上海市小容量注射劑過濾和滅菌工藝條件的調研及如何確保產品安全性的探討

中圖分類號：R953文獻標識碼：A文章編號：1006-1533(2007)08-0355-06

2006年“齊二藥”、“欣弗”事件接連發生，注射劑產品的安全性問題引起了全社會的高度關注。作為藥品生產企業和藥品監管部門，如何找出影響注射劑安全性的一些關鍵因素，從藥品生產工藝的研發和藥品注冊審評的源頭就嚴把產品安全關，是值得我們共同思考的問題。

本文以對上海市最終滅菌的小容量注射劑滅菌和除菌工藝的調查結果為切入點，嘗試進行分析和思考，以期引起有關藥品生產企業和藥品監管部門的重視，使注射劑的安全性得到進一步的保證。

1調查結果

對最終滅菌的小容量注射劑而言，產品的無菌是一個不言而喻的、非常重要的安全性指標。通常在最終滅菌的小容量注射劑的生產過程中，可使產品達到無菌的工藝方法有除菌過濾和濕熱滅菌。然而，在對小容量注射劑生產企業的檢查過程中，筆者發現不少過濾和濕熱滅菌的工藝過程不能足以確保產品的無菌，企業對于如何確保滅菌的有效性認識不足，缺乏必要的管理措施。此外，原國家藥品監管部門批準的部分小容量注射劑產品的過濾和滅菌工藝亦有值得商榷之處。

為此，上海市食品藥品監督管理局認證審評中心GMP部曾于2003年對上海市生產濕熱滅菌小容量注射劑的14家藥品生產企業進行了專項調查。該次調查的藥品生產企業既有國有企業，也有外資企業，調查的品種既有化學藥品，也有中藥制劑，制備工藝中包括過濾和濕熱滅菌，但除菌過濾后不經濕熱滅菌的品種不在該次調查范圍內。該調查共涉及154種產品224個規格 (以被調查企業所生產的小容量注射劑品種之和計算，未扣除相同的品種數量)，旨在了解這些小容量注射劑產品的企業現行的和經國家批準的過濾和滅菌工藝條件。調查結果如表1至表6所示。

本文從調查的結果入手，重點探討如何從除菌過濾和濕熱滅菌工藝上確保小容量注射劑安全性的問題。本文中所述的安全性僅限定在與注射劑產品無菌有關的范圍之內，即因除菌過濾和濕熱滅菌條件不合理而不能確保產品的無菌，從而造成對患者身體的損害或損傷。

2調查結果的分析

2.1采用企業現行過濾和濕熱滅菌條件的小容量注射劑產品的安全性存在較大隱患

《中華人民共和國藥典》（2000年版）推薦使用的滅菌條件是：115.5 ℃暴露30 min、121.5 ℃暴露20 min或126.5 ℃暴露15 min。采用上述滅菌條件，還必須經過驗證，證明其F0值不低于8才可認為符合滅菌要求。

該次調查中，采用115.5 ℃暴露30 min以上滅菌的小容量注射劑產品有25個品種35個規格，采用121 ℃暴露20 min以上滅菌的產品有12個品種19個規格，采用126.5 ℃暴露15 min以上滅菌的產品有1個品種1個規格（參見表2）。

采用《中華人民共和國藥典》（2000年版）推薦的滅菌條件進行濕熱滅菌的小容量注射劑產品僅有38個品種55個規格，分別僅占全部被調查產品的品種和規格的24.68％和24.56％（參見表1）。

《中華人民共和國藥典》（2000年版）還要求：由于無菌保證值與污染菌耐熱性及污染量有關，在藥品生產的各個環節均應采取各種有效的手段（包括除菌過濾等措施）來降低待滅菌產品的微生物污染。

根據上述要求，針對采用《中華人民共和國藥典》（2000年版）推薦的滅菌條件進行濕熱滅菌的小容量注射劑產品，再進一步考察其除菌過濾的條件，發現其中有20個品種40個規格采用不大于0.22 μ除菌過濾器進行過濾，分別占全部被調查產品的品種和規格的16.23％和17.86％，而有13個品種15個規格未采用0.22 μ除菌過濾器進行過濾，分別占全部被調查產品的品種和規格的8.44％和6.70％（參見表3）。

這也就表明，被調查企業中僅有16.23％的小容量注射劑品種和17.86％的規格完全符合《中華人民共和國藥典》（2000年版）關于濕熱滅菌和除菌過濾條件的基本要求，如果假定企業在除濕熱滅菌和除菌過濾以外的其他方面，如配液、灌裝等，處于理想受控狀態，則這部分產品可以被認為是安全的。

其余小容量注射劑產品中有112個品種164個規格采用的是100 ℃暴露15～45 min不等的濕熱滅菌條件進行滅菌。

采用這樣的條件生產的小容量注射劑產品，假如人們對微生物的知識稍加了解就不難判斷其安全性如何了。以往的微生物學研究發現，細菌芽孢比其繁殖體具有更強的耐熱性。炭疽桿菌的繁殖體在80 ℃只能存活2-3 min，而其芽孢在濕熱120 ℃需10 min才能殺滅，肉毒桿菌芽孢在濕熱120 ℃可存活4 min，而在100 ℃需330 min才能殺滅。所以要殺滅芽胞，濕熱滅菌的溫度應大于100 ℃。

Warth研究了細菌最適和最高生長溫度與其芽孢耐熱性之間的關系，發現隨著細菌繁殖體最適生長溫度的增高，其芽孢的耐熱性就增強。適宜于較高溫度（55～67 ℃）生長的微生物，如嗜熱脂肪芽孢桿菌（B.stearothermophilus）等對濕熱的抵抗力最強。因此，嗜熱脂肪芽孢桿菌已成為濕熱滅菌過度殺滅法的生物指示劑，即通常以是否能殺滅嗜熱脂肪芽孢桿菌作為指標之一來評估滅菌工藝的效果。

100 ℃暴露15～45 min的濕熱滅菌條件，其滅菌過程的F0值不能達到8，也不能完全殺滅嗜熱脂肪芽孢桿菌生物指示劑。此外，筆者在對生產上述產品的企業進行GMP認證等各類檢查中，極少見到有企業按照《中華人民共和國藥典》（2000年版）的要求，除用生物指示劑進行濕熱滅菌工藝的驗證外，還在生產過程中連續地對微生物進行嚴格監控，證明滅菌后無菌保證值不低于設定的標準。大部分企業不知道應如何對這樣的濕熱滅菌條件進行有效的驗證，不清楚檢測滅菌前藥液中的微生物污染量的重要性和必要性，仍然采用過度殺滅法滅菌的驗證方法計算F0值或使用嗜熱脂肪芽孢桿菌生物指示劑。

因此，這部分小容量注射劑產品的無菌保證值未經有效驗證證實可達到6，即滅菌后微生物存活的概率不大于10-6，從這個意義上來說，這部分產品的安全性是值得懷疑的。

針對100 ℃暴露15～45 min濕熱滅菌的被調查產品，再進一步考察其過濾的條件，發現滅菌前采用0.22 μ除菌過濾器進行過濾的有70個品種和104個規格，分別占全部被調查產品的品種和規格的45.45％和46.43％，而未采用0.22 μ除菌過濾器進行過濾的有42個品種和60個規格，分別占全部被調查產品的品種和規格的27.27％和26.78％（參見表4）。

這表明，超過1/4的小容量注射劑產品完全不能符合《中華人民共和國藥典》（2000年版）關于除菌過濾和濕熱滅菌條件的基本要求，再加上企業對滅菌工藝驗證的不完善，因此，這部分產品嚴格地說是不安全的。

2.2國內的藥品主管部門對小容量注射劑產品的過濾和濕熱滅菌條件的控制不嚴

由于被調查企業中有不少產品的注冊申報資料遺失，無法對被調查的所有產品品種和規格做一個全面的分析，但僅從已知國家批準的濕熱滅菌工藝的128個品種和185個規格的產品來看，完全符合《中華人民共和國藥典》（2000年版）推薦的濕熱滅菌條件的產品品種和規格分別僅有21個和30個，分別僅占16.41％和16.22％；而采用100 ℃暴露15～45 min濕熱滅菌條件的產品品種和規格分別有98個和145個之多，分別占76.56％和78.38％；采用其他滅菌條件的產品品種和規格分別有5個和6個，分別占3.91％和3.24％；未作明確規定的產品品種和規格均有4個，分別占3.12％和2.16％（參見表5）。這說明有75％以上的小容量注射劑產品獲得國家批準的濕熱滅菌條件不符合《中國藥典》(2000年版)推薦的要求。

再從已知國家批準的過濾工藝的128個品種和182個規格的產品來看，使用0.22 μ除菌過濾器或等同的濾器進行過濾的品種和規格分別僅有16個和27個，分別占12.50％和14.84％；使用0.45～1.2 μ的過濾器進行過濾的產品品種和規格分別有102個和140個，分別占79.69％和76.92％；未作明確規定的產品品種和規格分別有10個和15個，分別占7.81％和8.24％（參見表6）。這說明有75％以上的小容量注射劑產品獲得國家批準的過濾工藝不符合《中國藥典》(2000年版)除菌過濾的要求。

這樣的狀況使得GMP檢查員即使發現了企業生產的小容量注射劑產品存在過濾和濕熱滅菌工藝上的缺陷，也無法制止企業的不合理行為，因為，在未獲得藥品主管部門正式批準重大工藝改變之前，企業必須嚴格按照已批準的生產工藝進行生產，不得擅自更改，這既是《中華人民共和國藥品管理法》的規定，也是中國《藥品生產質量管理規范》（1998年修訂）的要求。在此，合理性與合法性產生了嚴重的沖突和矛盾。

2.3出口的小容量注射劑產品比內銷的產品在濕熱滅菌條件上更嚴格

該次被調查的企業中有一家企業同時生產出口和內銷的小容量注射劑產品，對同一品種和規格，這家企業針對出口和內銷的產品分別設定不同的濕熱滅菌條件，出口產品的滅菌條件是121 ℃暴露20 min，而內銷產品的滅菌條件是100 ℃暴露30 min。

這種內外有別的做法提示我們：國內對于小容量注射劑產品的安全性要求已經落后于國際標準，同時，這種國際標準對于國內的企業而言是可以達到的，而不是遙不可及的。

該次調查還發現，由外國人直接管理的合資企業生產的小容量注射劑產品在濕熱滅菌和除菌過濾的條件上全部能符合《中華人民共和國藥典》（2000年版）的要求甚至更為嚴格。例如，有一家合資企業規定的濕熱滅菌條件是121℃（F0＝24）。這同時也印證了國際上對于小容量注射劑產品的安全性要求比我們國內更嚴。

3思考與討論

通過對該次專項調查結果的分析，筆者在此提出一些問題予以思考和討論：

1)為什么會出現為數不少的被調查的小容量注射劑產品的濕熱滅菌和除菌過濾工藝的無菌保證程度不足，安全性令人懷疑？究其原因，是落后的、不科學的傳統觀念在作祟。

在對藥品生產企業的檢查中，筆者時常發現部分企業人員對于消毒和滅菌的概念模糊，將兩者混為一談，因此，有必要在此進行澄清。

消毒是指清除或殺滅外環境中的病原微生物及其它有害微生物。在對“消毒”一詞含義的理解上，有兩點需要強調：消毒是針對病原微生物及其它有害微生物的，并不要求清除或殺滅所有微生物；消毒是相對的而不是絕對的，它只要求將有害微生物的數量減少到無害的程度，而并不要求把所有有害微生物全部殺滅。

滅菌是指用物理或化學的方法清除或殺滅一切活的微生物，包括致病性微生物和非致病性微生物。滅菌的概念是絕對的而不是相對的。滅菌方法通常有濕熱滅菌法、干熱滅菌法、化學滅菌法、除菌過濾法和輻射滅菌法等。

由于種種原因，要做到完全無菌是困難的。國際上，一般用無菌保證值來表示物品被滅菌后的無菌狀態，其定義為滅菌產品經滅菌后微生物殘存概率的負對數值，數值越大，無菌狀態越完全，但滅菌后微生物殘存的概率不可能為零。按國際標準規定，濕熱滅菌法的無菌保證值不得低于6，即滅菌后微生物存活的概率不得大于10^-6。

消毒和滅菌的定義清楚地說明，對于小容量注射劑產品而言，要達到無菌只能采用滅菌的方法而不是消毒的方法。在調查結果的分析中所提到的100 ℃暴露15～45 min的濕熱滅菌條件在未經驗證證實其無菌保證值可達到6之前，只能視作是消毒。但在企業甚至監督管理部門中，仍有不少人錯誤地認為它就是滅菌，長期以來國內的小容量注射劑產品的生產都是采用這種傳統方法進行“滅菌”，并覺得其安全性是沒有問題的。因此，這也就很好地解釋了為什么有不少產品在待“滅菌”前不進行除菌過濾。

當然，需要指出的是，對于不適用除菌過濾的產品應例外，可采取其他的方法。

有些人可能會認為，盡管從理論上講，100 ℃暴露15～45 min的條件不足以確保無菌，但為什么經過這種“滅菌”處理的小容量注射劑產品都能通過無菌檢驗？

其實，這些人對無菌檢驗的局限性缺乏認識。從統計學角度考察，如果采用抽樣檢驗的方法，那么，含有少量微生物污染的產品批次也有可能“通過”無菌檢驗；而且，一批產品的染菌率越低，根據無菌檢驗的結果來判定整批產品的無菌，其風險就越大。從非統計學角度考察，無菌檢驗的結果實際上還與微生物生長的條件有關。到目前為止，沒有一種培養基能使所有的細菌、酵母菌和霉菌都能生長，所以如果要保證這些微生物適宜地存活和生長，就必須使用多種培養基，但究竟用多少種培養基才合適呢？迄今沒有定論。另外，培養溫度和時間也會影響到微生物的生長。因此，僅憑無菌檢驗合格的結果就判定整批產品無菌是難以讓人完全信服的，只有對滅菌的過程進行有效的驗證并在實際生產中嚴格控制，才能確保小容量注射劑產品有足夠的無菌保證程度和安全性。

針對這些錯誤的、不科學的傳統觀念，建議藥品主管部門加強宣傳與小容量注射劑有關的國內外先進的制藥科學知識，幫助人們盡快更新觀念，跟上科技發展和時代進步的步伐。

2)正是由于監管部門中有些監管人員也有這些錯誤的觀念，致使在小容量注射劑產品的注冊審批中，藥品主管部門未對濕熱滅菌和除菌過濾等會影響產品安全性的因素提出嚴格的審評要求，設立嚴格的審評標準。

在國際上，無論是美國FDA還是歐盟都要求注射劑產品的申請人應提交滅菌工藝研究方面的資料。例如，美國FDA的《人用和獸用藥品申請時提交滅菌工藝驗證文件的指導原則》（1994年）就詳細說明了需最終濕熱滅菌的藥品申報時所需提交的滅菌程序資料，其中包括：對產品及滅菌程序的說明；滅菌程序的熱力學確認；滅菌程序的功效；環境的微生物檢測；容器－膠塞系統及包裝的完好性；細菌內毒素試驗及其方法；制訂及遵循正式書面規程的證據。

通過要求企業提交上述資料，實際上也就是要求申報企業必須對產品的濕熱滅菌事先進行深入、細致、嚴密的研究，從產品申報之初就對其安全性進行嚴格把關。

但在國內，藥品主管部門尚未針對注射劑產品的注冊申請制定出專門的詳細的申報資料要求，也就是說，申報企業未被要求提交注射劑產品滅菌程序的詳細資料?？v覽2002年10月15日頒布的《藥品注冊管理辦法》（試行）及其5個附件，未發現其中包含這種要求，而這正是對注射劑產品的安全性進行源頭監管的一個盲點。

為此，建議國家食品藥品監督管理局從完善藥品監管系統的角度出發，在對國內注射劑產品調研的基礎上，結合研究國外注射劑產品的注冊管理要求，確定專門的、詳細的注射劑產品申報資料要求，包括需企業提交滅菌程序資料等，設定嚴格的、科學的、合理的審評標準，并對已有藥品批準文號的注射劑品種重新按照新的標準進行審查，推動和促使企業盡快對注射劑產品的安全性進行充分的研究，改進小容量注射劑產品的除菌過濾和濕熱滅菌工藝。

一旦小容量注射劑產品確定了嚴格的、科學的、合理的除菌過濾和濕熱滅菌工藝，并經過藥品主管部門批準后，GMP的檢查就有了合法、合理的依據，也不會在檢查過程中陷入合理性與合法性彼此沖突和矛盾的兩難境地，GMP檢查員也就可以理直氣壯地要求企業對小容量注射劑產品的除菌過濾和濕熱滅菌過程進行有效的驗證并嚴加控制。否則，即使國家食品藥品監督管理局早在2002年底就限期生產小容量注射劑產品的企業必須通過GMP認證，即使注射劑的GMP認證劃歸國家食品藥品監督管理局負責的范圍，即使國家食品藥品監督管理局對生產注射劑的企業進行GMP認證后的跟蹤檢查，小容量注射劑的安全性問題仍然不可能從根本上得到解決，也不可能將GMP認證的工作引向深入，引向更高的層次。

3)小容量注射劑的生產企業應如何確保除菌過濾和濕熱滅菌工藝的有效性，如何嚴格控制其工藝？建議企業根據產品的特性，科學設計除菌過濾和濕熱滅菌的工藝，針對不同的濕熱滅菌方式，制定相應的、必要的控制措施。

濕熱滅菌按照驗證方式的不同可分為過度殺滅法、生物負載／生物指示劑（聯合使用）滅菌法和生物負載滅菌法。

對于熱穩定性強的小容量注射劑產品，建議采用過度殺滅濕熱滅菌法。該法不管待滅菌的物品中微生物污染的數量和耐熱性如何，都力求達到無菌保證值為6，通?？捎檬笵_121.1℃至少為1 min的微生物數量的對數值最少降低12來證實。只有最耐熱的微生物其D_121.1℃才會大于0.5～1.0min，耐熱性較差的微生物理所當然會被殺滅從而達到更高的無菌保證值。挑戰用的微生物的D值和最少降低12個對數值的最低目標是用來計算滅菌時間的，用于計算被滅菌物品的F0值。過度殺滅法不要求對待滅菌物品上的微生物數量進行日常監控，只要定期進行監控即可。但是，在驗證期間應全面檢測是否出現耐熱細菌芽孢，并與挑戰用的微生物比較其耐熱性。

例如，歐洲藥典中要求的過度殺滅的標準程序是121.1℃暴露15 min，采用這種滅菌程序可以不必使用生物指示劑。但即便是采用過度殺滅法，對小容量注射劑的藥液在灌裝前進行微生物污染水平的控制仍然是WHO要求采用的措施之一，而除菌過濾可以有效地達到降低微生物污染水平的目的。

對于只有中等強度熱穩定性的小容量注射劑產品，可用生物負載／生物指示劑（聯合使用）滅菌法。該法在無菌保證值達到6時，允許部分生物指示劑未被殺滅，但所使用的生物指示劑的D值應大于待滅菌產品中所含有的普通微生物的D值。在對熱穩定性較差的產品進行驗證時，使用有耐熱性的生物指示劑通常是有必要的，可通過允許生物指示劑的部分存活從而避免被滅菌物品過度受熱。這種方法提供了可以與生物負載比較的無菌保證值，盡管仍需使用生物指示劑，但所做的驗證比生物負載滅菌法更簡單。

例如，如果滅菌前的生物負載不大于100 CFU／個容器，D_121.1℃為0.2 min，采用使有耐熱性的生物指示劑（D_121.1℃為0.5 min）芽孢數量降低4個對數值的濕熱滅菌程序可使無菌保證值不小于6。

對于熱穩定性差的小容量注射劑產品，可采用生物負載滅菌法。該方法應足以殺滅待滅菌物品上的微生物，又不致于造成產品的降解。生物負載滅菌法是在對產品中微生物的數量和耐熱性進行詳細研究的基礎上建立的。一般說來，只有生成芽孢的細菌需要測定D值，對產品在80～100 ℃進行熱休克處理10～15 min可以剔除不耐熱的微生物。一旦已知生物負載的耐熱性后，就可以確定滅菌程序，使微生物存活的可能性不大于10^-6。對生物負載滅菌法而言，分離出來的最耐熱的微生物應作為生物指示劑，且通常在滅菌前應對每批產品的生物負載進行檢測和評估。由于生物負載／生物指示劑（聯合使用）滅菌法可達到同樣的無菌保證程度而不需要企業自制挑戰用的生物指示劑，所以生物負載滅菌法未在制藥企業中廣泛使用。

除過度殺滅法以外，使用生物負載／生物指示劑（聯合使用）滅菌法或生物負載滅菌法都必須制定生物負載監控的計劃，并從下列幾個方面予以考慮：環境的季節變化、從配液到滅菌的時限（應包括預定的最大時限）、樣品的均一性、產品批量的變化，還應測定每個容器或每升產品內微生物的數量和種類。根據這些數據，可建立暫時的標準作為內控標準，直至收集到其它數據后再制定最終的警戒限和行動限。生物負載監控的計劃還應有明確的取樣頻率、取樣數量、取樣方法、檢驗方法和可接受的標準。

WHO對采用過度殺滅法滅菌的小容量注射劑藥液仍然建議在灌裝前進行微生物污染水平的控制，因此用生物負載／生物指示劑（聯合使用）滅菌法或生物負載滅菌法生產的小容量注射劑，其藥液在灌裝前更應進行微生物污染水平的控制（如采用除菌過濾），這對于保證產品的安全性而言，其重要性更是不言自明了。

4結語

長期以來，人們都熟悉這樣的說法：要是生了病，可以吃藥的不要打針，可以打針的不要輸液。這種說法雖是用藥的一個基本法則，但從另一個側面反映了人們對注射劑產品的安全性無法徹底放心的心態。

隨著滅菌科學技術的發展和國內藥品監管的要求不斷提高，藥品主管部門應繼續完善藥品監管體系，消滅監管的盲點，進一步加強對注射劑產品安全性的監管，特別應重視從注射劑產品的注冊申報之初就嚴格把關。只要各藥品監管的職能部門齊心協力，再加上生產企業的共同努力，就可以提升注射劑產品的安全保障度，從而進一步提高用藥的安全性。

(收稿日期：2007-07-04)