氯化鋰－匹羅卡品誘發大鼠癲癇持續狀態后腦內ｃ－ｆｏｓ蛋白表達的動態觀察

摘要：目的在氯化鋰一匹羅卡品誘發癲癇持續狀態模型中觀察c-fos蛋白表達的時程變化。方法采用氯化鋰一匹羅卡品誘發癲癇持續狀態大鼠模型，觀察大鼠的行為改變，并用免疫組化方法觀察癲癇持續狀態后不同時間點腦內c—fos蛋白表達的變化。結果癲癇持續狀態后6h，1d時腦內c—fos蛋白表達最高，3d時表達次之，7d時極少數表達并接近對照組表達水平。結論癲癇持續狀態后腦內c—fos蛋白表達持續較長時間；在此時期應給予干預措施，以減低腦內神經元損傷可能。

關鍵詞：氯化鋰一匹羅卡品；癲癇持續狀態；c—fos蛋白

中圖分類號：R749.1 R255.2

文獻標識碼：A

文章編號：1672—1349(2007)05—0419—02

癲癇持續狀態(status epilepticus，SE)是指一次癲癇發作持續30rain以上或連續發作多次，發作間歇期意識不恢復者。癲癇持續狀態是神經科危急重癥之一，癲癇持續狀態中腦損害明顯的癲癇約占61％～88％，必須從速制止發作，否則危及生命。目前，作為神經元活動的標記物fos蛋白已經廣泛用于研究動物神經元對癲癇發作的反應。不同的癲癇模型均可以誘發fos蛋白在大腦神經元中表達。本實驗選用氯化鋰一匹羅卡品誘發大鼠癲癇持續狀態，觀察fos蛋白在腦內表達的動態變化。

1 材料與方法

1．1實驗動物成年健康雄性Wistar大鼠32只(山西醫科大學實驗動物中心提供)，體重200g～250g。隨機分為實驗組26只和對照組6只，飼養于正常晝夜環境中，給予標準飼料及飲水。

1．2氯化鋰－匹羅卡品癲癇持續狀態模型制作 大鼠腹腔注射氯化鋰3mEq／kg(中國醫藥集團上海試劑公司)，18h后再腹腔注射新鮮配制的匹羅卡品30mg／kg(Sigma公司)。對照組大鼠給予生理鹽水腹腔注射。給藥大鼠在15min～45min出現反復強直一陣攣發作，形成癲癇持續狀態。按照經典的Racine癲癇發作行為標準進行癲癇的行為觀察記錄。0級：無任何反應，正常行為狀態；I級：面部陣攣，包括眨眼、動須、節奏性咀嚼等；Ⅱ級：I級加節律性點頭；Ⅲ級：Ⅱ級加前肢痙攣；Ⅳ級：Ⅲ級加后肢站立；V級：Ⅳ級加摔倒。實驗組動物發作級別均達到Ⅳ級以上。于癲癇持續狀態后60 min腹腔注射地西泮(安定，4 mg/kg)以終止癲癇持續狀態，降低病死率。實驗組按照發作后6h，1d，3d，7d再分為實驗1組、2組、3組、4組。

1．3標本采集與處理實驗組大鼠分別在癲癇持續狀態發作后6 h，1d，3d，7d及對照組大鼠，用5％水合氯醛按5mL／kg腹腔注射麻醉后，斷頭取腦。鼠腦組織在4％的多聚甲醛中固定24h，經石蠟包埋后，在海馬部位做矢狀位切片，片厚約10μm。

1．4 c—fos免疫組化染色常規間接漂染法進行免疫組化染色(試劑選用北京中山生物技術有限公司)。一抗為兔抗c—fos蛋白多克隆抗體，二抗為抗兔IgG辣根過氧化物酶。

1．5圖像分析和統計學處理采用Mias(2000型)圖像分析系統對海馬及海馬皮層clos蛋白免疫反應陽性細胞進行定量計數。實驗數據采用SPSS11.5軟件進行統計學處理。檢測結果用均數±標準差(x±s)表示。多樣本均數比較采用方差分析，P<0.05為有統計學意義。

2 結果

2 1行為學觀察對照組未出現癲癇發作。模型組大鼠在給予匹羅卡品后15min～30nln均出現洗臉樣動作、節律性咀嚼、點頭等面部痙攣樣動作；隨后出現前肢陣攣，之后很快表現為前肢陣攣伴站立，進一步發展到全身強直陣攣發作伴站立、摔倒，反復發作，達到癲癇持續狀態。模型組大鼠成功24只，成功率92.31％，死亡2只，死亡率7.69％。

2．2 c-fos免疫組化染色結果 c-fos陽性細胞為棕黃色，圓形或橢圓形，胞核著色最深?對照組大鼠海馬結構及皮層有極少數c-fos免疫反應陽性細胞表達。模型組大鼠癲癇持續狀念后6h，1d海馬結構及顳葉皮層c-fos免疫反應陽性細胞顯著表達；大鼠癲癇持續狀態后3d，海馬結構及皮層c-fos免疫反應陽性細胞明顯表達；大鼠癲癇持續狀態后第7天，海馬結構及皮層c-fos免疫反應陽性細胞極少數表達，接近對照組。詳見表1。

3 討論

氯化鋰－匹羅卡品致癇大鼠模型是近年來國內外麻用較多的一種公認的邊緣系統癲癇模型，是Honchar等于1983年首次報道的，該模型使匹羅卡品的用量減少，降低了因匹羅卡品毒副反應所導致的動物死亡率，是目前研究癲癇持續狀態和復雜部分性發作對腦部影響最常用的動物模型之一。故本實驗選用氯化鋰－匹羅卡品誘發頌癇持續狀態模型，成功率較高為92.31％，死亡率為7.69％，進一步驗證了該模型是研究撕癇持續狀態的理想模型而且，氯化鋰和匹羅卡品腹腔注射間隔18h～20h，是誘發癲癇的最佳時間，與文獻報道相符。

c-fos基因作為神經功能活動的代謝性標志物，在癲癇研究中被大量應用。它屬于即早基因(inmlediate early genes，lEG)，為細胞受刺激后表達的基因，包括c-fos，c-jun，jun－b，jun—d等。c-fos基因編碼的c-fos蛋白是一種核蛋白，c-fos蛋白與Jun家族蛋自形成一個二聚體AP－1(active protein－1，AP-1)，AP-1復合物與細胞基因中的AP-1序列結合而發揮其調節轉錄的作用。正常情況下，細胞內c-fosmRNA和fos蛋白水平均很低，而在各種化學和電刺激所造成的癲癇活動中，其表達很顯著。c-fos和fos的大量表達將干細胞核的修復功能而使細胞走向凋亡。1987年Dragunow和Robertson在研究過程中首次發現，電刺激誘導的癲癇活動能夠快速而短哲的使大鼠齒狀回顆粒細胞核內的c-fos蛋白免疫反應活性增強。在神經系統中，c-fos蛋白的表達程度與癲癇所致的神經元活動程度有關。而且c-fos蛋白的表達情況也隨著發作后時間間隔的變化而變化，Wagner等報道，c-fos在大鼠缺血缺氧96 h可以高表達并且持續較長時間，推斷其原因可能為缺血缺氧導致神經元遲發性壞死所致

本實驗成功誘發癲癇持續狀態模型，并對c-fos蛋白表達時程作初步研究。結果顯示在1h的癲癇持續狀態結束后6 h及1d，在大鼠海馬及顳葉皮層c-fos蛋白表達顯著；大鼠癲癇持續狀態后3d，海馬結構及皮層c-fos免疫反應陽性細胞明顯表達；大鼠癲癇持續狀態后7d，海馬結構及皮層c-fos免疫反應陽性細胞極少數表達，接近對照組。本研究結果顯示癲癇持續狀態后如小采取干預措施，腦內神經元損傷將持續較長時間。實驗結果與以往研究比較，c-fos蛋白表達顯著和表達時間較長，可能與以下因素有關：①所選擇的模型不同，以往研究選用的是杏仁核電刺激誘發癲癇；②癲癇持續狀態的時間和強度不同，本實驗癲癇持續狀態大鼠發作均達到Racine 4、5縱發作，持續時間達1h，Kondralyev等研究證實癲癇持續狀態超過30min，神經元就會壞化。本實驗中c-fos蛋白表達時間延長可能與神經元壞死有關；③所選擇的動物不同，本實驗選擇的大鼠為2月齡雄性大鼠，體重200g～250g，較易誘發癲癇持續狀態

fos蛋白或c-fos mRNA的表達作為中樞神經系統功能活動的代謝性標志物，對于研究癲癇持續狀態神經元的損傷機制損傷持續時間有重要的意義，可為進行干預措施提供依據。目前，fos蛋白或c-fosmRNA已廣泛應用于對癲癇的定位研究，探討癲癇發生的機制，抗癲藥物的篩選和評價，隨著分子生物學和免疫化學實驗技術的發展，c-fos/fos的表達定量會更加精確，無論單獨應用還是與其他方法合用，都有重要的參號價值，將會在癲癇的研究中發揮更大的作用。

作者簡介：薛國芳(1976—)，女，在讀碩士，現工作于山西醫科大學第二醫院(郵編：030001)；鄭輯英、李光來、王荔，工作于山西醫科大學第二醫院；劉勇，現為日本國立弘前大學醫學部在讀博士

(本文編輯 王雅潔)