虎杖中黃酮類成分的提取分離及性質研究

摘 要:α-葡萄糖苷酶抑制劑是一種治療II型糖尿病的新型口服降糖藥。虎杖的莖和根，中醫用于活血散瘀，清熱利濕等。本實驗從中藥虎杖中獲得了α-葡萄糖苷酶抑制劑:黃酮類物質。探討了虎杖黃酮的分離提取工藝及其化學、酶學性質。酶學實驗表明虎杖黃酮對α-葡萄糖苷酶有較強的抑制作用。通過動物實驗，即正常小鼠的餐后血糖實驗和虎杖提取物連續給藥對四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖含量的影響，表明該虎杖提取物有較好的體內降血糖作用。

關鍵詞：虎杖;黃酮;α-葡萄糖苷酶;抑制劑;體內活性

中圖分類號：R284.2文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2007）11-037-06

1 概述

1.1 虎杖

虎杖為蓼科蓼屬草本植物。虎杖的根及莖，為我國傳統中藥，可祛風利濕，散瘀定痛，止咳化痰。迄今已從虎杖中分離得到的化學成分主要有蒽醌及蒽醌甙；芪類化合物；酚性成分；黃酮類化合物。現代藥理研究表明虎杖具有降血糖作用，對動物實驗性糖尿病，能降低其糖尿病的發生率和死亡率。

1.2 α-葡萄糖苷酶抑制劑與糖尿病

α-葡萄糖苷酶抑制劑通過抑制存在于小腸粘膜微絨毛膜表面的麥芽糖酶和蔗糖酶等水解酶，能夠延緩或減少腸道對碳水化合物消化與吸收，具有降低餐后血糖的作用。α-葡萄糖苷酶抑制劑是一種安全有效的新型口服降糖藥。

1.3 本課題的主要研究工作

本課題的研究內容是從原藥材虎杖中提取對α-糖苷酶有抑制活性的有效部位——虎杖黃酮，考查其物理、化學性質、酶學性質及溫度、pH穩定性質。

2 試劑與儀器

2.1 材料

中藥虎杖；D101型大孔吸附樹脂。

2.2 試劑

2.2.1 α-葡萄糖苷酶酶活力測定試劑配制

磷酸鉀緩沖液；α-D-葡萄糖苷酶；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）；還原型谷胱甘肽；Na2CO3終止液；對硝基酚（PNP）。

2.2.2 己糖激酶酶活力測定試劑配制

Tris-HCl緩沖液；葡萄糖；輔酶Ⅱ溶液；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；MgCl2溶液；己糖激酶酶溶液；ATP溶液；還原型輔酶Ⅱ標準液。

2.2.3 提取及成分分析試劑

三氯化鐵試劑；茚三酮試劑；雙縮脲試劑；香草醛-鹽酸試劑；Frhde試劑；α-萘酚試劑；磷鉬酸試劑。

2.3 儀器與設備

電熱恒溫水浴鍋；752紫外光柵分光光度計；低速離心機；熱恒溫鼓風干燥箱；旋轉蒸發器；凍干機；-86℃冰箱；電子分析天平等。

3 實驗方法

3.1 虎杖中有效成分的提取分離

3.1.1 虎杖中黃酮類成分的提取

乙醇浸提：200g虎杖，用60%乙醇浸提，過濾，濾液用60%的無水乙醇浸提，過濾，反復共3次，得初提液。減壓濃縮，回收乙醇，得到浸膏。

水醇法除葉綠素：乙醇濃縮液加蒸餾水離心，沉淀即為葉綠素，棄去。

石油醚脫脂：浸膏用蒸餾水洗下，石油醚脫脂，回收石油醚。脂類物質無抑制劑活性，水相有強的抑制劑活性。

乙醇洗脫：用40%乙醇洗脫至無色，再用70%乙醇洗脫至無色，最后用無水乙醇洗脫至流出液呈無色。

3.1.2 大孔吸附樹脂處理

預處理:取200mlD101大孔吸附樹脂，用無水乙醇浸泡1天。

裝柱：采取濕法裝柱，加入無水乙醇連續沖洗至洗出液與蒸餾水1∶2混合后不產生混濁為止，改用大量蒸餾水沖洗至無醇味，用pH=9的NaOH溶液洗柱。 

洗脫：樣品溶于少量蒸餾水，加至柱上端。先用水洗脫，至洗出液無色；再分別用40%乙醇、70%乙醇溶液洗脫，最后用無水乙醇溶液洗脫。40%、70%和100%乙醇洗脫液分別減壓濃縮。

3.2 提取物成分分析

3.2.1 檢測氨基酸

樣品中滴加數滴茚三酮溶液，加熱至沸騰，冷卻后如顯藍紫色表明含氨基酸。

3.2.2 檢測蛋白質

樣品中加入適量雙縮脲試劑，冷卻后如果顯紫紅色表明可能含蛋白質或肽類。

3.2.3 檢測酚類

樣品中加入三氯化鐵試劑，如顯藍綠色表明可能含有酚類。將樣品點樣于濾紙上，噴灑香草醛-鹽酸試劑，具有間苯三酚或間苯二酚結構的物質顯紅色。

3.2.4 檢測糖類

樣品中加入α-萘酚試劑，再滴加少量濃硫酸。如果樣品液于濃硫酸接觸面產生紫紅色環，即表明可能存在糖類、甙類或其它還原性物質。

3.2.5 檢測皂甙

樣品的乙醇提取液蒸去乙醇后的殘渣溶解或懸浮于醋酐中，滴加1滴濃硫酸，如果顯示紫紅色并且溶液上層逐漸變綠，表明含甾體三萜類或皂甙。

樣品中加入Frhde試劑數滴，當皂甙遇此試劑時初呈橘紅色，漸變紫黑色。

3.2.6 檢測黃酮類

取乙醇提取液，加入鎂粉，再加入濃鹽酸，如果產生的泡沫處顯桃紅色則可能含有黃酮類物質。

三氯化鋁反應：將樣品溶于甲醇中，加三氯化鋁甲醇溶液，3-羥基黃酮、5-羥基黃酮與Al3+產生螯合物而呈鮮黃色。

3.2.7 檢測生物堿類

取提取液，加入磷鉬酸溶液，若出現白色或黃褐色無定形沉淀，再加氨水沉淀轉變為藍色，則可能含有生物堿類。

3.2.8 檢測蒽醌類

樣品溶于無水乙醇，點樣于濾紙上，噴KOH溶液，在紫外下顯黃、橙、紫色熒光，則表明含有蒽醌類物質。

3.2.9 檢測鞣質

取明膠于試管，加入樣品水溶液，若產生沉淀，則表明含有鞣質。

3.2.10 發泡性實驗

取提取物，加水煮沸后濾出水液，振搖產生持久性泡沫，則皂甙檢驗為陽性。

3.3 有效成分的酶學性質

3.3.1 抑制劑的溶解性

在抑制劑粉末中分別加入蒸餾水、95%乙醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、環己烷溶液，觀察其溶解情況。

3.3.2 有效成分對pH的穩定性試驗

先將虎杖提取物用pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的緩沖液配成濃度為0.5mg/ml的溶液，取不同pH的提取物溶液測定其對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，取不同pH的提取物溶液測定其對己糖激酶的激活活性。

3.3.3 抑制劑對溫度的穩定性試驗

先將的抑制劑溶液分別于20、40、60、80、100℃保溫，迅速冷卻至室溫，然后各取20μl測定對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

3.3.4 虎杖提取物與α-葡萄糖苷酶和己糖激酶作用時間對酶活的影響

在試管中依次加入磷酸鉀緩沖液、還原型谷胱甘肽、α-葡萄糖苷酶和虎杖提取物溶液，37℃分別保溫0.5、1、2、4、6min，加PNPG反應后測定抑制活性。

在Tris-HCl緩沖液溶液中，依次加入葡萄糖溶液，輔酶Ⅱ，G-6-PDH，氯化鎂溶液，己糖激酶和虎杖提取液，在37℃下保溫0.5、1、2、4、10min，加ATP溶液為反應開始，在340nm處掃描6min內吸光度的變化。

3.3.5 虎杖提取物不同加量對酶活性的影響

在各試管中加入磷酸緩沖液，還原型谷光甘肽，α-葡萄糖苷酶，然后分別加入0、5、10、15、20、25、30、35、40μl濃度為0.25mg/ml的虎杖提取物溶液，再用磷酸緩沖液補充測酶活體系為1ml，測定對α-葡萄糖苷酶抑制活性。

在各試管中依次加入Tris-HCl緩沖液溶液，葡萄糖溶液，輔酶Ⅱ，G-6-PDH，10μl氯化鎂溶液，己糖激酶，然后分別加入0、20、40、60、80、100、200μl桑葉提取物溶液，再用Tris-HCl緩沖液補充體系總體積為0.99ml，在37℃下保溫，加ATP溶液為反應開始，在340nm處掃描6min內吸光度的變化。

3.4 抑制劑溶液吸收峰分布情況

將抑制劑粉末配成0.2mg/ml水溶液，用紫外—可見分光光度計掃描200～800nm，觀察其吸收峰出峰情況。

3.5 總黃酮含量測定方法

3.5.1 標準曲線的繪制

稱取蕓香葉苷對照品0.1730g，加甲醇溶解并稀釋。吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml分別至25ml容量瓶中，各加水至6.0ml，加1.0ml5%亞硝酸鈉，放置6min，加10%硝酸鋁1ml，放置6min，加氫氧化

鈉10ml，放置15min，在500nm處測定吸收度，以吸收度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。蕓香葉苷：1.73mg/ml甲醇溶液。

3.5.2 樣品含量測定方法

稱取樣品3.6mg，溶于1.8ml甲醇中，配成2mg/ml溶液：取0.05ml于比色皿中，加水0.55ml，加入5％亞硝酸鈉0.1ml，放置6min，滴加10％硝酸鋁0.1ml后，放置6min，加入lmo1／L氫氧化鈉1ml，加水0.7ml（使總體積為2.5ml），放置15min，500nm處測定吸光度。在標準曲線中查找濃度，計算即可得出樣品的黃酮含量。

3.6 虎杖提取物對小鼠的降血糖作用

3.6.1 糖尿病小鼠模型的建立

四氧嘧啶糖尿病小鼠：取65只正常小鼠，禁食16h，腹腔注射四氧嘧啶后，喂養72h，禁食4h后測血糖濃度，選取血糖值在11.0mmol/L以上者。

3.6.2 球后靜脈叢取血

手持毛細管從小鼠內眥部插入，到達球后靜脈叢，血液即從管內流入收集管。

3.6.3 分離血漿

取血后立即進行離心，10000r/min離心20min，上層為無色透明的血漿。

3.6.4 測定血糖

測定原理：采用葡萄糖氧化酶（GOD）法；過氧化物酶（POD）。

4 實驗結果

4.1 抑制劑的性質測定

4.1.1 抑制劑的一般性質

分離得到的抑制劑為橙黃色粉末狀固體，可溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿等極性溶劑，難溶或不溶于環己烷等非極性溶劑；遇堿后顏色迅速由黃色轉變為深紅色，遇酸則顏色變淺；在強酸作用下，該抑制劑會發生聚合，產生紅棕色沉淀。由于黃酮類分子中結合有糖分子，羥基數多，能表現出強親水性。實驗結果說明該樣品具有較強的極性，含有親水性基團。

4.2 提取物成分鑒定

從表4可看出，經過成分化學分析，樣品中不含有氨基酸，以及還原糖類物質；可以初步推測其主要成分為黃酮類物質，同時含有少量蛋白質和蒽醌類物質。

4.3 抑制劑的吸收峰分布：

抑制劑樣品的水溶液在200～800nm波長范圍內掃描吸收峰如圖1～3所示。

樣品的掃描圖譜在220～280nm左右有一個強烈的吸收峰。掃描結果提示在獲得的抑制劑分子中含有苯環或者其它具有紫外吸收的基團。此外，成份分析試驗的結果也表明抑制劑分子中含有大量的酚羥基。

4.4 虎杖提取物的酶學性質

4.4.1 不同濃度乙醇的洗脫物對α-葡萄糖苷酶活性的影響

如圖4所示，40%乙醇洗脫物對α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，其次是70%乙醇洗脫物，最后是100%乙醇洗脫物。由此可推斷，該虎杖黃酮提取物中對α-葡萄糖苷酶有抑制活性的物質極性較弱，初步推測可能是黃酮苷元。

由于40%的乙醇洗脫物對α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，所以接下來重點對40%的乙醇洗脫物進行酶學實驗。

4.4.2 虎杖提取物對pH的穩定性

抑制劑樣品對pH的穩定性實驗結果如圖5所示。由圖可見，該樣品在pH4～11的范圍內抑制率維持在80%以上，只有當pH>11時抑制活力才有顯著的下降。而在pH=3時，由于抑制劑已經有部分聚合，導致抑制活力比較低。

4.4.3 虎杖提取物對溫度的穩定性

樣品對溫度的穩定性試驗實驗結果如圖6所示。由圖可見，在20～100℃范圍內，抑制劑對α-葡萄糖苷酶的抑制活性不隨溫度的變化而發生明顯的改變，說明該抑制劑有良好的熱穩定性。

4.4.5 虎杖提取物與酶作用的速率

該提取物與α-D-葡萄糖苷酶作用非常迅速，如圖7所示，該提取物與酶反應2分鐘時，作用率達94.54％，4分鐘時已基本作用完全。

4.4.5 虎杖提取物的量對酶的活性的影響

40%乙醇洗脫物對α-D-葡萄糖苷酶具抑制作用。如圖8所示，當洗脫物樣品（0.25mg/ml）量為25μl時，抑制率可達92.4%，表明該抑制劑成分對α-葡萄糖苷酶具有較強的抑制活性。

4.5 樣品中黃酮總含量測定

4.5.1 蕓香葉苷標準曲線

4.5.2 樣品中總黃酮含量

在500nm處測得不同濃度乙醇洗脫物的吸光度如下表所示，將其代入回歸方程后經計算可得出抑制劑中總黃酮的含量。

由表5可得，在乙醇梯度洗脫時，隨著乙醇濃度的增高，洗脫物中總黃酮的含量逐漸降低。

4.6 動物實驗結果

4.6.1 餐后血糖

選取18只小白鼠，先禁食10h，分成3組（給藥組，拜糖蘋組，生理鹽水對照組），先空腹取血，再灌胃，灌胃后10min左右灌淀粉，在0.5h，1h，2h分別取血。灌藥量：拜糖蘋100mg/kg，淀粉5g/kg，虎杖提取物300mg/kg。

根據圖10，說明該虎杖提取物對正常小鼠的餐后血糖的升高有較好的抑制作用，但與拜糖蘋相比，該虎杖提取物對餐后血糖的抑制作用稍弱。

4.6.2 四氧嘧啶糖尿病小鼠模型的建立

取正常小鼠65只編號，禁食16h，腹腔注射四氧嘧啶，正常飼養72h后，禁食4h，測定其血漿血糖濃度。經過分析計算，選取其中的24只小鼠（血糖值在11.0mmol/L以上），并分組如下（見表6），各組小鼠之間的平均血糖值之差≤3mmol/L。

4.6.3 虎杖提取物連續給藥對四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖含量的影響

四氧嘧啶糖尿病小鼠24只，分為3組，分別灌胃虎杖提取物（200mg/kg），格華止（100mg/kg），生理鹽水，連續8天。末次灌胃后禁食4h，斷尾取血測定血漿血糖濃度，結果如圖11。

根據圖11，表明該虎杖提取物連續給藥對四氧嘧啶糖尿病小鼠有降血糖作用，其作用大小與降糖藥格華止十分接近。

綜合正常小鼠的餐后血糖實驗和四氧嘧啶糖尿病小鼠的連續給藥實驗，兩個實驗的結果都表明，該虎杖提取物有較好的體內降血糖作用。

5 討論

本文從虎杖中提取了黃酮類物質，并研究虎杖黃酮提取物的物理、化學以及酶學性質，尤其是對α-糖苷酶的抑制作用情況。

在動物實驗中，做了正常小鼠的餐后血糖實驗和四氧嘧啶糖尿病小鼠的連續給藥實驗。兩個實驗的結果都表明，該虎杖提取物有較好的體內降血糖作用。

從中藥虎杖中分離得到的活性較高的α-葡萄糖苷酶抑制劑，是一種作用迅速，與酶的親和力較好的抑制劑，并且它對于溫度和pH有較大的適應范圍，因此可作為糖苷酶抑制劑應用于降血糖和治療糖尿病，開發研制新一代安全有效的抗糖尿病中藥，為患者帶來福音，發揮出中藥虎杖所蘊含的巨大的商業價值，更好地弘揚祖國醫學。

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