局部應(yīng)用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)大鼠缺血皮瓣存活能力的影響

【摘要】 目的 觀察血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)對(duì)大鼠缺血皮瓣存活能力的影響。探討其作用機(jī)制和局部更有效的給藥途徑。方法 將45只SD大鼠，隨機(jī)分為A、B、C三組，每組15只。于背部作6 cm×1.5 cm蒂位于雙側(cè)髂棘連線上的全層缺血皮瓣。A組在皮瓣下注射生理鹽水，B組皮瓣下注射VEGF生理鹽水溶液，C組皮瓣下放置含VEGF生理鹽水溶液明膠海綿，原位縫合皮瓣。術(shù)后第3，7，14 d觀察缺血皮瓣的成活面積，并進(jìn)行組織學(xué)觀察，用RTPCR方法檢測(cè)皮瓣中VEGFmRNA 的含量。結(jié)果 14天時(shí)，C組皮瓣的成活面積率明顯高于B組(P<0.05)，且B組高于A組(P<0.05)。B組VEGFmRNA表達(dá)水平高于A組但低于C組(P<0.01)。結(jié)論 VEGF的局部應(yīng)用，可以加速皮瓣內(nèi)血管再生，從而改善了大鼠缺血皮瓣遠(yuǎn)端的血供狀態(tài)，尤其采用明膠海綿攜帶VEGF皮瓣下放置的方法，更能明顯地增強(qiáng)缺血皮瓣的成活能力。

【關(guān)鍵詞】 大鼠；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子；缺血皮瓣；明膠海綿；成活率

文章編號(hào)：1003-1383(2007)02-0115-03

中圖分類(lèi)號(hào)：R 622⁺.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

皮瓣的成活在修復(fù)與重建外科領(lǐng)域是一個(gè)很關(guān)鍵的問(wèn)題。尤其是提高缺血皮瓣的成活能力更是研究的重點(diǎn)。引起皮瓣壞死的主要原因是皮瓣血流動(dòng)力學(xué)的改變，動(dòng)脈血供不足，靜脈排流不暢，或者是二種情況同時(shí)存在。而血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）通過(guò)與存在于血管內(nèi)皮上的其受體特異性結(jié)合，刺激血管形成，同時(shí)在促進(jìn)創(chuàng)傷愈合與組織修復(fù)、促進(jìn)組織再生方面起著十分重要的作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠背部缺血皮瓣模型（蒂∶長(zhǎng)度＝4∶1），主要通過(guò)RTPCR方法來(lái)觀察以不同方式給予外源性VEGF后，對(duì)皮瓣成活能力的影響。

材料和方法

1.材料 試驗(yàn)動(dòng)物：選健康SD大鼠，體重250～280 g，雌雄不限、由錦州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。VEGF購(gòu)自美國(guó)RD Systems公司。VEGFmRNA RTPCR試劑盒購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

作者簡(jiǎn)介：王繼紅(1973-)，女，遼寧省錦州市人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士。

2.造模 將45只大鼠隨機(jī)分為A、B、C三組，每組15只。腹腔內(nèi)注射氯胺酮100 mg/kg麻醉，無(wú)菌條件下，于背部作6 cm×1.5 cm［1］蒂部位于雙側(cè)髂棘連線上的全層皮瓣，皮瓣內(nèi)包括背部肉膜層，在背部肌膜的淺面進(jìn)行解剖。用無(wú)菌生理鹽水將VEGF配成10 ng/100 μl的工作液。術(shù)中皮瓣形成后，各組分別給予下述處理：①A組：于皮瓣雙側(cè)緣的2 cm、4 cm處， 及最遠(yuǎn)端中心點(diǎn)的供區(qū)及受區(qū)5對(duì)共10個(gè)位點(diǎn)，每位點(diǎn)皮下注射100 μl生理鹽水，每瓣共1 ml。②B組：同A組的10個(gè)位點(diǎn)每一位點(diǎn)注射VEGF工作液100 μl，每瓣共1 ml，含VEGF100 ng。③C組：將6 cm×1.5 cm明膠海綿先敷于創(chuàng)面上，待其濕潤(rùn)后同A組的5對(duì)位點(diǎn)將100 ng 的VEGF溶液注入到明膠海綿上。 用1號(hào)絲線間斷原位縫合皮瓣。

3.檢測(cè)指標(biāo) ①外科觀察：觀察愈合過(guò)程中皮瓣的顏色、質(zhì)地、組織水腫、壞死、炎癥情況。術(shù)后每日定時(shí)觀察并記錄。②瓣成活率檢測(cè)：于術(shù)后3天、7天和14天，用硫酸紙準(zhǔn)確描繪各組皮瓣的形態(tài)，壞死區(qū)域用墨汁涂黑，數(shù)碼照相，用圖象分析軟件PHOTO SHOP予以分析。皮瓣成活率=(原始皮瓣面積－壞死皮瓣面積)/原始皮瓣面積×100%。③組織學(xué)觀察：分別于第3 d、7 d、14 d，每組處死5只動(dòng)物。取皮瓣中遠(yuǎn)段(5 cm)處0.5 cm×1.0 cm組織塊，置40 g/L中性福爾馬林溶液中固定后，石蠟定向包埋，連續(xù)切片，片厚5 μm，行HE染色后用普通光鏡觀察。

4.VEGFmRNA的檢測(cè) 分別于術(shù)后3、7、14 d，切取三組大鼠相同部位的有活力的皮瓣組織，取材后快速放入液氮中冷凍。組織徹底凍透后放入-90℃冰箱里保存。 RTPCR的檢測(cè)步驟為：①總RNA提??；②按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明操作進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；③PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性4 min。然后，94℃ 50 s、53℃ 50 s、72℃ 50 s，共35個(gè)循環(huán)，最后延伸7 min，得到反應(yīng)產(chǎn)物。VEGF正義引物序列為：5’TGC ACC CAC GAC AGA AGG GGA3’，反義引物序列為5’TCA CCG CCT TGG CTT GTC ACA T3’，擴(kuò)增產(chǎn)物的片段為：VEGF121-360 bp，βactin正義引物序列為：5’GGT GGG TAT GGG TCA GAA3’；反義引物序列為5’TGC ATC CTG TCA GCG ATG3’，擴(kuò)增產(chǎn)物的片段為801 bp。引物由上海生工生物技術(shù)工程有限公司合成。取10 μl PCR產(chǎn)物上樣，20 g/L瓊脂糖凝膠電泳。掃描電泳照片，用凝膠成像系統(tǒng)測(cè)定PCR產(chǎn)物條帶灰度值，以VEGF與相應(yīng)內(nèi)參βactin基因條帶灰度的比值作為結(jié)果進(jìn)行分析。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5軟件在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)用-±s表示，樣本間的比較采用方差分析，P<0.05為有顯著性差異。

結(jié)果

1.大體觀察 術(shù)后45只大鼠全部喂養(yǎng)成活。以皮片質(zhì)地變硬、失去彈性、顏色變黑為判斷皮片壞死標(biāo)準(zhǔn)。B、C組皮片比A組皮片腫脹輕，消退早。術(shù)后3天各組皮瓣遠(yuǎn)端色澤變暗，B、C兩組皮瓣的切緣處有較多的滲出。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，各組皮瓣中、遠(yuǎn)端出現(xiàn)面積不等的壞死，壞死部份干涸回縮形成黑色痂殼。于14天取材時(shí)C組最遠(yuǎn)端黑色痂殼下面已有新生的表皮生長(zhǎng)，與遠(yuǎn)端的受皮床完全結(jié)合。

2.皮瓣成活率 計(jì)算各組皮瓣在不同時(shí)期的成活率，發(fā)現(xiàn)術(shù)后3天各組成活率即有顯著性差異(P<0.05)。術(shù)后14天，C組成活率高于其它兩組(P<0.05或<0.01)，尤其是C組皮瓣成活率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于A組(P<0.01)。見(jiàn)表1。

3.組織學(xué)觀察 術(shù)后3天光鏡下可見(jiàn)：三組皮瓣下及切口邊緣均見(jiàn)滲出物，以中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主，可見(jiàn)少量血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞。B、C組皮瓣下，有毛細(xì)血管芽及新生血管形成。肉芽組織增長(zhǎng)優(yōu)于A組(對(duì)照組)，血管內(nèi)皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組。術(shù)后7天，三組皮瓣下均有肉芽組織生長(zhǎng)。B、C兩組皮片下滲出物減少，肉芽組織增長(zhǎng)優(yōu)于對(duì)照組，尤其C組血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及新生毛細(xì)血管數(shù)量明顯多于對(duì)照組且新生毛細(xì)血管，血管腔增大，出現(xiàn)血管平滑肌細(xì)胞并初步形成毛細(xì)血管網(wǎng)。術(shù)后14天三組遠(yuǎn)端皮瓣比較，B、C組皮片成活良好。且C組優(yōu)于B組， 表皮完整，腺體增多且形態(tài)完整，膠原纖維排列有序，基底肉芽組織中成纖維細(xì)胞大部分轉(zhuǎn)化為成熟的纖維細(xì)胞，毛細(xì)血管多，毛細(xì)血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)正常，B組表皮較C組薄，腺體少，膠原纖維排列稍混亂，基底肉芽組織中毛細(xì)血管相對(duì)較少，對(duì)照組皮片壞死為主，無(wú)表皮層，基底肉芽組織中成纖維細(xì)胞增殖紊亂，形態(tài)不規(guī)則，毛細(xì)血管數(shù)量較少。

4.VEGFmRNA的表達(dá) 在第3天和第7天時(shí)各組間有明顯差異(P<0.05)，而在14天時(shí)組間基本無(wú)差別（P>0.05）。且于7天時(shí)C組的VEGFmRNA表達(dá)為高峰期。見(jiàn)表2和圖1。

討論

皮瓣移植的創(chuàng)面愈合大致可分為三個(gè)階段：①炎癥反應(yīng)，溶解、清除壞死組織和滲出物。②結(jié)締組織細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞游動(dòng)、增殖、形成肉芽組織。③新生結(jié)締組織基質(zhì)沉積和新生組織改建。三個(gè)階段相輔相成，互相聯(lián)系，每一階段均受到機(jī)體的精細(xì)調(diào)節(jié)，還有賴(lài)于多種化學(xué)介質(zhì)的調(diào)控。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子與含激酶插入?yún)^(qū)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR）結(jié)合后，在炎癥早期經(jīng)絲裂素活化蛋白激酶(MAPKs)，MAPKs亞通路中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)激活后磷酸化，調(diào)節(jié)各種氧依賴(lài)型血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，通過(guò)微血管形成的作用，造成氧轉(zhuǎn)運(yùn)和養(yǎng)料運(yùn)輸?shù)母淖?，影響修?fù)。在增殖階段，細(xì)胞依賴(lài)Toll樣受體能夠激活NFκB，該受體信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)引起其誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖、膠原合成等過(guò)程［2］。同時(shí)上調(diào)尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑和組織型纖維蛋白溶酶原激活劑的表達(dá)，導(dǎo)致血管基底膜的降解；還可以增加血管通透性，使血漿蛋白外滲，形成血管生成的臨時(shí)基質(zhì)。這些作用都有利于血管新生。VEGF作為內(nèi)皮細(xì)胞特異的強(qiáng)效有絲分裂原，對(duì)缺血皮瓣一方面體現(xiàn)在直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促其增殖分化，促進(jìn)皮瓣的毛細(xì)血管新生，提高再生血管的數(shù)量和質(zhì)量，加快皮瓣與受區(qū)及皮瓣與切緣之間的血運(yùn)重建，改善皮瓣遠(yuǎn)端微循環(huán)。另一方面，可減輕皮瓣缺血再灌注損傷［3，4］。

由于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的干預(yù)，本實(shí)驗(yàn)中VEGFmRNA在3天時(shí)對(duì)照組與VEGF兩組之間即開(kāi)始出現(xiàn)明顯差異，說(shuō)明外源性VEGF可明顯促進(jìn)VEGFmRNA的表達(dá)，而VEGFmRN的增高，又通過(guò)一系列的信號(hào)傳導(dǎo)引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和分裂；進(jìn)而促進(jìn)了肉芽組織中毛細(xì)血管的再生；因此在術(shù)后3天其皮瓣成活率的檢測(cè)各組間就有顯著性差異，C組和B組明顯高于A組。說(shuō)明在皮瓣形成早期局部由于出血，組織細(xì)胞壞死，炎性細(xì)胞反應(yīng)使得血供相對(duì)減少，氧分壓降低，低氧強(qiáng)烈誘導(dǎo) VEGFmRNA的表達(dá)，加之有外源性VEGF的存在，促進(jìn)了血小板、成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)旁分泌或自分泌方式產(chǎn)生該細(xì)胞因子，使VEGF與其他血管生成因子共同促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化和血管形成。在第7天時(shí)是VEGFmRNA表達(dá)的高峰期，同時(shí)也是毛細(xì)血管和成纖維細(xì)胞的快速生長(zhǎng)期，組織切片可見(jiàn)C組皮片下肉芽組織含量較對(duì)照組明顯增多，血管腔增大，出現(xiàn)血管平滑肌細(xì)胞并初步形成毛細(xì)血管網(wǎng)。術(shù)后14天時(shí)各組VEGFmRNA的表達(dá)量已無(wú)明顯差異，說(shuō)明在皮瓣修復(fù)的后期，修復(fù)趨于完成，各組間VEGFmRNA的表達(dá)也趨于平衡。本實(shí)驗(yàn)給予的是鼠重組VEGF165，可證明大鼠皮膚再生過(guò)程中給予外源性VEGF后可以促進(jìn)內(nèi)源性VEGF的旁分泌或自分泌作用，從而起到一個(gè)正反饋的作用，更加強(qiáng)了VEGF的局部作用，因此達(dá)到促進(jìn)皮瓣再生的目的。

因?yàn)閂EGF在血漿中半衰期僅30～45 min［5］。因此如何延長(zhǎng)其作用時(shí)間，許多學(xué)者對(duì)其給藥方法和途徑進(jìn)行了許多探討［6~8］。本實(shí)驗(yàn)就是通過(guò)比較創(chuàng)緣供區(qū)和受區(qū)均注射VEGF和皮瓣下應(yīng)用明膠海綿攜帶VEGF兩種給藥途徑對(duì)皮瓣成活能力的促進(jìn)作用，探討一種更有效的給藥途徑。經(jīng)試驗(yàn)證明，無(wú)論是在VEGFmRNA的基因水平上，還是在血管和成纖維細(xì)胞的組織形態(tài)上，在大體標(biāo)本上，用明膠海綿作載體局部敷用VEGF比皮下注射VEGF更有效的發(fā)揮其促進(jìn)缺血皮瓣的再生作用。其機(jī)制是明膠海綿作為一種可吸收的生物材料可以延長(zhǎng)VEGF在局部的作用時(shí)間［9］，使之更持久的作用于缺血部位，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂和增殖，加快毛細(xì)血管及毛細(xì)血管網(wǎng)的形成從而改變局部缺血缺氧的狀態(tài)，減輕再灌注造成的組織損傷，從而有效的促進(jìn)缺血皮瓣的存活能力。另外明膠海綿在皮瓣下的存在起了一個(gè)支架作用，使炎癥早期的炎細(xì)胞更容易黏附，從而釋放出大量的細(xì)胞因子，趨化更多的炎細(xì)胞，構(gòu)建起一個(gè)利于血管生成的微環(huán)境，使巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)旁分泌和自分泌作用更多、更持久的產(chǎn)生內(nèi)源型的VEGF，作用于缺血皮瓣的局部。并且較之目前研究較多的VEGF基因轉(zhuǎn)染的方法比較起來(lái)，前者更經(jīng)濟(jì)，并且更容易獲得，臨床應(yīng)用起來(lái)更方便，還避免了基因轉(zhuǎn)染缺乏安全性的問(wèn)題，也可避免VEGF 的非特異的全身作用。

因此，局部應(yīng)用攜帶有VEGF的明膠海綿，對(duì)于大鼠缺血皮瓣的存活能力有明顯的促進(jìn)作用，其作用明顯優(yōu)于單純皮下注射VEGF，并且安全無(wú)副作用，對(duì)臨床治療缺血性創(chuàng)面和皮瓣具有重要參考價(jià)值。

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