神經干細胞移植在脊髓損傷修復中的應用進展

中圖分類號：R392.4

文獻標識碼：A

文章編號：1672—1349(2007)05 0431—04

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是臨床治療的世界性難題。SCI后的病理損害分為原發性SCI和繼發性SCI。SCI治療的難點有如何使缺損的神經元再生，如何恢復功能性軸突的傳導功能。國內外傳統治療SCI最常用的方法有手術治療、藥物治療、康復訓練等，但這些方法并不能從根本上解決神經元再生的問題。神經干細胞(nerual stem cells，NSCs)移植是20世紀末神經生物學領域最重要的進展之一，因其具備自我更新和多分化潛能的兩個基本特性以及遷移功能和良好的組織融合性的優點，而成為細胞移植治療神經系統疾病良好的移植材料，為SCI的治療提供了新的方法。

1 神經干細胞研究現狀

1．1神經干細胞移植的生物學特性NSCs是指具有分化為神經元細胞、星形膠質細胞、少突膠質細胞的能力，能自我更新，通過不對稱分裂產生除自身以外的其他細胞，并足以提供大量腦組織細胞的干細胞。其生物學特性有5方面。①趨化性：NSCs具有位置特異性的分化潛能，其增殖、分化和遷移，與細胞外基質(ECM)有非常密切的關系；②歸巢性：NSCs在移植過程中，有向著其起源部位，或功能及解剖區域的特殊趨化作用；③遷移性：NSCs移植后，其細胞的密度從注射區向周圍逐漸減少；④分化性：包括神經系統損傷區域內局部的微環境影響NSCs移植后的分化；骨髓和臍血間充質干細胞向神經原樣細胞分化；⑤抗原性：NSCs是未分化的原始細胞，不表達成熟的細胞抗原，具有低免疫源性，因此在移植后相對較少發生排斥反應。NSCs因上述特性而成為神經系統疾病較理想的移植材料。

1．2神經干細胞移植治療脊髓損傷的可行性NSCs的作用有：①NSCs分化后產生的神經元可釋放多種神經遞質并參與電生理傳導；少突膠質細胞主要在白質區域生成髓鞘；星形膠質細胞和小膠質則參與血腦屏障的建立并分泌某些神經營養囚子。NSCs能改善脊髓局部微環境并啟動再生相關基因的順序表達，使損傷軸突開始再生，它們同時產生多種ECM，填充脊髓損傷后遺留的空洞，為再生軸突提供支持物，同時分化出來的神經元可以和損傷脊髓形成廣泛的神經纖維聯系和突觸連接；②補充外傷后缺失的神經元和膠質細胞；③使殘存脫髓鞘的神經纖維和新生的神經纖維形成新的髓鞘，保持神經纖維功能的完整性。

1．3神經干細胞的移植來源 Gage發現神經干細胞來源主要有以下5方面。①胚胎組織來源NSCs：包括胚胎腦組織來源和胚胎干細胞來源；②成體組織來源NSCs：包括從出生到成年期腦組織的廣泛區域；③神經嵴細胞：神經嵴細胞能自我更新，能夠分化形成多種細胞類型，發育早期的神經嵴細胞對骨形成蛋白－2信號更加敏感，說明可能有更大的分化潛能；①原代細胞培養：原代細胞培養即從腦內特定的部位分離出NSCs，并在體外合適的條件下培養，可直接用于神經細胞移植。優點可以與其他神經細胞整合，完成生理學上的細胞替換，理論上可以作為把基因移植的最佳載體細胞；⑤建立“永生化”NSCs系，最常用的方法是通過反轉錄病毒將編碼癌基因蛋白克降到胚胎NSCs中，改變細胞的表型，使部分細胞渡過細胞分裂的危象期而獲永生化。永生化的細胞可以攜帶外源性基因，這對于神經系統的基因治療帶來了希望。目前國內基礎研究用的NSCs大多是動物胚胎腦組織、胚胎干細胞、人胚胎干細胞來源。臨床應用的NSCs大多是骨髓來源(自體或異體)、臍血干細胞來源(肄體)。目前臨床上運用NSCs治療脊髓損傷，多采用人臍血來源的干細胞，其具有來源充分、采集方便且免疫系統處于原始狀忿、較原始的造血干細胞及間質細胞等具有更強的增殖和分化能力、病毒感染機會較少等優點。

1．4神經干細胞的移植途徑 NSCs采用細胞懸液移植。移植方法可以分為：①將小神經球消化成單細胞懸液，采用立體定向的方法移植到病變部位；②側腦室內細胞懸液注射法，阮奕文等將NSCs注射到腦梗死大鼠側腦室內，發現移植細胞可以穿過室管膜上皮，并遷移到梗死灶周圍。但無論是靜脈或是側腑室細胞移植法，都依賴于NSCs向病變部位的遷移，所以報道雖認為有效，還沒有可靠的、定量的研究證實大多數細胞能最終到達病灶而發揮作用。特別是靜脈內注射法，迄今還沒有任何依據證實NSCs通過何種機制持異性識別腦血管。并能從結構斂密的腦血管中“游出”，因此，這類移植方法還有賴于進一步研究。如果用于臨床，NSCs通過局部手術移植，病人存在手術風險問題，且不能反復移植以保證干細胞的數量而受到制約。

1．5神經干細胞的移植時機Okano等認為移植選擇急性期，大量自由基及興奮性氨基酸等物質的存在，NSCs存活和分化數量少，再通的神經纖維數日少。如果選擇恢復期，則可能出現俘活的細胞數量較多，但損傷區域膠質瘢痕已經形成導致再通的神經纖維數目少，因此動物實驗證明移植的最佳時機應該是損傷后1周～2周，代廣輝等研究兔脊髓損傷后2周～4周以及4周后進行移植NSCs，在此期間移植治療脊髓損傷效果均不理想，可使NSCs在宿主體內長期存活、增殖、分化，并且可以與宿主進行融合，以利于對損傷脊髓的修復。但考慮人與動物區別，上述“時間窗”僅供參考，最佳移植時機需大量臨床試驗做進一步的總結。

2 神經干細胞治療脊髓損傷的研究現狀

2．1 神經干細胞單獨移植治療脊髓損傷 Nakamura等用TP標記移植到獼猴SCI的人NSCs，發現NSCs可以存活、遼移、分化，神經微絲的生長、前肢肌力以及自發性運動活動均優于似手術組。這證明了NSCs的特性，且能促進肢體運動功能的恢復。李立新等研究NSCs治療SCI鼠髓鞘結構的修復作用機制時，發現NSCs能明顯增強PLP mRNA的表達，促進MBP陽性的髓鞘結構再生和修復，使肢體的運動功能得到明顯的改善。李成仁等探討NSCs移植在恢復SCI傳導功能的機制時，用CESP和HRP逆行示蹤技術觀察大鼠SCI傳導功能恢復情況，發現NSCs組的CESP有所恢復但潛伏期較長。王巖峰等在探討NSCs移植促進SCI修復的機制時，應用RT-PCR法觀察NSCs移植后，大鼠脊髓損傷區膠質細胞DNF和GAP-43基因表達的變化。BDNF通過神經肽的表達來維持細胞內Ca²⁺的穩定，并通過抗自由基損傷、提高細胞內抗氧化酶的活性米刺激細胞的修復。發現NSCs組能明顯上調BDNF mRNA，并促進GAP－43mRNA的表達，能改變脊髓損傷區的做環境。劉嬡等也應用RT—PCR法及膽堿酯酶染色的方法，證明了NSCs能較好地恢復軸突運輸功能并對下肢運動終板有一定的保護作用，在實現了神經元和靶器官突觸連接中起到一定的作用。盧坷恩等在探討NSCs移植脊髓損傷細胞保護作用機制的研究中，對各組大鼠進行了爬坡實驗及MEP的檢測，表明NSCs移植后組織水腫減輕，Na⁺、Ca²⁺顯著降低，K⁺，Mg²⁺顯著升高。這提示，NSCs對SCI的保護作用饑制可能與其減少神經細胞離子失衡，改善細胞內微循環有關。Mitsui等探討永生化NSCs移植對SCI大鼠排泄功能的影響，發現NSCs組的單位排尿量明顯增加、排尿壓力明顯減小、殘余尿量明顯減少，NSCs能促進低級排尿中樞功能的恢復、Lu等認為NSCs在神經系統損傷唇有替代缺失組織的潛能，實驗發現NSCs在體外能持續分泌幾種特殊的神經營養因子，促進軸突的生長，經RT－PCR檢測移植的干細胞能在活體內表達神經營養因子，經皋因修飾的NSCs能表達促進宿主軸突牛長的NT－3。證明NSCs能分泌牛長因子促進宿主神經的生長，基因傳遞加速這種作用。

2．2神經干細胞綜合移植治療脊髓損傷 Cai等在探討lentivirus介導基因工程的人胚NSCs的作用時，發現含有轉基因人胚NSCs的培養液能誘導鼠背根神經節軸突的迅速增長，所有基因工程的人神經f細胞能表達高水平的GFP和NT－3，此項研究表明lentivirus介導基因工程的人胚NSCs不但能促進軸突的再生，同時能成功的表達多種基因。Kegami等發現單純的NSCs移植雖然可以促成SCI的修復，但在某些情況下，移值的NSCs容易黏附在某些活體空腔壁上，較難移行和融合到宿主組織，軟骨素黏蛋白(CSPG)作為神經膠質疤痕的構成物能住脊髓損傷后強烈表達，是活體內NSCs移植的抑制劑，因此運用軟骨素酶親和一生物素復合物(C-ABC)聯合NSCs移植治療SCI，并比較基因介導組與單獨移植組的區別，發現C-ABC能稀釋CSPG對移植細胞遷移的抑制作用，促進移植細胞與宿主的融合，促進_5H性蛋白43纖維數目的增多和生長，這表明CABC、介導的移植組通過減少膠質瘢痕抑制作用以促進NSCs在體內的遼移和宿主融合性。Castellanos等認為軸突雖然在合適的酶作用下有能力再生，但如果缺乏合適纖維生長靶位就會限制脊髓環路的修復。因此，為解決這一問題，首先將TRK－C基因和NT-3因子修飾的伸經前體細胞移植釗完整的大鼠脊髓內，觀察他們的存活與分化，發現兩種處理因素聯用能促進NSCs的存活，減少向星彤膠質細胞的分化，并能填補脊髓空洞、促進B－微管蛋白纖維在移植細胞周圍的增生。郭加松等在NT－3修飾NSCs與NSCs聯合移植治療脊髓全橫斷損傷的研究中，發現SCS經NT－3基因修飾后，過量分泌的NT－3不僅能防止脊髓損傷后神經元的萎縮，促進脊髓損傷結構與功能修復的效果更好，促進受損傷的上行和下行軸突再生。當二者聯合移植時有相互促進作用。李巍等在脊髓損傷大鼠的研究中發現采用BDNF修飾NSCs移植后，BDNF基因修飾的NSCs能在脊髓損傷移植處存活，強烈表達BDNF。李成仁等在腎母細胞瘤過度表達基因(NOV)修飾NSCs移植對損傷大鼠脊髓功能的研究中，發現NOV修飾的NSCs和分化出來的子代細胞能恒定表達NOV蛋白，而分化出來的不成熟星形膠質細胞可引導神經元的遷移和軸突的生長。周健洪等對于骨形成蛋白4(BMP4)對SCI后大鼠功能和NSCs的影響研究表明：BMP4可減輕神經損傷癥狀和對脊髓損傷后神經干細胞有促進增殖作用。Teng等研究表明植入了NSCs專門的聚合體支架能使大鼠的共濟運動及后肢承重功能得到明顯的改善。程映華等用殼聚糖及NSCs復合物橋接成年SD大鼠完全性脊髓損傷，可使損傷脊髓恢復解剖上的連續性，植入的復合材料與宿主脊髓達到良好的整合，再生的軸突穿過宿主移植物界面。復合材料在移植后脊髓斷端發揮橋梁作用，使再生的神經軸突能跨越損傷區。李曉濱等在督脈電針與NSCs聯合應用促進全橫斷脊髓損傷研究，這一機制可能為督脈電針促進受損傷的脊髓組織細胞代謝過程，引起細胞膜的腺苷酸環化酶活性增高，使ATP生成CAMP增加，從而激活神經元和神經膠質細胞內蛋白激酶A的級聯反應，啟動神經生長因子和細胞營養因子等蛋白質的合成和分泌過程，從而促進脊髓內神經干細胞的存活和分化，以及促進受損神經元的存活及其軸突再生。

3 結語

NSCs移植在實驗研究中已取得了較顯著的進展，但畢竟動物的解剖、病理生理與人存在差異較大，因此NSCs移植人人體后，仍存在著較多的問題。①干細胞的培養和純化問題，來源涉及倫理問題，尤其是異體胚胎干細胞的采取，如何保證培養的細胞在人體內一定分化為NSCs而不是其他類型的組織細胞；②移植的時機，雖然已有動物實驗研究證明在脊髓損傷后1周～2周移植治療效果較好，但由于動物與人存在差異，臨床移植的最佳時機，仍沒有確切的答案；③病例的遴選是否有特定的范圍，存在著有效和無效的病例，這種情況產生的原因是什么?④尚有不為人知的副反應，如軀體不適、免疫排異反應、能否發生突變產生腫瘤；⑤在移植入人體后，采取何種指標顯示其存活、分化。這一切都需要進一步的臨床研究，相信這些問題隨著研究的深入，都會得到不同程度的解決。

作者簡介：趙寧(1976－)，女，現為湖南中醫藥大學2004級碩士研究生(郵編：518052)；楊萬章，工作于深圳市第六人民醫院。

(本文編輯 王雅潔)