益母草生物堿對心肌梗死大鼠心功能及肌漿網鈣泵的活性及其蛋白水平的影響

摘要：目的探討益母草生物堿對大鼠心肌梗死后心功能保護作用的機制：方法 采用左冠狀動脈前降支結扎制作大鼠心肌梗死模型，通過大鼠血流動力學指標以及心肌肌漿網鈣泵的活性(SERCA2a)及其蛋白水平來反映益母草生物堿對大鼠心肌梗死后心功能的影響不明顯(P<0.05)。結果益母草生物堿可以顯著提高模型大鼠左室收縮壓以及左室內壓最大上升速率(P<0.05)，降低模型大鼠左室舒張末壓以及明顯提高左室內壓最大下降速率(P<0.5)；益母草生物堿對模型大鼠心肌組織SERCA2a活性及SERCA2a含量均有顯著提高(P<0.05)。結論益母草生物堿能夠提高冠狀動脈結扎大鼠心肌收縮舒張功能，其可能機制是提高大鼠心肌組織SERCA2a活性及含量。

關鍵詞：益母草生物堿；心肌梗死，急性；血流動力學；肌漿網鈣泵

中圖分類號：R541.4 R285.5

文獻標識碼：A

文章編號：1672 1349(2007)05—0409—03

益母草為唇形科益母草屬(Leonurus heteropyllus Sweel)植物，現代藥理學研究表明，益母草有著廣泛的生物學活性，其主要活性成分為生物堿、總黃酮、二萜類等。益母草生物堿對異丙腎上腺素造成的大鼠心肌損傷具有保護作用，并能改善大鼠冠狀動脈左前降支結扎造成心肌梗死后的心功能。本次研究目的在于探討益母草生物堿改善冠狀動脈結扎致心肌梗死后模型大鼠心功能作用的可能機制。

1 材料與方法

1．1實驗材料

1．1．1動物清潔級SD雄性大鼠，體重(300±20)g，由上海中國科學院實驗動物中心提供(動物合格證號：02569)。

1．1．2主要儀器Powerlab8/30多道生理記錄儀，澳大利亞埃德儀器公司生產；AC－C8小動物呼吸機，上海奧爾科生物技術有限公司生產；miniVE垂直電泳系統，安瑪西亞公司生產；TS－1型脫色搖床，江蘇海門市其林貝爾儀器有限公司生產；DU－800分光光度計，美國貝克曼庫爾特有限公司生產。

1．1．3藥品益母草生物堿由上海中醫藥大學中藥制藥工程實驗室提供，純度達95％，每毫升含生藥10 g；卡維地洛(Carvedil01)，每片25mg，德國曼海姆生產(批號：MH6600806)，上海羅氏制藥有限公司分裝(分裝批號：SH0007)。

1．1．4試劑BCA蛋白濃度測定試劑盒、組織裂解液，碧云大生物技術研究所提供；甘油醛－3－磷酸脫氫酶(GAPDH)，上海康成生物工程有限公司提供；小鼠抗大鼠肌漿網鈣泵鈣ATP酶(SERCA2a)，美國ABR公司提供。

1．2模型制作參照冠狀動脈結扎法并略加改動。大鼠用3％戊巴比妥鈉(45mg/kg)腹腔麻醉后，仰臥固定于手術臺上，氣管插管后，給予人工呼吸(頻率90/min，潮氣量16mL/min～20mL/min)。左胸第4肋間逐層分離，左心耳下緣及肺動脈圓錐之間，結扎左冠狀動脈左前降支。結扎后觀察心電圖變化，以ST段持續抬高作為造模成功標志。假手術組進針同模型組，但不結扎。

1．3分組與給藥清潔組SD大鼠共62只，正常組10只，假結扎組12只，其中因手術意外死亡1只，其余40只大鼠于造模后3d之內死亡9只，存活31只，手術存活率為77.5％?存活大鼠分為模型組、卡維地洛組及益母草生物堿組(生物堿組)，每組10只，另1只丟棄。給藥方法：模型組以生理鹽水灌胃；卡維地洛組按30mg/(kg·d)劑量灌胃；生物堿組按30g/(kg·d)劑量(相當于人體用藥量的5倍)灌胃。正常組及假結扎組均給予生鹽水灌胃。

1．4觀察指標

1．4．1 血流動力學榆測 各組大鼠給藥4周后，行右側頸總動脈插管，記錄心率、動脈平均壓、舒張壓及收縮壓后，行左心室插管，記錄左室舒張末壓(LVEI)P)、左室收縮壓(I.VSP)、左室內壓最大上升速率(+dp/dt^max)，左室內壓最大下降率(－dp／dt^max)。

1．4．2 大鼠心肌組織SERCA2a活性測定 取左心室肌組織5.0mg加0.5mL組織勻漿液(含PMSF)勻漿，4℃，12000r/min，離心5min，取上清液采用BCA法測定蛋白濃度，調節樣品蛋白濃度至1000pg／mL。30℃水浴10 min，加入20pLATP，30s后加入20uL樣品，混勻后45 s后測定OD值。每個樣品均測定不同Ca^Z+濃度下的OD值，制作曲線后，計算最大值。

1．4．3大鼠心肌組織SERCA2a相對表達量測定樣品制備同前。制備SDS－PAGE膠，蛋白上樣量為50ug，分離膠用100 V電泳，電泳至溴酚藍剛跑出即終止電泳。將膠片掃描后，通過圖像分析軟什測定日的條帶及內參的光密度值，計算日的蛋白的表達量。

1．5統計學處理計量資料以均數±標準差(x±s)表示，多組間兩兩比較采用單因素方差分析。并且采用SPSS 12.0以及Prism 4.0生物醫學統計軟件分析和制圖。

2 結果

2．1實驗大鼠一般情況實驗大鼠共62只，正常組10只，假結扎組12只，其中因手術意外死亡1只，其余40只大鼠于造模后3d之內死亡9只，存活31只，手術存活率為775％。動物實驗結束后，因梗死面積不符合要求而排除的大鼠有4只，其中模型組2只，生物堿組2只。術后2周始，模型組大鼠逐漸出現毛發光澤不良，少數大鼠活動能力下降。

2．2各組大鼠動脈平均壓、舒張壓、收縮壓及心率比較模型組大鼠動脈平均壓、動脈舒張壓均明顯低于正常組與假結扎組(P<0.05)；模型組大鼠與正常組及假結扎組比較，心率、動脈收縮壓均降低但差異無統計學意義(P>0.05)。生物堿組大鼠動脈平均壓、動脈收縮壓、動脈舒張壓以及心率與模型組及卡維地洛比較無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

2．3各組大鼠血流動力學比較模型組大鼠左室收縮壓、左室內壓最大上升速率以及左室內壓最大下降速率均明顯低于假結扎組，而左室舒張未壓卻明顯高于假結扎組與正常扎(P<0.05)。生物堿組、卡維地洛組大鼠左室收縮壓、左室內壓最大上升速率均明顯高于模型組(P<0.05)、生物堿組的左室收縮壓、左室舒張末壓、左室內壓最大上升速率以及左室內壓最大下降率與卡維地洛組比較無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

2．4 各組人鼠心肌組織SERCA2a活性及含量比較 結果顯示，模型組SERCA2a活性明顯低于正常組及似結扎組(P<0.01)；模型組SERCA2a活性也明顯低于生物堿組及卡維地洛組。模型組SERCA2a含量，明顯低于正常組及假結扎組(P<0.01)。詳見表2。

表2各組大鼠心肌組織SFRCA2a活性及含量比較(x±s)

3 討論

心力衰竭是多種心血管疾病的終末期表現，而心肌梗死后的心力衰竭已成為臨床心力衰竭最常見的類型。在心肌梗死后發展成心力哀竭的過程中，機體發生了大量的神經內分泌及基因等方面的變化，最終導致心肌收縮舒張性能下降，血流動力學出現異常。本實驗也發現，大鼠經冠狀動脈前降支結扎造成心肌梗死后模型大鼠出現了明顯的血流動力學指標的異常，以反映心肌收縮與舒張性能的±dp／dt^max變化最為明顯。研究表明，Ca²⁺在維持心肌細胞的收縮、舒張功能中起著決定性的作用。其中，心肌肌漿網(sarcoplasmic reticulum，SR)中的SERCA2a在鈣離子周期性變化中起著關鍵性的作用。心臟舒張時，SERCA2a的主要作用就是降低細胞內鈣離子的濃度，它將細胞漿內鈣離子泵入肌漿網內。研究表明，在心肌缺血、壓力負荷導致的心肌肥大及心力哀竭的動物模型及嚴重的心肌肥大及心力衰竭病人中，心肌股漿網SERCA2a的mRNA及蛋白水平均降低，反映了心肌細胞在維持最適宜細胞內Ca^Z+濃度方向的缺陷。而Frank等發現心力衰竭病人左心室肌與正常心肌相比SERCA2a mRNA和蚩白表達未見明顯改變，但SERCA2a活性則降低32％，心肌肌漿網攝取Ca^Z+功能的卜降，胞漿內Ca^Z+轉運受到不同程度的障礙，Ca^Z+穩態被破壞，從而延長心肌細胞舒張期Ca^Z+瞬變，導致心肌舒張功能異常。陳穎等，通過轉基因方法觀察發現，轉基因高表達SERCA2a可改善大鼠心肌梗死后1個月的心肌舒張功能，減少重構。在正常心臟，增加對心臟的刺激頻率將提高心肌收縮力，這部分原因是由于SR中鈣離了的凈增加，這種變化在每次心搏中均發生周期性的變化。心力衰竭的特點是，隨著心搏頻率的增加，其收縮力反而降低，導致心肌收縮力貯備減低或缺乏，甚至產生逆轉，從而導致負性力一頻率關系。有學者認為，SERCA2a含量可直接影響Ca^Z+的儲備量。由于心肌釋放Ca^Z+是由其Ca^Z+儲備量決定的，Ca^Z+儲備量的減少直接導致SR的Ca^Z+釋放量的減少。對衰竭心臟進行研究發現，SERCA2a轉動鈣離子的活性明顯降低。本次實驗證明，益母草生物堿能明顯提高冠狀動脈結扎模型大鼠左室收縮壓以及左室內壓最大上升速率，表明益母草生物堿在提高大鼠心肌收縮力方面有較好作用，這可能與益母草生物堿能夠提高模型大鼠心肌組織SERCA2a含量有關。SERCA2a活性實驗數據表明，益母草生物堿還能提高模型大鼠心肌組織SERCA2a活性。表明益母草生物堿在心肌肌漿網攝取Ca^Z+功能方面也有明顯改善作用，這與益母草生物堿能降低模型大鼠左室舒張末壓、提高左室內壓最大下降速率是吻合的，說明益母草生物堿對心肌梗死大鼠心肌舒張功能也有改善作用。因此認為，益母草生物堿在改善收縮與心肌舒張功能方面均有作用。其提高SERCA2a含量及活性的分子機制還待進一步研究。

作者簡介：姜水印(1964－)，男，畢業于上海中醫藥大學，副研究員，博士研究生，現工作于上海中醫藥大學(郵編：201203)；呂嶸、黃品賢，工作于上海中醫藥大學；劉春燕，工作于湖南中醫藥大學；衛洪昌(通訊作者)，工作于上海中醫藥大學(郵編：201203)。

(本文編輯 王雅潔)