭肌力學(xué)特性的影響

摘要 目的 觀察并比較二甲基氨氯吡咪(DMA)和氨氯吡咪(AM)對心肌肥厚大鼠離體乳頭肌的變力性作用，并探討其機(jī)制。方法 采用離體乳頭肌灌流方法觀察DMA和AM對心肌肥厚大鼠離體乳頭肌的變力性作用，并利用L－型鈣通道阻滯藥和Na＋－Ca2交換體(NCX)阻斷劑探討其可能機(jī)制。結(jié)果 (1～20)μmol／LDMA對心肌肥厚大鼠離體乳頭肌產(chǎn)生劑量依賴性的正性變力作用，升高發(fā)展張力(TC)，縮短收縮至最大速率的時間(T—dp／dtmax)和75％舒張時間(T75％)，與用藥前相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)(P<0.05或P<0．01)。(0．05～1．00)mmol／LAM對心肌肥厚大鼠離體乳頭肌產(chǎn)生劑量依賴性的負(fù)性變力作用，降低TC。延長T-dp／dtmax和T75％。與用藥前相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05或P<0．01)。DMA對心肌肥厚大鼠離體乳頭肌的正性變力作用不能被L－型鈣通道阻滯藥尼卡地平阻斷。DMA對心肌肥厚大鼠離體乳頭肌的正性變力作用能被Na+－Ca2+交換體(NCX)阻斷劑氯化鎳(NiCl2)阻斷。結(jié)論 DMA(1～20)μmol／L對正常大鼠離體心臟產(chǎn)生劑量依賴性的正性變力作用。(0．05～1．00)mmol／L AM對心肌肥厚大鼠離體乳頭肌產(chǎn)生劑量依賴性的負(fù)性變力作用。與AM抑制NCX不同，DMA通過激動NCX對心肌肥厚大鼠離體乳頭肌產(chǎn)生正性變力作用。

關(guān)鍵詞：二甲基氨氯吡咪；鈉鈣交換體；正性變力作用

中圖分類號：R542．2 R256．2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1672—1349(2007)06—0502—03

氨氯吡咪(amiloride，AM)對離子通道作用復(fù)雜，除對NA＋－H+交換有影響外，還對Na－Ca交換體(NCX)、電壓門控K－Na－Ca2通道和Na－K－ATP酶有作用。近年來對作用更強(qiáng)更特異的AM衍生物的研究得到了廣泛關(guān)注，且發(fā)展迅速，現(xiàn)已約達(dá)一千種。二甲基氨氯吡咪(dimethy—lamiloride，DMA)是AM第5位碳原子兩個甲基取代兩個氫原子后得到的產(chǎn)物，它對離子通道作用的強(qiáng)度、特異性，甚至作用的根本性質(zhì)都與AM具有不同之處甚至截然相反。NCX是心肌細(xì)胞膜上的一種雙向的非三磷酸腺苷(ATP)依賴的生電性離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。多數(shù)研究認(rèn)為，AM及其多數(shù)衍生物均是NCX抑制劑，而我室前期膜片鉗的研究表明，DMA能增強(qiáng)單個大鼠心肌細(xì)胞收縮力和鈣瞬變，且其作用是通過增強(qiáng)NCX電流實(shí)現(xiàn)的[5]。

本次研究選取心肌肥厚大鼠左心室乳頭肌，采用離體乳頭肌灌流法，觀察DMA和AM對乳頭肌的變力性作用，并利用L-型鈣通道阻滯藥和NCX抑制劑探討DMA對肥厚心肌的變力性作用與NCX的關(guān)系，為臨床治療心力衰竭開發(fā)新藥提供藥理學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1．1動物 健康清潔級Wistar大鼠，體重為(250～300)g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號為：314第070104號。

1．2藥品及試劑 DMA[5一(N，N—dimethyl)amiloride]，美國Sigma公司，批號67H4087；AM(amiloride hydrochloride)，美國Sigma公司，批號064K0743；氯化鎳(NiCl2)，美國Sigma公司，批號129H3640；HEPES(N－2－h(huán)ydroxyethylpiperazine—N－2－ethane—sulfonicacide)，北京化學(xué)試劑公司，批號030605；尼卡地平(nicardipine)，上海生工生物工程有限公司，批號3568A22。將DMA、AM、尼卡地平、NiCl2溶解于雙蒸水中配成母液冷藏貯存于冰箱備用，實(shí)驗(yàn)前用臺氏液稀釋到所需濃度。

1．3儀器 離體乳頭肌灌流裝置；SEN－7103電子刺激器(日本NIHONKOHOEN公司)；BL－410生物信號分析系統(tǒng)(成都泰盟科技)。

1．4方法

1．4．1大鼠心肌肥厚動物模型的制備 選用雄性Wistar大鼠，稱重后，參照Doering等方法，用戊巴比妥鈉30 mg／kg腹腔注射麻醉后固定于手術(shù)臺，無菌操作下打開腹腔，在雙側(cè)腎動脈上方游離出腹主動脈穿過一根0號絲線，沿腹主動脈長軸置一直徑為0．7mm的小圓棒(7號針頭磨制)，將腹主動脈與小圓棒一起結(jié)扎，抽出小圓棒，檢查腹主動脈通暢后，分層關(guān)閉腹腔。術(shù)后第3周起每周做超聲心動圖(HP5500超聲心動圖儀，12MHz探頭)，直到心肌肥厚為止。另做一組對照組動物，開腹后僅做分離但不結(jié)扎。

1．4．2乳頭肌制備及灌流方法 取成型的模型大鼠，猛擊其枕后部致昏，迅速開胸取出心臟，置于100％氧氣飽和的室溫臺氏液中。輕壓心臟使其內(nèi)殘留的血液擠出后，用手術(shù)剪剪開左心室。選取較細(xì)長的乳頭肌，用絲線結(jié)扎其兩端并各留一直徑約(2～3)mm的環(huán)，將乳頭肌游離，一端環(huán)固定鉑絲電極(電場刺激)，另一端與張力換能器相連。將固定好的標(biāo)本垂直放人4mL的灌流槽中開始灌流，灌流速度設(shè)置為(5～6)mL／min。灌流所用臺氏液提前用100％氧氣飽和，溫度保持在(35±1)℃，臺氏液成分：NaG 140mml／L，MgCl2 1．0mmol／L，KC15．4mmol／L，Glucose 10 mmol／L，Nail2PO40．33 mmol／L，CaCl2 1．8 mmol／L，Hepes 5．0mmol／L，pH 7．36。給予乳頭肌標(biāo)本(0．3～0．5)g的初負(fù)荷進(jìn)行平衡，整個平衡過程中給予1．0 Hz的刺激，刺激強(qiáng)度為閾強(qiáng)度的(1．2～1．5)倍，波寬3mS，刺激來源于于乳頭肌相平行的兩鉑絲電極，該電極與刺激器相連。乳頭肌收縮力學(xué)特性的變化通過張力換能器以BL－410生物分析系統(tǒng)進(jìn)行采樣、分析。平衡(30～60)min待各項(xiàng)指標(biāo)穩(wěn)定后，給予藥物干預(yù)。

1．5乳頭肌力學(xué)特性觀察指標(biāo) 收縮的發(fā)展張力(developedtension of contraction，TC)、收縮至最大速率的時間(T—dp／dtmax)，75％舒張時間(time to 75％ relaxation，T75％)。以TC>0．15 g為乳頭肌收縮功能正常標(biāo)準(zhǔn)。

1．6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。運(yùn)用SPSS 10．0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析。P<0．05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié) 果

2．1 DMA對心肌肥厚大鼠離體乳頭肌力學(xué)特性的影響(1～20)μmol／LDMA可劑量依賴性地增強(qiáng)心肌肥厚大鼠乳頭肌收縮力，增強(qiáng)TC，縮短T—dp／dtmax和T75％，與用藥前相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05或P<0．01)。詳見表1。

2．2 AM對心肌肥厚大鼠離體乳頭肌力學(xué)特性的影響(0．05～1．00)mmol／L的AM可劑量依賴性地抑制心肌肥厚大鼠乳頭肌收縮，降低TC，延長T—dp／dtmax和T75％，與用藥前相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05或P<0．01)。詳見表2。

2．3應(yīng)用L－型鈣通道阻滯藥后DMA對心肌肥厚大鼠離體乳頭肌力學(xué)特性的影響 在應(yīng)用L－型鈣通道阻滯藥尼卡地平后，乳頭肌收縮功能明顯降低，TC降低，T—dp／dtmax和T75％明顯延長(P<0．01)，當(dāng)各指標(biāo)降至最低值且穩(wěn)定后再給予DMA和尼卡地平，乳頭肌收縮功能有所恢復(fù)，TC增強(qiáng)，T—dp／dtmax和T75％縮短，與單用尼卡地平相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01)。詳見表3。

2．4應(yīng)用NCX抑制劑后DMA對心肌肥厚大鼠離體乳頭肌力學(xué)特性的影響在應(yīng)用鈉鈣交換體抑制劑NiCl2后，乳頭肌收縮功能明顯降低，TC降低，T—dp／dtmax及T75％明顯延長(P<0.01)，當(dāng)各指標(biāo)降至最低值且穩(wěn)定后再同時給予DMA和NiCl2，乳頭肌收縮功能基本無變化，與單用NiCl2相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)。詳見表4。

3討論

NCX有兩種轉(zhuǎn)運(yùn)模式，Na+運(yùn)入細(xì)胞伴隨著Ca2+運(yùn)出，即正向轉(zhuǎn)運(yùn)(forward mode)；Ca2+運(yùn)人伴隨著Na+運(yùn)出，即逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse mode)。NCX的主要功能是在舒張期通過正向NCX將胞內(nèi)的Ca2+外排，是影響心肌舒張功能的重要因素。而近年研究結(jié)果已證實(shí)，反向NCX參與心肌的興奮收縮耦聯(lián)(CICR)，對增強(qiáng)心肌的收縮功能也具有非常重要的作用。Leblanc等在1990年的研究證實(shí)，Na依賴性Ca2內(nèi)流可觸發(fā)肌質(zhì)網(wǎng)Ca2＋釋放(即鈣引起的鈣釋放，calcium induced calciumrelease，CICR)和心肌收縮。Levi等在使鈉通道失活并阻斷L－型鈣通道的條件下，給心肌細(xì)胞施加除極化刺激仍能引起收縮，這種收縮反應(yīng)可被NCX阻斷劑或CICR通道阻斷劑消除，而在抑制鈉泵活動或提高細(xì)胞內(nèi)[Na+]后收縮加強(qiáng)，提示除極化時經(jīng)NCX進(jìn)入的Ca2＋觸發(fā)CICR而引起收縮。Bers在2002年也論述了NCX在心肌興奮一收縮耦聯(lián)中的重要作用。可見，NCX對觸發(fā)CICR引起心肌收縮的作用已得到廣泛的證實(shí)和承認(rèn)。

本研究結(jié)果表明，AM對心肌肥厚大鼠產(chǎn)生劑量依賴性的負(fù)性肌力作用，這和AM是NCX抑制劑相一致。而DMA對心肌肥厚大鼠乳頭肌產(chǎn)生劑量依賴性的正性肌力作用。在應(yīng)用尼卡地平完全阻斷L－型鈣通道后，DMA對心肌肥厚大鼠乳頭肌的正性肌力作用仍存在，而應(yīng)用NCX抑制劑NiCl2則可完全阻斷DMA的作用。這說明與AM抑制NCX不同，DMA對心肌肥厚大鼠乳頭肌的正性變力作用是通過激動NCX而實(shí)現(xiàn)的。

DMA作為NCX激動劑的發(fā)現(xiàn)，具有重要的藥理學(xué)和臨床研究意義。增強(qiáng)心肌細(xì)胞膜NCX功能，可同時提高肥厚和衰竭心臟的收縮和舒張功能，這與臨床廣泛應(yīng)用的正性肌力藥Na－K泵抑制劑強(qiáng)心苷類相比，有可能成為一種既能促進(jìn)心肌收縮，又能促進(jìn)心肌舒張，有效改善心功能治療心功能不全的新思路。