局部應用血管內皮細胞生長因子對大鼠缺血皮瓣存活能力的影響

【摘要】 目的 觀察血管內皮生長因子(VEGF)對大鼠缺血皮瓣存活能力的影響。探討其作用機制和局部更有效的給藥途徑。方法 將45只SD大鼠，隨機分為A、B、C三組，每組15只。于背部作6 cm×1.5 cm蒂位于雙側髂棘連線上的全層缺血皮瓣。A組在皮瓣下注射生理鹽水，B組皮瓣下注射VEGF生理鹽水溶液，C組皮瓣下放置含VEGF生理鹽水溶液明膠海綿，原位縫合皮瓣。術后第3，7，14 d觀察缺血皮瓣的成活面積，并進行組織學觀察，用RTPCR方法檢測皮瓣中VEGFmRNA 的含量。結果 14天時，C組皮瓣的成活面積率明顯高于B組(P<0.05)，且B組高于A組(P<0.05)。B組VEGFmRNA表達水平高于A組但低于C組(P<0.01)。結論 VEGF的局部應用，可以加速皮瓣內血管再生，從而改善了大鼠缺血皮瓣遠端的血供狀態，尤其采用明膠海綿攜帶VEGF皮瓣下放置的方法，更能明顯地增強缺血皮瓣的成活能力。

【關鍵詞】 大鼠；血管內皮細胞生長因子；缺血皮瓣；明膠海綿；成活率

文章編號：1003-1383(2007)02-0115-03

中圖分類號：R 622⁺.1 文獻標識碼：A

皮瓣的成活在修復與重建外科領域是一個很關鍵的問題。尤其是提高缺血皮瓣的成活能力更是研究的重點。引起皮瓣壞死的主要原因是皮瓣血流動力學的改變，動脈血供不足，靜脈排流不暢，或者是二種情況同時存在。而血管內皮細胞生長因子（VEGF）通過與存在于血管內皮上的其受體特異性結合，刺激血管形成，同時在促進創傷愈合與組織修復、促進組織再生方面起著十分重要的作用。本實驗通過建立大鼠背部缺血皮瓣模型（蒂∶長度＝4∶1），主要通過RTPCR方法來觀察以不同方式給予外源性VEGF后，對皮瓣成活能力的影響。

材料和方法

1.材料 試驗動物：選健康SD大鼠，體重250～280 g，雌雄不限、由錦州醫學院實驗動物中心提供。VEGF購自美國RD Systems公司。VEGFmRNA RTPCR試劑盒購于上海生工生物工程技術服務有限公司。

作者簡介：王繼紅(1973-)，女，遼寧省錦州市人，主治醫師，醫學碩士。

2.造模 將45只大鼠隨機分為A、B、C三組，每組15只。腹腔內注射氯胺酮100 mg/kg麻醉，無菌條件下，于背部作6 cm×1.5 cm［1］蒂部位于雙側髂棘連線上的全層皮瓣，皮瓣內包括背部肉膜層，在背部肌膜的淺面進行解剖。用無菌生理鹽水將VEGF配成10 ng/100 μl的工作液。術中皮瓣形成后，各組分別給予下述處理：①A組：于皮瓣雙側緣的2 cm、4 cm處， 及最遠端中心點的供區及受區5對共10個位點，每位點皮下注射100 μl生理鹽水，每瓣共1 ml。②B組：同A組的10個位點每一位點注射VEGF工作液100 μl，每瓣共1 ml，含VEGF100 ng。③C組：將6 cm×1.5 cm明膠海綿先敷于創面上，待其濕潤后同A組的5對位點將100 ng 的VEGF溶液注入到明膠海綿上。 用1號絲線間斷原位縫合皮瓣。

3.檢測指標 ①外科觀察：觀察愈合過程中皮瓣的顏色、質地、組織水腫、壞死、炎癥情況。術后每日定時觀察并記錄。②瓣成活率檢測：于術后3天、7天和14天，用硫酸紙準確描繪各組皮瓣的形態，壞死區域用墨汁涂黑，數碼照相，用圖象分析軟件PHOTO SHOP予以分析。皮瓣成活率=(原始皮瓣面積－壞死皮瓣面積)/原始皮瓣面積×100%。③組織學觀察：分別于第3 d、7 d、14 d，每組處死5只動物。取皮瓣中遠段(5 cm)處0.5 cm×1.0 cm組織塊，置40 g/L中性福爾馬林溶液中固定后，石蠟定向包埋，連續切片，片厚5 μm，行HE染色后用普通光鏡觀察。

4.VEGFmRNA的檢測 分別于術后3、7、14 d，切取三組大鼠相同部位的有活力的皮瓣組織，取材后快速放入液氮中冷凍。組織徹底凍透后放入-90℃冰箱里保存。 RTPCR的檢測步驟為：①總RNA提取；②按逆轉錄試劑盒說明操作進行逆轉錄反應；③PCR擴增。PCR反應參數：94℃預變性4 min。然后，94℃ 50 s、53℃ 50 s、72℃ 50 s，共35個循環，最后延伸7 min，得到反應產物。VEGF正義引物序列為：5’TGC ACC CAC GAC AGA AGG GGA3’，反義引物序列為5’TCA CCG CCT TGG CTT GTC ACA T3’，擴增產物的片段為：VEGF121-360 bp，βactin正義引物序列為：5’GGT GGG TAT GGG TCA GAA3’；反義引物序列為5’TGC ATC CTG TCA GCG ATG3’，擴增產物的片段為801 bp。引物由上海生工生物技術工程有限公司合成。取10 μl PCR產物上樣，20 g/L瓊脂糖凝膠電泳。掃描電泳照片，用凝膠成像系統測定PCR產物條帶灰度值，以VEGF與相應內參βactin基因條帶灰度的比值作為結果進行分析。

5.統計學處理 采用SPSS11.5軟件在計算機上進行數據處理，計量數據用-±s表示，樣本間的比較采用方差分析，P<0.05為有顯著性差異。

結果

1.大體觀察 術后45只大鼠全部喂養成活。以皮片質地變硬、失去彈性、顏色變黑為判斷皮片壞死標準。B、C組皮片比A組皮片腫脹輕，消退早。術后3天各組皮瓣遠端色澤變暗，B、C兩組皮瓣的切緣處有較多的滲出。隨著時間延長，各組皮瓣中、遠端出現面積不等的壞死，壞死部份干涸回縮形成黑色痂殼。于14天取材時C組最遠端黑色痂殼下面已有新生的表皮生長，與遠端的受皮床完全結合。

2.皮瓣成活率 計算各組皮瓣在不同時期的成活率，發現術后3天各組成活率即有顯著性差異(P<0.05)。術后14天，C組成活率高于其它兩組(P<0.05或<0.01)，尤其是C組皮瓣成活率遠遠高于A組(P<0.01)。見表1。

3.組織學觀察 術后3天光鏡下可見：三組皮瓣下及切口邊緣均見滲出物，以中性粒細胞和淋巴細胞為主，可見少量血管內皮細胞及成纖維細胞。B、C組皮瓣下，有毛細血管芽及新生血管形成。肉芽組織增長優于A組(對照組)，血管內皮細胞，成纖維細胞數量明顯多于對照組。術后7天，三組皮瓣下均有肉芽組織生長。B、C兩組皮片下滲出物減少，肉芽組織增長優于對照組，尤其C組血管內皮細胞、成纖維細胞及新生毛細血管數量明顯多于對照組且新生毛細血管，血管腔增大，出現血管平滑肌細胞并初步形成毛細血管網。術后14天三組遠端皮瓣比較，B、C組皮片成活良好。且C組優于B組， 表皮完整，腺體增多且形態完整，膠原纖維排列有序，基底肉芽組織中成纖維細胞大部分轉化為成熟的纖維細胞，毛細血管多，毛細血管網結構正常，B組表皮較C組薄，腺體少，膠原纖維排列稍混亂，基底肉芽組織中毛細血管相對較少，對照組皮片壞死為主，無表皮層，基底肉芽組織中成纖維細胞增殖紊亂，形態不規則，毛細血管數量較少。

4.VEGFmRNA的表達 在第3天和第7天時各組間有明顯差異(P<0.05)，而在14天時組間基本無差別（P>0.05）。且于7天時C組的VEGFmRNA表達為高峰期。見表2和圖1。

討論

皮瓣移植的創面愈合大致可分為三個階段：①炎癥反應，溶解、清除壞死組織和滲出物。②結締組織細胞和血管內皮細胞游動、增殖、形成肉芽組織。③新生結締組織基質沉積和新生組織改建。三個階段相輔相成，互相聯系，每一階段均受到機體的精細調節，還有賴于多種化學介質的調控。血管內皮細胞生長因子與含激酶插入區血管內皮生長因子受體（VEGFR）結合后，在炎癥早期經絲裂素活化蛋白激酶(MAPKs)，MAPKs亞通路中細胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)激活后磷酸化，調節各種氧依賴型血管內皮生長因子(VEGF)，通過微血管形成的作用，造成氧轉運和養料運輸的改變，影響修復。在增殖階段，細胞依賴Toll樣受體能夠激活NFκB，該受體信號的轉導引起其誘導內皮細胞分裂增殖、膠原合成等過程［2］。同時上調尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑和組織型纖維蛋白溶酶原激活劑的表達，導致血管基底膜的降解；還可以增加血管通透性，使血漿蛋白外滲，形成血管生成的臨時基質。這些作用都有利于血管新生。VEGF作為內皮細胞特異的強效有絲分裂原，對缺血皮瓣一方面體現在直接作用于血管內皮細胞，促其增殖分化，促進皮瓣的毛細血管新生，提高再生血管的數量和質量，加快皮瓣與受區及皮瓣與切緣之間的血運重建，改善皮瓣遠端微循環。另一方面，可減輕皮瓣缺血再灌注損傷［3，4］。

由于血管內皮生長因子的干預，本實驗中VEGFmRNA在3天時對照組與VEGF兩組之間即開始出現明顯差異，說明外源性VEGF可明顯促進VEGFmRNA的表達，而VEGFmRN的增高，又通過一系列的信號傳導引起血管內皮細胞的增殖和分裂；進而促進了肉芽組織中毛細血管的再生；因此在術后3天其皮瓣成活率的檢測各組間就有顯著性差異，C組和B組明顯高于A組。說明在皮瓣形成早期局部由于出血，組織細胞壞死，炎性細胞反應使得血供相對減少，氧分壓降低，低氧強烈誘導 VEGFmRNA的表達，加之有外源性VEGF的存在，促進了血小板、成纖維細胞及內皮細胞通過旁分泌或自分泌方式產生該細胞因子，使VEGF與其他血管生成因子共同促進血管內皮細胞增殖、分化和血管形成。在第7天時是VEGFmRNA表達的高峰期，同時也是毛細血管和成纖維細胞的快速生長期，組織切片可見C組皮片下肉芽組織含量較對照組明顯增多，血管腔增大，出現血管平滑肌細胞并初步形成毛細血管網。術后14天時各組VEGFmRNA的表達量已無明顯差異，說明在皮瓣修復的后期，修復趨于完成，各組間VEGFmRNA的表達也趨于平衡。本實驗給予的是鼠重組VEGF165，可證明大鼠皮膚再生過程中給予外源性VEGF后可以促進內源性VEGF的旁分泌或自分泌作用，從而起到一個正反饋的作用，更加強了VEGF的局部作用，因此達到促進皮瓣再生的目的。

因為VEGF在血漿中半衰期僅30～45 min［5］。因此如何延長其作用時間，許多學者對其給藥方法和途徑進行了許多探討［6~8］。本實驗就是通過比較創緣供區和受區均注射VEGF和皮瓣下應用明膠海綿攜帶VEGF兩種給藥途徑對皮瓣成活能力的促進作用，探討一種更有效的給藥途徑。經試驗證明，無論是在VEGFmRNA的基因水平上，還是在血管和成纖維細胞的組織形態上，在大體標本上，用明膠海綿作載體局部敷用VEGF比皮下注射VEGF更有效的發揮其促進缺血皮瓣的再生作用。其機制是明膠海綿作為一種可吸收的生物材料可以延長VEGF在局部的作用時間［9］，使之更持久的作用于缺血部位，促進血管內皮細胞的分裂和增殖，加快毛細血管及毛細血管網的形成從而改變局部缺血缺氧的狀態，減輕再灌注造成的組織損傷，從而有效的促進缺血皮瓣的存活能力。另外明膠海綿在皮瓣下的存在起了一個支架作用，使炎癥早期的炎細胞更容易黏附，從而釋放出大量的細胞因子，趨化更多的炎細胞，構建起一個利于血管生成的微環境，使巨噬細胞和內皮細胞通過旁分泌和自分泌作用更多、更持久的產生內源型的VEGF，作用于缺血皮瓣的局部。并且較之目前研究較多的VEGF基因轉染的方法比較起來，前者更經濟，并且更容易獲得，臨床應用起來更方便，還避免了基因轉染缺乏安全性的問題，也可避免VEGF 的非特異的全身作用。

因此，局部應用攜帶有VEGF的明膠海綿，對于大鼠缺血皮瓣的存活能力有明顯的促進作用，其作用明顯優于單純皮下注射VEGF，并且安全無副作用，對臨床治療缺血性創面和皮瓣具有重要參考價值。

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