兩種常用麥冬栽培品種的ＩＳＳＲ分子鑒定

摘 要:目的：為了佐證傳統(tǒng)外觀分類法及染色體、同工酶等生物技術在麥冬品種分類上的準確性和可靠性，利用ISSR分子標記對這兩個主要的麥冬栽培品種進行分類鑒定，為以后麥冬大田生產(chǎn)選種提供技術支持和理論指導。方法：采用ISSR分子標記對直立型麥冬和匍匐型麥冬進行DNA序列分析。結果：不同品種麥冬在條帶上表現(xiàn)有一定差異性，兩品種間的相關系數(shù)為0.8182。結論：兩種麥冬同源不同種，與以往外觀分類以及利用染色體、同工酶技術進行分類鑒別所得結果基本一致，說明外觀分類法及染色體、同工酶分類是科學的。

關鍵詞：麥冬栽培品種；ISSR；分子鑒定

中圖分類號：R282.5文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2007）11-048-03

麥冬［Ophiopogon japonicus (L.F)Ker-Gawl］為百合科沿階草屬多年生草本植物，以塊根作藥用，能養(yǎng)陰生津、潤肺止咳。主產(chǎn)于四川綿陽、三臺等地，故稱之為“川麥冬”，為常用中藥材。川麥冬是一種較為復雜的混合群體，生產(chǎn)上一般選用直立型麥冬和匍匐型麥冬為常用栽培品種。

ISSR（Inter-simple sequence repeat簡單重復序列間擴增）技術已廣泛應用于各種物種親緣關系鑒定及遺傳多樣性鑒別，不但易于操作，而且模板用量少、重復性好^[1]。為了佐證傳統(tǒng)外觀分類法以及利用染色體^[2]、同工酶技術^[3]對麥冬品種進行鑒定分類的準確性和可靠性，本研究首次利用ISSR分子標記對這兩個主要的麥冬栽培品種進行分類鑒定，為以后麥冬大田生產(chǎn)選種提供了技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

取直立型麥冬和匍匐型麥冬2~4片幼嫩的新葉作為提取DNA的實驗材料，于2007年3月下旬采于四川三臺縣麥冬GAP生產(chǎn)示范基地。直立型麥冬具有分蘗少、葉片較長、塊根數(shù)量少、顆粒大的特點；而匍匐型麥冬分蘗多、葉片寬、塊根數(shù)量多、顆粒小。

1.2 主要儀器及試劑

實驗的主要儀器有：epperdorf PCR儀 、DYY-8B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳系統(tǒng)、FR-980生物電泳圖像分析系統(tǒng)。試劑為Lambda DNA (HindⅢ+Ecok I Markers )Buffer、dNTPs、Tap酶等。

1.3 實驗方法及步驟

1.3.1 麥冬葉片DNA的提取與純化 取5~10g幼嫩葉片于研缽中加液態(tài)氮迅速研磨至細小粉末，取5g左右于離心管中，加入蛋白酶30mg和2%裂解液（CTAB溶液）適量，放入65℃恒溫水浴鍋中裂解30min以上，取出，加1mol/L KAC溶液100μL，冰浴20min后加入等體積的氯仿/乙戊醇溶液，離心后吸取上清液于10mL的離心管中，加入等體積的冰氯仿/乙丙醇溶液輕柔顛倒，在離心機中離心15min后去上清液，并將樣品轉移到1.5mL離心管中，加一定量冰乙醇洗滌后，用移液器吸干上清液，置于低溫干燥箱中干燥。若得到的DNA不純，可再次用乙醇反復清洗干燥，直到DNA純凈為止。最后加重蒸水溶解，放置于-20℃冰箱中待用^[5]。

1.3.2 ISSR反應體系的建立 用未經(jīng)擴增的DNA進行電泳實驗，得到兩條清晰連貫的長帶，以Daniel Potter建立的20μL反應體系^[4]為此實驗體系的篩選基礎。

通過正交實驗，得出多組電泳圖像，圖像條帶表明，在其它條件不變的情況下，當加入的成分量為Mg²⁺1.6μL、Taq酶0.2μL、Primer 1.2μL、Temple 2μL、dNTPs 1.2μL、Buffer 2μL時條帶最為清晰。篩選出的麥冬反應體系參見表1。

當引物為827時，擴增出的條帶如圖3、4所示。圖像的清晰度和擴增差異，表明該體系適合于麥冬品種的分子標記測定。

1.3.3 PCR擴增和電泳 本實驗采用總體配液法以減少人為誤差，使實驗結果更具可比性和可重復性。反應程序為：94℃預變性5min，94℃變性1min，50℃退火1min，72℃鏈延長1.5min，35次循環(huán)后，再充分延伸10min。將擴增后的樣品點樣于瓊脂糖凝膠上加顯色劑進行電泳，并將成像條帶拍攝、儲存，供分析時使用。

1.3.4 引物篩選 通過對多種引物進行多次重復篩選，篩選出數(shù)種效果較好的引物，它們分別是808、807、834、835、836、840、842、844、845等，部分引物相應序列參見表2，篩選出來的引物條帶見圖5、圖6。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 為了解兩種麥冬品種間的親緣關系，對電泳條帶進行了具體的位點統(tǒng)計和多態(tài)性分析。ISSR為顯性標記，同一引物擴增產(chǎn)物的電泳產(chǎn)生的遷移率一致的條帶被視為具有同源性，電泳圖譜中的每一個條帶作為一個分子標記，并代表一個引物的結合位點^[4]。將有條帶的記為“1”，沒有的記為“0”。統(tǒng)計得出位點136個，平均位點9.07，多態(tài)位點27個，占19.85%。每個引物多態(tài)位點平均為1.8。

2 結果

將統(tǒng)計位點通過NTSYSpc(w)軟件進行分析，兩個品種間的相關系數(shù)為0.8182。從一些條帶圖像也可以直觀的看出，同種引物的不同模板，擴增條帶幾乎完全相同，說明了直立型麥冬和匍匐型麥冬有很近的親緣關系，具有同源性^[7]。而根據(jù)823、873、844、848、807等引物圖像的條帶顯現(xiàn)，同一引物中，一個品種能得到清晰的條帶，而另一個品種沒有或存在差異，從而說明了兩種麥冬的DNA序列是有差異的，即遺傳物質是不同的。

3 討論

本次實驗通過對兩種常用麥冬栽培品種進行ISSR分子鑒定，找出了兩種麥冬品種外觀差異如此之大的主要原因，是麥冬品種遺傳基因中的某個或幾個基因片段不同，得出它們是由同一品種經(jīng)長期進化形成的兩個不同品種，即它們是同源不同種的結論，與以往外觀分類及染色體、同工酶分類所得結果基本一致，說明外觀分類法及利用染色體、同工酶技術進行分類鑒別是科學的。傳統(tǒng)的外觀分類法判斷植物種類直觀、簡單、迅速，但要求研究者應具有豐富的判斷經(jīng)驗和分類知識；染色體、同工酶技術在測定的過程中也受到很多不定因素的干擾，其結果重復性相對較低^[8]，而ISSR分子技術的重復性和準確性都較高，可以為以后麥冬及其它品種的分類鑒定提供技術參考。

參考文獻：

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ISSR Molecular Identification of Two Usual

Radix Ophiopogonis Planting Varieties

Ye Gingying1， Yang Meiquan1， Liang Guolu2， Guo Qigao2， He Bo2

(1.Chongqing medical planter research institute， Chongqing Nanchuan 408435，China;

2. Southwest university， Chongqing Beibei 400700，China)

Abstract:Objective:We use the ISSR molecular mark technology to confirm the accuracy and the reliability of appearance categories and isozymeschromosome categories ，the same in order to provide technical support and theory guide for the selection of Radix Ophiopogonis seeds in production . Method:We use the ISSR molecular mark technology to analye the DNA sequence of erective Radix Ophiopogonis and creeping Radix Ophiopogonis. Results:The different varieties have the different electrophoresis. Their similarity is 0.8182. Conclusions:From the experiment ，we can conclud that they are the different varieties ，but they have the same ancestor .The conclusion is the same with the appearance categories or using the isozymes and chromosome technology to classifycategories .So appearance categoriesisozymes and thechromosome categories are scientific.

Key words: Radix ophiopogonis; Inter-simple sequence repeat； Molecular identifi cation